TRUE遺伝子サイレンシング：潜在的ながん治療薬の七量体型スモールガイドRNAライブラリーのスクリーニング
Summary
ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。
Abstract
TRUE遺伝子サイレンシングは、（TRナーゼZ Lの後に呼ばれる- uは 電子 fficacious遺伝子サイレンシングtilizing）tRNAの3 '処理エンドリボヌクレアーゼ、tRNase Z Lを導くために人工的な小さなガイドRNA（sgRNA）を利用する技術をサイレンシングRNA指向性遺伝子の一つであるが標的RNAを認識する。 sgRNAsは任意のトランスフェクション試薬なしで細胞によって取り込まれることができ、それらの標的RNAのレベルを下方制御および/またはヒトの癌細胞においてアポトーシスを誘導することができます。我々は、ヒト骨髄腫および白血病細胞の生存率に対する効果について156ヘプタマー型sgRNAsを含むsgRNAライブラリーをスクリーニングし、そしてそれらの20を効率的に癌細胞株の少なくとも一方においてアポトーシスを誘導することができることを見出しました。ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。プロトコルは、細胞生存率に対する各sgRNAの効果を評価する方法、sgRNAライブラリーを構築する方法を含み、そしてどのよう府へrtherは、フローサイトメトリーによる効果的なsgRNAsを評価します。約2,000ヒットは16,384ヘプタマーで構成されるフルスケールのsgRNAライブラリーをスクリーニングすることによって得られることが期待されます。
Introduction
（TRナーゼZ Lの後に呼ばれる- uは 電子 fficacious遺伝子サイレンシングをtilizing）TRUE遺伝子サイレンシングは、RNA依存性遺伝子サイレンシング技術1の1です。この技術が開発さtRNase Z L（または3 'tRNase）、tRNAの3'処理エンドリボヌクレアーゼの特性に基づいている：それは認識することにより、人工の小さなガイドRNA（sgRNA）の指示の下で任意の予想サイトで任意の標的RNAを切断することができますプレ-tRNA状または標的RNAとsgRNA 2との間に形成されたマイクロプレ-tRNA様構造– 9。長さのnt通常7月31日であるsgRNAは、4つのグループ、5'-ハーフのtRNA、七量体RNA、14-ntのリニアRNA、およびフックRNAに分類されます。
15 –私たちは生きている細胞10内に様々な人工的に設計されたsgRNAsを導入することにより、TRUE遺伝子サイレンシングの有効性を実証しています。我々はまた、sgRNAs細胞ウィスコンシンによって取り込まれることが示されています任意のトランスフェクション試薬thoutとそれらの標的RNAのレベルを下方制御および/ またはヒト癌細胞16においてアポトーシスを誘導することができる– 18。 21 – TRUE遺伝子サイレンシングは、tRNase Z Lと自然sgRNAs 19を介した細胞内および細胞間の遺伝子制御ネットワークシステム上で動作しているように見えます。
我々は、血液癌22のための潜在的な治療ヘプタマー型sgRNAsを検索するために156量体型sgRNAsを含むsgRNAライブラリーを構築しました。我々は、ヒト骨髄腫および白血病細胞の生存率に対する影響のためにスクリーニングし、それらの20を効率的に癌細胞株の少なくとも一方においてアポトーシスを誘導することができることを見出しました。それらの図4は、マウス異種移植実験において腫瘍の成長率を低下させることが示されています。
ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。プロトコルがどのように備えて細胞生存率に対する各sgRNAの効果を評価する方法、sgRNAライブラリーを構築するための方法、およびさらに、フローサイトメトリーによって効果的なsgRNAsを評価します。これらは、このプロトコルに含まれていないが、マウス異種移植モデルにおけるsgRNAの細胞標的RNAと有効sgRNAsの評価のための分析は、従来の方法17,22に従って行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ターゲット主導のR＆D、科学技術振興機構、日本私立学校振興・共済・コーポレーションからの科学研究振興基金を通じて適応とのシームレスな技術移転プログラムでサポートされている、とJSPS科研費補助金番号24300342と15H04313ました。
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J., Morris, K. V. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. , 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
