Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사

Published: June 2, 2016 doi: 10.3791/53879
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Research Institute for Healthy Living, Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다.

Abstract

TRUE 유전자 침묵은 (TR Nase Z의 L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵 tilizing)의 tRNA 3 '처리 endoribonuclease, tRNase Z L을 안내하는 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)을 이용 기술을 입을 RNA의 지시 유전자 중 하나입니다 , 표적 RNA를 인식한다. sgRNAs 모든 형질 전환 시약없이 세포에 의해 용해 될 수 있고, 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간의 암세포에서 아폽토시스를 유도 할 수있다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 미치는 영향 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 세포 생존, 그리고 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 쿵푸를하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성하는 방법을 포함rther는 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가합니다. 약 2,000 명중은 16,384 heptamers 이루어지는 본격적인 sgRNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어 질 것으로 예상된다.

Introduction

(TR Nase Z의 L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵을 tilizing) TRUE 유전자 침묵은 RNA 지시 유전자 침묵 기술 (1) 중 하나입니다. 이 기술은 개발 tRNase Z L (또는 3 'tRNase), tRNA의 3'처리 endoribonuclease의 속성을 기반으로하고있다 : 그것은을 인식하여 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)의 지시에 따라 어떤 예상 사이트에있는 모든 대상 RNA를 절단 할 수 있습니다 9 - 표적 RNA와 sgRNA (2) 사이에 형성된 프리 tRNA의 형상 또는 마이크로 사전의 tRNA 형 구조. 길이 NT를 일반적으로 7-31이다 sgRNA는 네 그룹, 5'- 절반의 tRNA, 헵 타머 RNA, 14 NT를 선형 RNA, 그리고 훅 RNA로 분류된다.

15 - 우리는 셀 (10) 생활에 다양한 인위적으로 설계 sgRNAs을 도입하여 TRUE 유전자 침묵의 효과를 증명하고있다. 우리는 또한 sgRNAs이 세포 위스콘신에 의해 흡수 될 수 있음을 보여 주었다모든 형질 전환 시약 사전 통 보없이 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간 암세포 (16)에 세포 자멸을 유도 할 수있다 - 18. 21 - TRUE 유전자 침묵은 tRNase Z L과 자연 sgRNAs (19)를 통해 세포 내와 세포 간 유전자 조절 네트워크 시스템에서 작동하도록 나타납니다.

우리는 혈액 암 (22)에 대한 잠재적 인 치료 헵 타머 형 sgRNAs 검색 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 구축했다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 대한 효과를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 그 중 4 마우스 이종 이식 실험에서 종양 성장 속도를 감소시키는 것으로 나타났다.

여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 어떻게 포함세포 생존, 어떻게 더 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가하는 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성합니다. 이러한 프로토콜이 포함되지 않더라도 마우스 이종 이식 모델에서의 셀룰러 sgRNA 표적 RNA를위한 분석 및 sgRNAs 효과의 평가는, 17, 22 종래의 방법에 따라 수행 될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

헵 타머 형 1. 건설 sgRNA 도서관

  1. 본격적인 라이브러리의 구축에 사용되지 않는 한, 384 (4-7) -7- NT 시퀀스의 서브 세트를 선택한다.
    참고 : 순서는 랜덤 및 / 또는 특정 세포의 RNA를 대상으로 설계 할 수있다. 후자의 경우, 헤어핀 구조 -4,10-의 바로 하류 -7- NT 서열에 상보 적절한 컴퓨터 프로그램 및 / 또는 시각, 선택 시퀀스들을 이용하여 표적 RNA에서의 tRNA의 T 아암 닮은 헤어핀 구조를 찾아 17, 18.
  2. 로 선택한 heptamers의 각을 합성 완전히 2'- O -methylated, 5'- 및 DNA / RNA 합성과 3'- 인산화 RNA. 제어 된 기공 유리 (CPG) 지지체 상 포스 방법을 사용하여 5'- 말단 4,4'- 디메 톡시 트리 틸 (DMT) 합성의 마지막 사이클에서 (5 '포스페이트를 추가) 보호기를 남겨 23.
    참고 : 사용자 정의 한건데nthetic RNA는 뉴클레오티드 공급 업체에서 얻을 수 있습니다.
  3. 마지막 합성주기의 완료 후, 8 시간 동안 55 ° C에서이를 1 ㎖의 29 % 암모늄 하이드 록 사이드를 추가 테플론 라이너 스크류 캡이있는 유리 병에 컬럼으로부터 합성 올리고 뉴클레오티드와 CPG를 전송하고, 부화 소비재에서 올리고 뉴클레오티드를 절단하고 기지와 인산염에서 보호 그룹을 제거합니다.
  4. 40 ° C에서 원심 증발기로 암모늄 히드 록 시드를 증발시키고, 0.2 mL의 0.1 M N-hexylammonium 아세테이트로 올리고 뉴클레오티드를 재용.
  5. 10~50% 아세토 니트릴 / 0.1 M N-hexylammonium 아세테이트를 함유하는 완충액, 폴리스티렌 - 디 비닐 벤젠 칼럼을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피를 통해 정제하여 합성 올리고 뉴클레오티드. 80 ° C에서 25 분 동안 / 2.0 ml의에서 분 열을 실행합니다.
  6. 20 % 아세트산 용액을 제조하기 위해 분류 된 샘플 (1-2 ㎖)로 농축 아세트산 0.25-0.5 mL를 넣고 incubaTE, 실온에서 1 시간 동안이 용액은 DMT기를 제거한다.
  7. 40 ° C에서 원심 증발기를 사용하여 샘​​플을 건조하고 1 ml의 29 % 암모늄 하이드 록 사이드에서 그것을 재 - 용해하고, 5 '포스페이트의 측쇄를 제거하여 실온에서 15 분 동안 용액을 배양한다.
  8. 40 ° C에서 원심 증발기로 약 0.3 ml의 시료의 부피 (1 ml)로 줄인다.
  9. 차단 1000을 4 ℃에서 밤새 분자량 투석 튜브를 사용하여 증류수에 대한 전체 농축 샘플 (500 ml)에 투석.
  10. 그 후, 피펫으로 1.5 ㎖의 튜브로 투석 튜브로 투석 샘플을 이동시켜 40 ℃에서 원심 증발기로 건조하고, 볼륨있는 경우, 물에 대한 주입 등급 물에 재용 더 큰 100 μM 솔루션을 만들기에 충분 작은.
  11. 분광 광도계로 260 nm에서의 RNA 시료의 광학 밀도를 측정하고 (100)의 농도를 조정물에 대한 주입 등급의 물을 첨가하여 μM. -20 ° C 사용하기 전에 아래의 RNA 솔루션을 저장합니다.

세포 생존에 대한 sgRNA 도서관 2. 심사

  1. 준비 103 세포 / 99 μL / 웰 (예 : HL60 및 RPMI-8226) 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 96 웰 접시. 단지 배경 공제 미디어를 포함하는 우물을 준비합니다. 샘플 우물 주변 우물을 비우 멸균 물을 추가, 가장자리 효과를 제거합니다.
  2. 각 웰에 물에 대한 주입 수준의 물에 용해 헵 타머 형 sgRNA (100 μM) 1 μl를 추가합니다. 세중 각 sgRNA를 분석. 3 일간 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  3. 각 웰에 시판 WST-8 솔루션의 적절한 볼륨을 추가합니다. 1 내지 4 시간 동안 동일한 인큐베이터에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  4. 흡광도 A를 측정마이크로 플레이트 리더 450 nm의에서 t.
    주 : 대부분의 경우, 흡광도 및 생존 세포 수 사이의 선형성 흡광도 값이 1.0를 초과하지 않는 한 유지 될 것으로 보인다.

유동 세포 계측법에 의한 효과적인 sgRNAs 3. 평가

  1. 준비 103 세포 / 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 96 웰 접시에 99 μL / 웰 (예 : HL60). 하나 sgRNA가 테스트 될 때까지 적어도 10 우물을 준비합니다. 샘플 우물 주변 우물을 비우 멸균 물을 추가, 가장자리 효과를 제거합니다.
  2. 각 웰에 물에 대한 주입 수준의 물에 용해 헵 타머 형 sgRNA (100 μM) 1 μl를 추가합니다. 3 일간 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  3. 피펫으로 5 ㎖의 튜브에 적어도 10 웰로부터 동일한 sgRNA로 처리 된 세포를 수집한다. 30 원심 분리기에서 5 분 동안 튜브를 스핀0 XG, 미디어를 폐기합니다.
  4. 튜브로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 2 mL를 넣고 세포를 다시 일시. 300 XG에 원심 분리기에서 5 분 동안 튜브를 스핀, 그리고 PBS를 폐기합니다. 튜브에 1 배 넥신 V 결합 버퍼의 150 μl를 추가하고 세포를 다시 일시 중지합니다.
  5. , 피코 에리 트린의 2 μL (PE) π 공역 넥신 V 용액 튜브 내지 7 aminoactinomycin의 D (7AAD) 액 1 μl를 추가들을 잘 혼합하고, 어둠에서 실온에서 15 분 동안 튜브를 배양한다. (24) 플로우 사이토 미터를 사용하여 샘플을 분석한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

여섯 헵 타머 형 sgRNAs 5'- AUCUUCA-3 '(H1885), 5'- ACACACA-3'(H3277), 5'- GGGGGCG-3 '(H10927), 5'- GGGGCCC-3'(H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), 및 5'-CACCAGC-3'(H13260)을 화학적으로 3'- 및 5'- 포스페이트를 함유하는 O -2'- 메틸 RNA 합성 하였다.

이러한 sgRNAs은 인간 백혈병 세포주, HL60과 인간 골수종 세포주, RPMI-8226의 생존에 미치는 영향에 대해 조사 하였다. 세포 생존력 분석법 대표 결과.도 1에서 4 개의 sgRNAs H1885, H3277, H10927를 도시하고, H13260 매우 효과적 각각> 80 % 및> 70 %에 의해 HL60 및 RPMI-8226 세포의 가능성을 감소시켰다. heptamers H3277 및 H10927 또한 비 암성 HEK293 세포 생존에 대한 효과에 대해 시험하고, 거의 원숭이 것으로 나타났다CT 셀 (22)을 생존.

아 넥신 V 및 7AAD 이중 염색 유세포는 헵 타머 H1885, H3277, H10927 또는 H13260 처리 HL60 세포에 대해 수행 하였다. 각 sgRNA에서, 초기와 후기 세포 사멸 단계에서 총 세포 수 (56-95%)는 모의 (그림 2)에서 그 (4-6%)보다 훨씬 높았다. 이러한 관찰은 HL60 세포 생존율의 감소는 세포 자멸에 기인 것을 시사한다.

그림 1
도 1 세포 생존율 분석법. 세포 생존이 HL60 세포 (A) 또는 RPMI-8226 세포 (B)가없는 경우 또는 육안 헵 타머 형 sgRNA H1885 1 μM, H3277, H10927의 존재하에 배양 한 후 72 시간을 측정하고, H10944, H12287, 또는 H13260. sgRNAs의 부재의 상대적인 생존 세포 수는 100 에러에 조정막대는 SD를 나타낸다 (n = 3)를 나타낸다. * P <0.002. 백혈병 연구, 집에서 재판. (38), 다카하시 M. 등., 혈액 악성 종양에 대한 잠재적 치료제 권, 808-815, 그림에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 심사. 1, 저작권 (2014), 엘스 비어의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 유동 세포 계측법. HL60 세포에 대하여, 유동 세포 계측법 넥신 V 및 7AAD 이중 염색을 수행 하였다. 세포는 부재하거나 육안 헵 타머 형 sgRNA H1885 (A), H3277 (A) H13260 (A) 또는 H10927 (B) 1 μM의 존재 하에서 배양 후 72 시간을 분석 하였다. 백혈병 연구, 집에서 재판. 삼8, 다카하시 M. 등., 혈액 악성 종양에 대한 잠재적 치료제 권, 808-815, 그림에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 심사. 2, 저작권 (2014), 엘스 비어의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

이 작품은 대상 중심의 R & D, 일본 과학 기술 진흥기구, 일본의 사립 학교에 대한 홍보 및 공제 Corporation의 과학 연구 진흥 기금을 통해 적응력과 원활한 기술 이전 프로그램에서 지원하고, JSPS KAKENHI ​​그랜트 번호 24300342과 15H04313했다 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom heptamer RNA Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge Transgenomic 99-3860
Water-for-injection-grade Water Otsuka Pharmaceutical  7131400A2129
RPMI-1640 medium Wako 189-02025
Fetal Bovine Serum SIGMA-ALDRICH 172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai Tesque 26253-84
96 Well Plate Greiner Bio-one 655 180
Cell Counting Kit-8 DOJINDO 343-07623 WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R TEKAN 510-82851
FACS Round-Bottom Tube BD Falcon 60819-820
Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 51-66121E
PE Annexin V BD Biosciences 51-65875X
7AAD SIGMA-ALDRICH A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur BD Biosciences 342973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
  2. Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
  3. Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
  4. Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
  5. Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
  6. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
  7. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
  8. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
  9. Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
  10. Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
  11. Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
  12. Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
  13. Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
  14. Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
  15. Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
  16. Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
  17. Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
  18. Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
  19. Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
  20. Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
  21. Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
  22. Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
  23. Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
  24. FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
  25. Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).

Tags

의학 문제 (112) TRUE 유전자 침묵 tRNase Z 헵 타머 형 sgRNA sgRNA 라이브러리 검사 RNA 치료 암 치료제
TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M.,… More

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter