Summary
ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。
Abstract
TRUE遺伝子サイレンシングは、（TRナーゼZ Lの後に呼ばれる- uは 電子 fficacious遺伝子サイレンシングtilizing）tRNAの3 '処理エンドリボヌクレアーゼ、tRNase Z Lを導くために人工的な小さなガイドRNA（sgRNA）を利用する技術をサイレンシングRNA指向性遺伝子の一つであるが標的RNAを認識する。 sgRNAsは任意のトランスフェクション試薬なしで細胞によって取り込まれることができ、それらの標的RNAのレベルを下方制御および/またはヒトの癌細胞においてアポトーシスを誘導することができます。我々は、ヒト骨髄腫および白血病細胞の生存率に対する効果について156ヘプタマー型sgRNAsを含むsgRNAライブラリーをスクリーニングし、そしてそれらの20を効率的に癌細胞株の少なくとも一方においてアポトーシスを誘導することができることを見出しました。ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。プロトコルは、細胞生存率に対する各sgRNAの効果を評価する方法、sgRNAライブラリーを構築する方法を含み、そしてどのよう府へrtherは、フローサイトメトリーによる効果的なsgRNAsを評価します。約2,000ヒットは16,384ヘプタマーで構成されるフルスケールのsgRNAライブラリーをスクリーニングすることによって得られることが期待されます。
Introduction
（TRナーゼZ Lの後に呼ばれる- uは 電子 fficacious遺伝子サイレンシングをtilizing）TRUE遺伝子サイレンシングは、RNA依存性遺伝子サイレンシング技術1の1です。この技術が開発さtRNase Z L（または3 'tRNase）、tRNAの3'処理エンドリボヌクレアーゼの特性に基づいている：それは認識することにより、人工の小さなガイドRNA（sgRNA）の指示の下で任意の予想サイトで任意の標的RNAを切断することができますプレ-tRNA状または標的RNAとsgRNA 2との間に形成されたマイクロプレ-tRNA様構造- 9。長さのnt通常7月31日であるsgRNAは、4つのグループ、5'-ハーフのtRNA、七量体RNA、14-ntのリニアRNA、およびフックRNAに分類されます。
15 -私たちは生きている細胞10内に様々な人工的に設計されたsgRNAsを導入することにより、TRUE遺伝子サイレンシングの有効性を実証しています。我々はまた、sgRNAs細胞ウィスコンシンによって取り込まれることが示されています任意のトランスフェクション試薬thoutとそれらの標的RNAのレベルを下方制御および/ またはヒト癌細胞16においてアポトーシスを誘導することができる- 18。 21 - TRUE遺伝子サイレンシングは、tRNase Z Lと自然sgRNAs 19を介した細胞内および細胞間の遺伝子制御ネットワークシステム上で動作しているように見えます。
我々は、血液癌22のための潜在的な治療ヘプタマー型sgRNAsを検索するために156量体型sgRNAsを含むsgRNAライブラリーを構築しました。我々は、ヒト骨髄腫および白血病細胞の生存率に対する影響のためにスクリーニングし、それらの20を効率的に癌細胞株の少なくとも一方においてアポトーシスを誘導することができることを見出しました。それらの図4は、マウス異種移植実験において腫瘍の成長率を低下させることが示されています。
ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。プロトコルがどのように備えて細胞生存率に対する各sgRNAの効果を評価する方法、sgRNAライブラリーを構築するための方法、およびさらに、フローサイトメトリーによって効果的なsgRNAsを評価します。これらは、このプロトコルに含まれていないが、マウス異種移植モデルにおけるsgRNAの細胞標的RNAと有効sgRNAsの評価のための分析は、従来の方法17,22に従って行うことができます。
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Protocol
ヘプタマー型の1建設sgRNAライブラリ
- 本格的なライブラリを構築する場合を除き16,384（4〜7）7-ntの配列のサブセットを選択します。
注：シーケンスは、ランダムおよび/または特異的な細胞RNAを標的とするように設計することができます。後者の場合は、ヘアピン構造は、適切なコンピュータプログラムを用いて、標的RNAおよび/ または視覚的tRNAのT-アームに似た見つけ、ヘアピン構造4,10のすぐ下流に7-ntの配列に相補的な配列を選択し、 17,18。 - 選択ヘプタマーのそれぞれを合成完全に2'-O -メチル化、5'-及びDNA / RNA合成と3'-リン酸化RNA。孔制御ガラス（CPG）支持体上のホスホラミダイト法を使用し、合成の最終サイクルの上の5 '末端4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）保護基（5'リン酸を添加することを）残します23。
注：カスタムSYnthetic RNAはまた、オリゴヌクレオチドの供給業者から入手することができます。 - 最後の合成サイクルの完了後、テフロンライナースクリューキャップ付きガラスバイアルにカラムから合成されたオリゴヌクレオチドを用いてCPGを転送する29％の水酸化アンモニウムを1mlを加え、8時間55℃でそれをインキュベートCPGからオリゴヌクレオチドを切断し、塩基及びリン酸塩から保護基を除去します。
- 40℃で遠心蒸発器と0.1 Mのn-ヘキシルアセテートを0.2mlに再溶解するオリゴヌクレオチドで水酸化アンモニウムを蒸発させます。
- 10〜50％アセトニトリル/ 0.1 Mのn-ヘキシルアセテートを含む緩衝液でポリスチレン - ジビニルベンゼンのカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーを介して合成オリゴヌクレオチドを精製します。 80℃で25分間、2.0ミリリットル/分でカラムを実行します。
- 20％酢酸溶液を作るために分画したサンプル（1-2 ml）のに濃酢酸の0.25〜0.5ミリリットルを追加し、incubaTE室温で1時間この溶液にDMT基を除去しました。
- 29％の水酸化アンモニウム1ml中に再溶解し、そして5 'リン酸の側鎖を除去するために室温で15分間溶液をインキュベートし、40℃で遠心エバポレーターを用いてサンプルを乾燥させます。
- 40℃での遠心エバポレーターで約0.3ミリリットルに試料の体積（1ミリリットル）を低減。
- カットオフ1,000 4℃で一晩分子量の透析チューブを用いて蒸留水に対して全体の濃縮試料（500ml）に透析します。
- その後、ピペットで1.5 mlチューブに透析チューブから透析サンプルを移し、40℃で遠心エバポレーターで乾燥させ、そしてその体積のはず、注射用水グレードの水に再溶解より大きい100μMの溶液を作製するのに十分小さいこと。
- 分光光度計を用いて260nmでRNAサンプルの光学密度を測定し、100にその濃度を調整します水のための注射等級の水を添加することによりμM。 -20°C使用前に以下のRNA溶液を保管してください。
細胞生存率のためのsgRNAライブラリの2.スクリーニング
- 調製10 3細胞/ 99μL/ウェル（ 例えば、HL60及びRPMI-8226）を、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を補充したRPMI-1640培地中で96ウェルディッシュに。唯一のバックグラウンド減算のメディアを含むウェルを準備します。エッジ効果を排除するために、サンプルウェルの周囲の井戸を空にするために滅菌水を追加します。
- 各ウェルに注射用水グレードの水に溶解しヘプタマー型sgRNA（100μM）の1μLを加えます。三連でアッセイ各sgRNA。 3日間、5％CO 2加湿インキュベーター中37℃でプレートをインキュベートします。
- 各ウェルに、市販のWST-8溶液の適切な量を追加します。 1〜4時間、同じインキュベーター中、37℃でプレートをインキュベートします。
- 吸光度Aを測定しますマイクロプレートリーダーで450nmでのTを
注：ほとんどの場合、吸光度と生細胞数の間の直線性は、吸光度の値が1.0を超えない限り維持されるように思われます。
フローサイトメトリーによる実効sgRNAs 3.評価
- 調製10 3細胞/ 10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を補充したRPMI-1640培地中で96ウェルディッシュに99μL/ウェル（ 例えば、HL60）。 1 sgRNAをテストするために少なくとも10のウェルを準備します。エッジ効果を排除するために、サンプルウェルの周囲の井戸を空にするために滅菌水を追加します。
- 各ウェルに注射用水グレードの水に溶解しヘプタマー型sgRNA（100μM）の1μLを加えます。 3日間、5％CO 2加湿インキュベーター中37℃でプレートをインキュベートします。
- ピペットで5 mlチューブに少なくとも10ウェルから同じsgRNAで処理した細胞を収集します。 30で遠心機で5分間チューブをスピン0 XG、およびメディアを廃棄します。
- チューブに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を2 mlを加え、細胞を再懸濁します。 300×gで遠心機で5分間チューブをスピンし、PBSを捨てます。チューブに1×アネキシンV結合緩衝液の150μlのを追加し、細胞を再懸濁。
- 、フィコエリトリン2μlの（PE）抱合アネキシンVソリューションとチューブに7-アミノのD（7AAD）溶液1μlを加えよく混ぜる、そして暗所で室温で15分間チューブをインキュベートします。 24フローサイトメーターを使用してサンプルを分析します。
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Representative Results
6ヘプタマー型sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '（H1885）、5'-ACACACA-3'（H3277）、5'-GGGGGCG-3 '（H10927）、5'-GGGGCCC-3'（H10944）、 5'-GCCCCCG-3 '（H12287）、および5'-CACCAGC-3'（H13260）は、化学的に5'-および3'-リン酸を含む2'-OメチルRNAとして合成しました。
これらsgRNAsは、ヒト白血病細胞株HL60およびヒト骨髄腫細胞株、RPMI-8226の生存率に及ぼす影響について調べました。細胞生存率アッセイの代表的な結果が。 図1に4 sgRNAs H1885、H3277、H10927を示しており、H13260は非常に有効であったと、それぞれ> 80％および> 70％、によってHL60およびRPMI-8226細胞の生存率を低下させました。ヘプタマーH3277およびH10927は、非癌性のHEK293細胞の生存率に及ぼす影響について試験し、そしてほとんどaffeに示されていますセル22を生存率CT。
アネキシンVおよび7AAD二重染色とフローサイトメトリーは七量体H1885、H3277、H10927、またはH13260で処理したHL60細胞を行いました。各sgRNAでは、初期および後期アポトーシス段階における総細胞数（56から95パーセント）は、モック（ 図2）のもの（4から6パーセント）よりもはるかに高かったです。これらの観察は、HL60細胞の生存率の減少がアポトーシスによるものであることを示唆しています。
図1.細胞生存率アッセイ HL60細胞（A）またはRPMI-8226細胞（B）は裸のヘプタマー型sgRNA H1885、H3277の1μMの非存在下または存在下で培養した後。細胞生存率は、72時間を測定したところ、H10927、 H10944、H12287、またはH13260。 sgRNAsの非存在下での相対的な生細胞数が100エラーに調整されています棒はSDを示した（n = 3）。 *、P <0.002。白血病研究、巻より転載。 38、高橋M. ら 、血液悪性腫瘍に対する潜在的な治療薬の七量体型sgRNAライブラリのスクリーニング、頁808から815、図1、著作権（2014年）、エルゼビアからの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2のフローサイトメトリー。HL60細胞に関して、フローサイトメトリーアネキシンV及び7AAD二重染色を行いました。細胞をネイキッドヘプタマー型sgRNA H1885（A）、H3277（A）、H13260（A）、またはH10927（B）の1μMの非存在下または存在下で培養した後、72時間で分析しました。白血病研究、巻より転載。 38、高橋M. ら 、血液悪性腫瘍に対する潜在的な治療薬の七量体型sgRNAライブラリ、頁808から815まで、図のスクリーニング。 2、著作権（2014年）、エルゼビアからの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Acknowledgments
この作品は、ターゲット主導のR＆D、科学技術振興機構、日本私立学校振興・共済・コーポレーションからの科学研究振興基金を通じて適応とのシームレスな技術移転プログラムでサポートされている、とJSPS科研費補助金番号24300342と15H04313ました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
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