Summary
Här presenterar vi ett protokoll för screening av en heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska läkemedel mot blodcancer.
Abstract
TRUE geners uttryck (benämnd efter tR Nase Zl - u tilizing e fficacious geners uttryck) är en av RNA-riktad geners uttryck teknik, som utnyttjar en artificiell liten guide-RNA (sgRNA) för att styra tRNA 3 "behandling endoribonukleas, tRNase Zl att erkänna en mål-RNA. sgRNAs kan tas upp av celler utan några transfektionsreagens och kan nedreglera deras mål-RNA-nivåer och / eller inducera apoptos i humana cancerceller. Vi har screened ett sgRNA bibliotek innehållande 156 heptamer-typ sgRNAs för effekten på viabiliteten hos humana myelom och leukemiceller, och fann att 20 av dem på ett effektivt sätt kan inducera apoptos i åtminstone en av de cancercellinjer. Här presenterar vi ett protokoll för screening av en heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska läkemedel mot blodcancer. Protokollet omfattar hur man skall konstruera sgRNA biblioteket, hur man bedöma effekten av varje sgRNA på cellviabilitet, och hur man further utvärdera de effektiva sgRNAs genom flödescytometri. Omkring 2000 träffar förväntas erhållas genom screening av fullskalig sgRNA bibliotek bestående av 16384 heptamerer.
Introduction
TRUE geners uttryck (benämnd efter tR Nase Zl - u tilizing e fficacious geners uttryck) är en av de RNA-styrda teknik geners uttryck 1. Denna teknik har utvecklats baserat på egenskaper hos tRNase Z L (eller 3 'tRNase), tRNA 3 "behandling endoribonukleas: det kan klyva alla mål-RNA vid eventuellt förväntat plats under ledning av en konstgjord liten guide-RNA (sgRNA) genom att erkänna en pre-tRNA-liknande eller mikro-pre-tRNA-liknande struktur som bildas mellan mål-RNA och sgRNA 2-9. sgRNA, som vanligtvis är 7-31 nt i längd, kategoriseras i fyra grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt linjär RNA, och krok-RNA.
Vi har visat att effekten av TRUE geners uttryck genom att införa olika artificiellt utformade sgRNAs i levande celler 10-15. Vi har också visat att sgRNAs kan tas upp av celler without eventuella transfektionsreagens och kan nedreglera deras mål-RNA-nivåer och / eller inducera apoptos i humana cancerceller 16 - 18. TRUE geners uttryck verkar fungera på den intracellulära och inter genreglerande nätverkssystem via tRNase Zl och naturliga sgRNAs 19 - 21.
Vi har konstruerat en sgRNA bibliotek innehållande 156 heptamer typ sgRNAs att söka efter potentiella terapeutiska heptamer-typ sgRNAs för blodcancer 22. Vi har screenas det för effekten på viabiliteten hos humana myelom och leukemiceller, och fann att 20 av dem på ett effektivt sätt kan inducera apoptos i åtminstone en av de cancercellinjer. Och fyra av dem har visat sig minska tumörtillväxttakt i mus xenograft experiment.
Här presenterar vi ett protokoll för screening av en heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska läkemedel mot blodcancer. Protokollet omfattar huratt konstruera sgRNA biblioteket, hur man bedöma effekten av varje sgRNA på cellviabilitet, och hur man ytterligare utvärdera effektiva sgRNAs genom flödescytometri. Analys för sgRNA cellulära mål RNA och utvärdering av effektiva sgRNAs i mus xenograft-modeller kan utföras i enlighet med konventionella metoder 17,22, även om dessa inte ingår i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion av en heptameren-typ sgRNA Library
- Välj en delmängd av de 16384 (4 7) 7-nt-sekvenser inte fullskale biblioteket ska byggas.
OBS: Sekvenserna kan vara slumpmässigt och / eller utformad för att inrikta sig på specifika cellulära RNA. För det senare hitta hårnålsstrukturer som liknar T-arm tRNA i en mål-RNA med hjälp av ett lämpligt datorprogram och / eller visuellt och välj sekvenser komplementära till 7-nt-sekvenser omedelbart nedströms av hårnålsstrukturerna 4,10, 17,18. - Syntetisera var och en av de valda heptamerer som en fullt 2'-O--methylated, 5'- och 3'-fosforylerade RNA med en DNA / RNA-syntesapparat. Använda fosforamiditmetoden på kontrollerad porglas (CPG) bärare, och lämna den 5'-terminala 4,4'-dimetoxitrityl (DMT) skyddande gruppen på i den sista cykeln (tillsatsen av 5'-fosfat) av syntesen 23.
OBS: Anpassad synthetic RNA kan även erhållas från oligonukleotid leverantörer. - Efter fullbordande av den sista syntescykeln, överföra CPG med den syntetiserade oligonukleotiden från kolonnen till en glasflaska med en Teflon-liner skruvkork, tillsätt 1 ml 29% ammoniumhydroxid, och inkubera den vid 55 ° C under 8 h för att klyva oligonukleotiden från CPG och avlägsna skyddsgrupperna från de baser och fosfater.
- Indunsta ammoniumhydroxid med en centrifugal indunstare vid 40 ° C och åter upplösa oligonukleotiden i 0,2 ml av 0,1 M n-hexylammonium acetat.
- Rena den syntetiska oligonukleotiden genom omvänd fas HPLC med användning av en polystyren-divinylbensen-kolonn med en buffert innehållande 10-50% acetonitril / 0,1 M n-hexylammonium acetat. Köra kolonnen vid 2,0 ml / min under 25 min vid 80 ° C.
- Lägga 0,25-0,5 ml koncentrerad ättiksyra till det fraktionerade provet (1-2 ml) för att göra en 20% ättiksyralösning, och incubate denna lösning under 1 h vid rumstemperatur för avlägsnande av DMT-gruppen.
- Torka provet med en centrifugal indunstare vid 40 ° C, åter upplösa den i 1 ml 29% ammoniumhydroxid, och inkubera lösningen under 15 min vid rumstemperatur för avlägsnande av sidokedjan i den 5 'fosfat.
- Minska volymen (1 ml) av provet till ca 0,3 ml med en centrifugal indunstare vid 40 ° C.
- Dialysera hela koncentrerade provet mot destillerat vatten (500 ml) med användning av ett dialysrör med en molekylviktsgräns 1000 vid 4 ° C över natten.
- Överför dialyserade provet från dialysröret till en 1,5-ml rör med en pipett, torka den med en centrifugal förångare vid 40 ° C, och därefter åter upplösa den i vatten för injektion-grade vatten, vars volym skall vara tillräckligt liten för att göra en större än 100 | iM lösning.
- Mäta en optisk densitet av RNA-provet vid 260 nm med en spektrofotometer och justera dess koncentration till 100iM genom tillsats av vatten-för-injektion-grade vatten. Lagra den RNA-lösningen vid under -20 ° C före användning.
2. Screening av sgRNA biblioteket för cellviabilitet
- Preparera 10 3 celler / 99 pl / brunn (t.ex., HL60 och RPMI-8226) på en 96-brunnars skål i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin-lösning. Förbered brunnar innehållande media endast för bakgrund subtraktion. För att eliminera kanteffekter, tillsätt sterilt vatten för att tömma brunnarna som omger provbrunnarna.
- Tillsätt 1 pl av heptamer-typ sgRNA (100 ^ M) löst i vatten-för-injektion-kvalitet vatten till varje brunn. Analysera varje sgRNA i tre exemplar. Inkubera plattan vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator under 3 dagar.
- Lägg en lämplig volym av en kommersiellt tillgänglig WST-8 lösning till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i samma inkubator under 1 till 4 tim.
- Mät absorbansen at 450 nm med en mikroplattläsare.
OBS: I de flesta fall tycks linearitet mellan absorbans och livskraftig mobilnummer som ska upprätthållas om absorbansvärdet överstiger 1,0.
3. Utvärdering av effektiv sgRNAs med flödescytometri
- Preparera 10 3 celler / 99 pl / brunn (t.ex., HL60) på en 96-brunnars skål i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin-lösning. Förbereda minst 10 brunnar för en sgRNA som skall testas. För att eliminera kanteffekter, tillsätt sterilt vatten för att tömma brunnarna som omger provbrunnarna.
- Tillsätt 1 pl av heptamer-typ sgRNA (100 ^ M) löst i vatten-för-injektion-kvalitet vatten till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator under 3 dagar.
- Samla upp cellerna behandlade med samma sgRNA från minst 10 brunnar i en 5-ml rör med en pipett. Snurra röret under 5 min i en centrifug vid 300 xg och kasta media.
- Tillsätt 2 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till röret, och återsuspendera cellerna. Snurra röret under 5 min i en centrifug vid 300 xg, och kassera PBS. Tillsätt 150 pl 1x annexin V bindningsbuffert till röret, och återsuspendera cellerna.
- Tillsätt 2 pl av fykoerytrin (PE) -konjugerat annexin V-lösning och 1 | il av 7-aminoactinomycin D (7AAD) lösning till röret, blanda dem väl och inkubera röret i 15 min vid rumstemperatur i mörker. Analysera provet med användning av en flödescytometer 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De sex heptamer-typ sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), och 5'-CACCAGC-3' (H13260) syntetiserades kemiskt som 2'-O-metyl-RNA innehållande 5'- och 3'-fosfater.
granskat dessa sgRNAs var för effekterna på lönsamheten för en human leukemi cellinje HL60 och en human myelomcellinje, RPMI-8226. Representativa resultat av cellviabiliteten analyser visas i figur 1. Den fyra sgRNAs H1885, H3277, H10927 och H13260 var mycket effektiv och minskade viabiliteten hos HL60 och RPMI-8226-celler med> 80% och> 70%, respektive. De heptamerer H3277 och H10927 testades också för effekterna på icke-cancer HEK293 cellviabilitet, och har visat sig knappast affect cellviabiliteten 22.
Flödescytometri med annexin V och 7AAD dubbel färgning utfördes för HL60-celler som behandlats med heptameren H1885, H3277, H10927, eller H13260. I varje sgRNA totalt cellantalet (56-95%) i tidiga och sena apoptotiska stadier var mycket högre än (4-6%) i mock (Figur 2). Dessa observationer tyder på att minskningen av HL60 cellviabilitet beror på apoptos.
Figur 1. Cell viabilitetsanalyser. Cellviabilitet mättes 72 h efter HL60-celler (A) eller RPMI-8226-celler (B) odlades i frånvaro eller närvaro av 1 ^ M av den nakna heptamer-typ sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, eller H13260. De relativa levande celltal i frånvaro av sgRNAs justeras till 100. Felstaplar indikerar SD (n = 3). *, P <0,002. Omtryckt från Leukemia Research, vol. 38, Takahashi M. et al., Screening av ett heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska medel mot hematologiska maligniteter, pp 808-815, Fig. 1, Copyright (2014), med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Flödescytometri. Med avseende på HL60-celler, flödescytometri utfördes med annexin V och 7AAD dubbel färgning. Cellerna analyserades 72 h efter odlades i frånvaro eller närvaro av 1 ^ M av den nakna heptamer-typ sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A), eller H10927 (B). Omtryckt från Leukemia Research, vol. 38, Takahashi M. et al., Screening av ett heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska medel mot hematologiska maligniteter, pp 808-815, Fig. 2, Copyright (2014), med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Anpassningsbar och Seamless Technology Transfer Program genom målstyrt FoU, Japan Science and Technology Agency, Science Research Promotion Fund från kampanjen och Mutual Aid Corporation för Privata skolor i Japan, och JSPS KAKENHI Grant Numbers 24300342 och 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
