Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם.
Abstract
להשתקת גנים TRUE (כינה לאחר L TR Nase Z - u tilizing להשתקת גנים דואר fficacious) הוא אחד של הגן מכוונת RNA ההשתקה טכנולוגיות, אשר מנצל RNA מדריך קטן מלאכותית (sgRNA) להנחות endoribonuclease עיבוד 'tRNA 3, tRNase Z L , להכיר RNA היעד. sgRNAs יכול להיות נלקח על ידי תאים ללא כל ריאגנטים transfection ויכול downregulate רמות RNA היעד שלהם ו / או לגרום אפופטוזיס בתאי סרטן אנושיים. יש לנו הוקרנתי ספריית sgRNA המכילה 156 sgRNAs heptamer מהסוג להשפעה על כדאיות של תאי מיאלומה ולוקמיה אדם, ומצאתי כי 20 מהם יכולים לגרום ביעילות אפופטוזיס לפחות אחד שורות התאים הסרטניים. כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם. הפרוטוקול כולל כיצד לבנות את הספרייה sgRNA, איך להעריך את ההשפעה של כל sgRNA על כדאיות התא, וכיצד פוrther להעריך את sgRNAs יעיל על ידי cytometry הזרימה. כ -2,000 כניסות תהיינה צפויות להיות מושגת על ידי הקרנת ספריית sgRNA בהיקף מלא מורכבת 16,384 heptamers.
Introduction
להשתקת גנים TRUE (כינה לאחר L TR Nase Z - u tilizing להשתקת גנים דואר fficacious) היא אחת הטכנולוגיות להשתקת גנים מכוונת RNA 1. טכנולוגיה זו פותחה על בסיס מאפיינים של tRNase Z L (או 3 'tRNase), tRNA 3' endoribonuclease עיבוד: זה יכול לבקע כל RNA יעד בכל אתר צפוי בניהולו של RNA מדריך הקטן מלאכותי (sgRNA) על ידי הכרה טרום tRNA דמוי או מבנה מיקרו-טרום tRNA דמוי שנוצר בין RNA היעד ואת sgRNA 2 - 9. sgRNA, שהיא בדרך כלל 7-31 NT אורך, הוא מסווג לארבע קבוצות, 5'-חצי-tRNA, RNA heptamer, RNA ליניארי 14-NT, ו- RNA וו.
אנחנו הוכחנו את היעילות של להשתקת גנים נכון על ידי החדרת sgRNAs המלאכותית מעוצב השונה לתוך תאי חי 10 - 15. גם הראינו כי sgRNAs יכול להיות נלקח על ידי Wi תאיםthout כל ריאגנטים transfection ויכול downregulate רמות RNA היעד שלהם ו / או לגרום אפופטוזיס בתאי סרטן אנושי 16 - 18. להשתקת גנים TRUE מופיע לעבוד על תאיים ומערכת רשת גנטית אינטר באמצעות tRNase Z L ו- sgRNAs טבעי 19 - 21.
בנינו ספריית sgRNA המכילה 156 sgRNAs heptamer מהסוג לחפש sgRNAs heptamer מהסוג טיפולי פוטנציאל סרטני דם 22. יש לנו הוקרן אותה ההשפעה על יכולת הקיום של תאים מיאלומה ולוקמיה אדם, ומצאו כי 20 מהם יכול לגרום ביעילות אפופטוזיס לפחות אחד שורות תאים סרטניים. ו -4 מהם הוכחו להפחית את שיעורי צמיחת גידולים בניסויים xenograft העכבר.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם. הפרוטוקול כולל איךכדי לבנות את הספרייה sgRNA, איך להעריך את ההשפעה של כל sgRNA על כדאיות התא, וכיצד להעריך עוד יותר את sgRNAs יעיל על ידי cytometry הזרימה. ניתוח עבור RNAs היעד הסלולרי של sgRNA והערכת sgRNAs יעיל במודלים xenograft העכבר יכול להתבצע על פי שיטות קונבנציונליות 17,22, אם כי אלה אינם נכללים בפרוטוקול זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית ספריית sgRNA Heptamer מסוג
- בחר תת קבוצה של הרצפים 7-NT 16,384 (4 7) אלא אם הספרייה לעזרתן היא להיבנות.
הערה: הרצפים יכולים להיות אקראיים ו / או שנועד למקד RNAs הסלולר הספציפי. לעניין האחרון זה, למצוא מבני סיכת ראש דומה T-היד של tRNA בתוך היעד RNA בעזרת תוכנת מחשב מתאימה ו / או ראייה, ובחרו רצפי משלים הרצפים-NT 7 מייד במורד זרם של מבני סיכת ראש 4,10, 17,18. - לסנתז כל אחד heptamers נבחר בתור מלא 2'- O -methylated, 5'- ו- RNA 3'-פוספורילציה עם סינתיסייזר DNA / RNA. השתמש בשיטה phosphoramidite על זכוכית נקבובית מבוקר (CPG) תמיכה, נוטש את הקבוצה להגנה 5'-מסוף 4,4'-dimethoxytrityl (DMT) על במחזור האחרון (תוספת של פוספט '5) של סינתזה 23.
הערה: Custom סאיםnthetic RNA ניתן להשיג גם מהספקים oligonucleotide. - לאחר השלמת מחזור סינתזה האחרון, להעביר את CPG עם oligonucleotide מסונתז מהעמודה בקבוקון זכוכית עם ראש מתברג טפלון-אניה, להוסיף 1 מ"ל של אמוניום הידרוקסיד 29%, ו דגירה אותו ב 55 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות כדי לדבוק oligonucleotide מן CPG ולהסיר הקבוצות להגן מבסיסי ופוספטים.
- להתאדות אמוניום הידרוקסיד עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 ° C מחדש לפזר את oligonucleotide ב 0.2 מ"ל של 0.1 מ 'n-hexylammonium אצטט.
- לטהר את oligonucleotide הסינטטי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית הפוך פאזיים בעל ביצועים גבוהים באמצעות טור הקלקר-divinylbenzene עם מאגר המכיל אצטוניטריל 10-50% / 0.1 M יצטט n-hexylammonium. הפעל את הטור 2.0 מ"ל / דקה במשך 25 דקות ב 80 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 0.25-0.5 מיליליטר של חומצה אצטית מרוכזת המדגם המופרד (1-2 מיליליטר) כדי להפוך את פתרון חומצה אצטית 20%, ו אינקובטוריםte הפתרון הזה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הקבוצה DMT.
- לייבש את המדגם עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 ° C, מחדש לפזר אותו 1 מ"ל של 29% אמוניום הידרוקסיד, דגירה הפתרון למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את שרשרת הצד של פוספט '5.
- הקטנת נפח (1 מ"ל) של המדגם לכ 0.3 מ"ל עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 ° C.
- Dialyze המדגם מרוכז כולו נגד מים מזוקקים (500 מ"ל) באמצעות צינור דיאליזה של משקל מולקולרי חתוכים 1,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- מעבירים את המדגם dialyzed מהצינור דיאליזה כדי צינור 1.5 מ"ל עם טפטפת, לייבש אותו עם המאייד צנטריפוגלי ב 40 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מחדש להמיס אותו במים מים עבור הזרקת כיתה, שהיקפם צריך להיות קטן מספיק כדי להפוך את פתרון יותר מ -100 מיקרומטר.
- מדוד צפיפות אופטית של מדגם RNA ב 260 ננומטר עם ספקטרופוטומטר ולהתאים ריכוזו 100מיקרומטר על ידי הוספת מים מים-עבור-הזרקה-כיתה. אחסן את הפתרון RNA ב להלן -20 ° C לפני השימוש.
הקרנת 2. הספרייה sgRNA עבור כדאיות התא
- כן 10 3 תאים / 99 μl / היטב (למשל, HL60 ו RPMI-8226) על צלחת 96-היטב בתקשורת RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עובריים 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין. הכן בארות המכילות התקשורת רק רקע חיסור. כדי למגר תופעות קצה, להוסיף מים סטריליים כדי לרוקן בארות סביב הבארות המדגמות.
- הוסף 1 μl של sgRNA heptamer מסוג (100 מיקרומטר) מומס במים למטרות הזרקת כיתה מים זה טוב. Assay כל sgRNA בשלושה עותקים. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified 5% CO 2 למשך 3 ימים.
- להוסיף נפח מתאים של פתרון WST-8 זמין מסחרי היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס אותו בחממה במשך 1 עד 4 שעות.
- מדוד ספיגt 450 ננומטר עם קורא microplate.
הערה: ברוב המקרים, ליניאריות בין ספיגת ומספר תא קיימא נראה להישמר אלא אם הערך ספיגת עולה 1.0.
3. הערכה האפקטיבית sgRNAs ידי cytometry הזרימה
- כן 10 3 תאים / 99 μl / היטב (למשל, HL60) על צלחת 96-היטב בתקשורת RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עובריים 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין. הכן לפחות 10 בארות sgRNA אחד להיבדק. כדי למגר תופעות קצה, להוסיף מים סטריליים כדי לרוקן בארות סביב הבארות המדגמות.
- הוסף 1 μl של sgRNA heptamer מסוג (100 מיקרומטר) מומס במים למטרות הזרקת כיתה מים זה טוב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified 5% CO 2 למשך 3 ימים.
- אוספים את התאים שטופלו באותו sgRNA מלפחות 10 בארות לתוך צינור 5 מ"ל עם טפטפת. לסובב את הצינור במשך 5 דקות בתוך צנטריפוגות ב 300 XG, וזורק את התקשורת.
- הוסף 2 מ"ל של בופר פוספט 1x (PBS) אל הצינור, מחדש להשעות את התאים. לסובב את הצינור במשך 5 דקות בתוך צנטריפוגות ב 300 XG, וזורקים PBS. להוסיף 150 μl של חיץ מחייב 1x Annexin V אל הצינור, מחדש להשעות את התאים.
- הוסף 2 μl של Phycoerythrin (PE) מצומדות פתרון Annexin V ו- 1 μl של D 7-aminoactinomycin (7AAD) הפתרון הצינור, לערבב אותם היטב, דגירה הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. נתח את המדגם באמצעות cytometer זרימה 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ששת sgRNAs heptamer מסוג 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), 5'-CACCAGC-3' (H13260) היו מסונתז כימית כמו 2'- O -methyl RNA המכיל 5'- ו 3'-פוספטים.
sgRNAs אלה נבדקו ההשפעות על הכדאיות של שורת תאים לוקמיה, HL60, וקו תאים אנושיים מיאלומה, RPMI-8226. נציג התוצאות של מבחני כדאיות התא מוצגים באיור 1. ארבעת sgRNAs H1885, H3277, H10927, ו H13260 היו יעילים מאוד והקטינו את הכדאיות של HL60 ותאי RPMI-8226 על ידי> 80% ו> 70%, בהתאמה. Heptamers H3277 ו H10927 נבדקו גם על ההשפעות על כדאיות התא HEK293 שאינם סרטניים, וכן הוכחו בקושי affect התא כדאי 22.
תזרים cytometry עם Annexin V ו 7AAD צביעה כפולה בוצע עבור HL60 תאים שטופלו heptamer H1885, H3277, H10927, או H13260. בכל sgRNA, מספר תא הכולל (56-95%) בשלבים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים היה גבוה הרבה יותר מזה (4-6%) מדומה (איור 2). מקרים אלה מצביעים כי הפחתת כדאיות התא HL60 נובע אפופטוזיס.
באיור 1. מבחני כדאיות התא. כדאיות התא נמדדה 72 שעות לאחר HL60 תאים (א) או RPMI-8226 תאים (B) היו בתרבית היעדרותם ונוכחותם של 1 מיקרומטר של heptamer מסוג עירום sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, או H13260. מספרי התא החי ביחס בהעדר sgRNAs מותאמים 100. שגיאהברים מצביעים SD (n = 3). *, P <0.002. הודפס מחדש מלוקמיה מחקר, Vol. 38, טקהאשי M. et al., הקרנת ספרייה sgRNA heptamer מסוג בתרופות פוטנציאל נגד ממאירויות המטולוגיות, עמ '808-815, איור. 1, כל הזכויות שמורות (2014), באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Cytometry זרימה. עם כל הכבוד תאים HL60, cytometry זרימה בוצעה עם Annexin V ו 7AAD צביעה כפולה. התאים נותחו 72 שעות לאחר בתרבית היעדרותם ונוכחותם של 1 מיקרומטר של heptamer מסוג עירום sgRNA H1885 (א), H3277 (א), H13260 (א), או H10927 (B). הודפס מחדש מלוקמיה מחקר, Vol. 38, טקהאשי M. et al., הקרנת ספרייה sgRNA heptamer מסוג בתרופות פוטנציאל נגד ממאירויות המטולוגיות, עמ '808-815, איור. 2, כל הזכויות שמורות (2014), באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית העברת יכולת הסתגלות חלקה וטכנולוגיה בראי R מונחה יעד & D, יפן מדע וטכנולוגיה הסוכנות, הקרן לקידום מחקר מדעי מעזר קידום הדדי Corporation עבור בתי ספר פרטיים של יפן, ואת מספרי JSPs KAKENHI גרנט 24300342 ו 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
