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Medicine

VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer

Published: June 2, 2016 doi: 10.3791/53879
* These authors contributed equally

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue.

Abstract

Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L tilizing e fficacious silenciamento do gene) é um do gene dirigida por ARN de silenciamento tecnologias, que utiliza uma pequena guia de ARN artificial (sgRNA) para guiar endorribonuclease processamento ARNt 3 ', tRNase Z L , para reconhecer um alvo de ARN. sgRNAs podem ser absorvidos pelas células sem quaisquer reagentes de transfecção e pode regular negativamente os seus níveis de RNA alvo e / ou induzir a apoptose em células cancerosas humanas. Temos rastreada uma biblioteca sgRNA contendo 156 sgRNAs do tipo heptâmero para o efeito sobre a viabilidade de células de mieloma e de leucemia humana, e descobriram que 20 deles pode eficientemente induzir a apoptose em pelo menos uma das linhas celulares de cancro. Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue. O protocolo inclui a forma de construir a biblioteca sgRNA, a forma de avaliar o efeito de cada sgRNA sobre a viabilidade celular, e a forma de further avaliar os sgRNAs eficazes por citometria de fluxo. Cerca de 2000 acessos seria esperado para ser obtido por rastreio da biblioteca em grande escala sgRNA composto de 16.384 heptamers.

Introduction

Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L e tilizing fficacious silenciamento do gene) é uma das tecnologias de silenciamento do gene dirigida por RNA 1. Esta tecnologia foi desenvolvida com base nas propriedades de tRNase Z L (ou 3 'tRNase), ARNt 3' endorribonuclease processamento: ela pode clivar qualquer ARN alvo em qualquer sítio esperado sob a direcção de um pequeno ARN guias artificiais (sgRNA) através do reconhecimento de uma pré-ARNt ou de tipo micro-pré-ARNt-como a estrutura formada entre o RNA alvo e a sgRNA 2-9. sgRNA, que normalmente é 7-31 nt de comprimento, é categorizada em quatro grupos, 5'-meia-ARNt, ARN heptâmero, ARN linear de 14 nt, e de ARN de gancho.

Temos demonstrado a eficácia de silenciamento de genes VERDADEIRO através da introdução de vários sgRNAs artificialmente projetados em células vivas 10-15. Também mostrámos que sgRNAs pode ser absorvida pelas células Without quaisquer reagentes de transfecção e pode regular negativamente os seus níveis de RNA alvo e / ou induzir a apoptose em células cancerosas humanas 16 - 18. Silenciamento de genes VERDADEIRO aparece para trabalhar no intracelular e sistema de rede de transcrição intercelular via tRNase Z L e sgRNAs naturais 19 - 21.

Construímos uma biblioteca sgRNA contendo 156 do tipo heptâmero sgRNAs para procurar potenciais sgRNAs do tipo heptâmero terapêuticas para cancros do sangue 22. Temos rastreados para que o efeito sobre a viabilidade de células de mieloma e de leucemia humana, e descobriram que 20 deles pode eficientemente induzir a apoptose em pelo menos uma das linhas celulares de cancro. E quatro deles foram mostrados para reduzir as taxas de crescimento de tumor em experiências de xenoenxerto de ratinho.

Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue. O protocolo inclui comopara construir a biblioteca sgRNA, a forma de avaliar o efeito de cada sgRNA sobre a viabilidade celular, e a forma de avaliar ainda mais os sgRNAs eficazes por citometria de fluxo. Análise para ARN alvo celular da sgRNA e avaliação de sgRNAs eficazes em modelos de xenoenxerto de ratinho pode ser realizada de acordo com métodos convencionais 17,22, embora estes não estão incluídas no presente protocolo.

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Protocol

1. Construção de um tipo de heptâmero sgRNA Biblioteca

  1. Selecionar um subconjunto dos 16.384 (4 7) sequências de 7 nt a menos que a biblioteca em grande escala deve ser construída.
    NOTA: As sequências podem ser aleatórios e / ou projetados para atingir RNAs celulares específicos. Para este último, encontrar estruturas em gancho de cabelo que se assemelha à do t-braço de ARNt num ARN alvo com o auxílio de um programa adequado de computador e / ou visualmente, e seleccione sequências complementares a sequências 7-nt imediatamente a jusante das estruturas em gancho de cabelo 4,10, 17,18.
  2. Sintetizar cada um dos heptamers seleccionados como um 2'-O totalmente -methylated, 5'- e 3'-ARN fosforilada com um sintetizador de ADN / ARN. Usar o método de fosforamidite sobre o vidro de poro controlado (CPG) de suporte, e deixar o 5'-terminal de 4,4'-dimetoxitritilo (DMT) no grupo protector no último ciclo (a adição de fosfato de 5 ') da síntese 23.
    NOTA: sy personalizadonthetic ARN pode também ser obtido a partir de fornecedores de oligonucleótidos.
  3. Após a conclusão do último ciclo de síntese, transferir a CPG com o oligonucleótido sintetizado a partir da coluna para um frasco de vidro com tampa de rosca-revestimento de Teflon, adiciona-se hidróxido de amónio a 1 ml de 29%, e incuba-se que a 55 ° C durante 8 h para clivar o oligonucleótido do CPG e remover os grupos protectores das bases e fosfatos.
  4. Evapora-se hidróxido de amónio com um evaporador centrífugo a 40 ° C e re-dissolve-se o oligonucleótido em 0,2 ml de 0,1 M de n-hexilamónio de etilo.
  5. Purifica-se o oligonucleótido sintético por meio de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa utilizando uma coluna de poliestireno-divinilbenzeno com um tampão contendo 10-50% de acetonitrilo / M de acetato de n-hexilamónio 0,1. Executar a coluna a 2,0 ml / min durante 25 min a 80 ° C.
  6. Adicionar 0,25-0,5 ml de ácido acético concentrado até a amostra fraccionado (1-2 mL) para fazer uma solução de ácido acético a 20%, e incubate esta solução durante 1 hora à temperatura ambiente para remover o grupo DMT.
  7. Seca-se a amostra com um evaporador centrífugo a 40 ° C, re-dissolve-lo em hidróxido de amónio a 1 ml de 29%, e incubar a solução durante 15 minutos à temperatura ambiente para remover a cadeia lateral de fosfato 5 '.
  8. Reduzir o volume (1 ml) da amostra de cerca de 0,3 ml com um evaporador centrífugo a 40 ° C.
  9. Dialisar toda a amostra concentrada contra água destilada (500 ml), utilizando um tubo de diálise com um peso molecular de corte de 1000 a 4 ° C durante a noite.
  10. Transfira a amostra dialisada a partir do tubo de diálise para um tubo de 1,5 ml com uma pipeta, secá-lo com um evaporador centrífugo a 40 ° C, e, subsequentemente, re-dissolvê-lo em água-para-injecção de nível de água, o volume da qual deve ser pequena o suficiente para fazer uma solução maior do que 100 uM.
  11. Medir uma densidade óptica da amostra de ARN a 260 nm com um espectrofotómetro e ajustar a sua concentração para 100uM por adição de água-para-injecção de nível de água. Guardar a solução de ARN a abaixo de -20 ° C antes da utilização.

2. Rastreio da Biblioteca sgRNA para a viabilidade celular

  1. Preparar 10 3 células / 99 ul / poço (por exemplo, HL60 e meio RPMI-8226) em um prato de 96 poços em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 1%. Prepare poços contendo os meios de comunicação apenas para a subtracção de fundo. Para eliminar os efeitos de borda, adicione água estéril para esvaziar poços que cercam os poços de amostra.
  2. Adicionar 1 ml de tipo heptâmero sgRNA (100 uM) dissolvido em água-para-injecção de nível de água a cada poço. Ensaiar cada sgRNA em triplicado. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 3 dias.
  3. Adicionar um volume apropriado de uma solução de WST-8 disponível comercialmente a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C no mesmo incubador durante 1-4 horas.
  4. Medir a absorvância at 450 nm com um leitor de microplacas.
    NOTA: Na maior parte dos casos, a linearidade entre a absorvância e o número de células viáveis ​​parece ser mantida a menos que o valor da absorvância superior a 1,0.

3. Avaliação da efectiva sgRNAs por citometria de fluxo

  1. Preparar 10 3 células / 99 ul / poço (por exemplo, HL60) em um prato de 96 poços em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 1%. Preparar pelo menos 10 poços para uma sgRNA a ser testado. Para eliminar os efeitos de borda, adicione água estéril para esvaziar poços que cercam os poços de amostra.
  2. Adicionar 1 ml de tipo heptâmero sgRNA (100 uM) dissolvido em água-para-injecção de nível de água a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 3 dias.
  3. Recolher as células tratadas com o mesmo sgRNA de pelo menos 10 poços para um tubo de 5 ml com uma pipeta. Girar o tubo durante 5 min numa centrífuga a 300 xg, e descartar os meios de comunicação.
  4. Adicionar 2 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS) para o tubo, e re-suspender as células. Girar o tubo durante 5 min numa centrífuga a 300 xg, e descartar PBS. Adicionar 150 ul de 1x tampão de ligação da anexina V para o tubo, e re-suspender as células.
  5. Adicionar 2 mL de ficoeritrina (PE) -conjugated solução anexina V e 1 ul de solução de 7-aminoactinomycin D (7AAD) para o tubo, mistura-los bem, e incuba-se o tubo durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Analisar a amostra usando um citômetro de fluxo 24.

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Representative Results

Os seis tipo heptâmero sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), e 5'-CACCAGC-3' (H13260) foram sintetizados quimicamente como 2'-O-metil ARN contendo 5'- e 3'-fosfatos.

Estes sgRNAs foram examinados quanto aos efeitos sobre a viabilidade de uma linha celular de leucemia humana, HL60, e uma linha de células de mieloma humano, RPMI-8226. Os resultados representativos dos ensaios de viabilidade de células são mostradas na Figura 1. Os quatro sgRNAs H1885, H3277, H10927, H13260 e foram muito eficazes e reduziu a viabilidade das células HL60 e meio RPMI-8226 por> 80% e> 70%, respectivamente. Os heptamers H3277 e H10927 também foram testados para os efeitos sobre a viabilidade das células HEK293 não-cancerosas, e tem sido demonstrado que dificilmente Affect a viabilidade celular 22.

A citometria de fluxo com anexina V e 7AAD coloração dupla foi realizada para células HL60 tratadas com o heptâmero H1885, H3277, H10927, H13260 ou. Em cada sgRNA, um número total de células (56-95%) nos estágios precoces e tardios de apoptose foi muito maior do que a (4-6%) em simulada (Figura 2). Estas observações sugerem que a redução da viabilidade das células HL60 é devido a apoptose.

figura 1
Figura 1. Os ensaios de viabilidade celular. A viabilidade das células foi medida 72 horas após as células HL60 (A) ou as células RPMI-8226 (B) foram cultivadas na ausência ou na presença de 1 uM do nu heptâmero de tipo sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, H13260 ou. Os números de células relativos estar na ausência de sgRNAs são ajustados a 100. Erroas barras indicam o SD (n = 3). *, P <0,002. Reproduzido de Leukemia Research, vol. 38, Takahashi M. et ai., Rastreio de uma biblioteca de tipo sgRNA heptâmero para potenciais agentes terapêuticos contra doenças malignas hematológicas, pp 808-815, Fig. 1, Copyright (2014), com a permissão de Elsevier. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A citometria de fluxo. No que diz respeito a células HL60, citometria de fluxo foi realizada com anexina V e 7AAD coloração dupla. As células foram analisadas 72 h depois cultivadas na ausência ou na presença de 1 uM do nu heptâmero de tipo sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A), ou H10927 (B). Reproduzido de Leukemia Research, vol. 38, Takahashi M. et ai., Rastreio de uma biblioteca de tipo sgRNA heptâmero para potenciais agentes terapêuticos contra doenças malignas hematológicas, pp 808-815, Fig. 2, Copyright (2014), com a permissão de Elsevier. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Transferência adaptável e Seamless Tecnologia através de I & D, o Japão Agência de Ciência e Tecnologia, Fundo de Promoção de pesquisa da ciência da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Particulares do Japão Target-driven, e os números JSPS KAKENHI Grant 24300342 e 15H04313 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom heptamer RNA Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge Transgenomic 99-3860
Water-for-injection-grade Water Otsuka Pharmaceutical  7131400A2129
RPMI-1640 medium Wako 189-02025
Fetal Bovine Serum SIGMA-ALDRICH 172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai Tesque 26253-84
96 Well Plate Greiner Bio-one 655 180
Cell Counting Kit-8 DOJINDO 343-07623 WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R TEKAN 510-82851
FACS Round-Bottom Tube BD Falcon 60819-820
Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 51-66121E
PE Annexin V BD Biosciences 51-65875X
7AAD SIGMA-ALDRICH A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur BD Biosciences 342973

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References

  1. Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
  2. Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
  3. Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
  4. Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
  5. Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
  6. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
  7. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
  8. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
  9. Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
  10. Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
  11. Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
  12. Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
  13. Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
  14. Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
  15. Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
  16. Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
  17. Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
  18. Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
  19. Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
  20. Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
  21. Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
  22. Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
  23. Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
  24. FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
  25. Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).

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Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).

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