Summary
Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft.
Abstract
TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z L - u tilizing e fficacious genet Slå) er en av RNA-rettet genet stanse teknologier, som benytter en kunstig liten guide RNA (sgRNA) til å veilede tRNA 3 'behandling endoribonuclease, tRNase Z L , for å gjenkjenne et target RNA. sgRNAs kan tas opp av cellene uten transfeksjon reagenser, og kan nedregulere sitt target-RNA-nivå og / eller induserer apoptose i humane kreftceller. Vi har vist en sgRNA bibliotek inneholdende 156 heptamer-type sgRNAs for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordan å konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan du kan further evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Rundt 2000 treff forventes å oppnås ved screening fullskala sgRNA bibliotek består av 16,384 heptamers.
Introduction
TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z L - u tilizing e fficacious genet Slå) er en av de RNA-rettet genet Slå teknologier 1. Denne teknologien har blitt utviklet basert på egenskapene til tRNase Z L (eller 3 'tRNase), tRNA 3' behandling endoribonuclease: det kan holde seg noen mål RNA når som forventet stedet i regi av en kunstig liten guide RNA (sgRNA) ved å anerkjenne en pre-tRNA-lignende eller mikro-pre-tRNA-lignende struktur dannet mellom target RNA og sgRNA 2 - 9. sgRNA, som vanligvis er 7-31 nt i lengde, er inndelt i fire grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineær RNA og RNA-krok.
Vi har vist effekt av TRUE genet Slå ved å innføre ulike kunstig designede sgRNAs i levende celler 10-15. Vi har også vist at sgRNAs kan tas opp av celler without noen transfeksjon reagenser og kan nedregulere sine mål RNA nivåer og / eller indusere apoptose i humane kreftceller 16 - 18. TRUE genet Slå ser ut til å fungere på den intracellulære og inter gennettverk system via tRNase Z L og naturlige sgRNAs 19 - 21.
Vi har konstruert en sgRNA bibliotek som inneholder 156 heptamer-type sgRNAs å søke etter potensielle terapeutiske heptamer-type sgRNAs for blod kreft 22. Vi har undersøkt den for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Og fire av dem har vist seg å redusere svulstvekstrater i mus xenograft eksperimenter.
Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordanå konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan man skal videre vurdere effektive sgRNAs av flowcytometri. Analyse for sgRNA cellulære mål RNA og evaluering av effektive sgRNAs i mus xenograft-modeller kan bli utført ifølge konvensjonelle fremgangsmåter 17,22, selv om disse ikke er inkludert i denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bygging av en Heptamer-type sgRNA Library
- Velg en undergruppe av 16,384 (4 7) 7-nt sekvenser med mindre fullskala bibliotek skal bygges.
MERK: Sekvensene kan være tilfeldig og / eller utformet for å målrette bestemte cellulære RNA. For den sistnevnte, finner hårnålstrukturer likner den T-arm av tRNA i en mål-RNA ved hjelp av et passende dataprogram og / eller visuelt, og ved å velge sekvenser komplementære til 7-nt-sekvenser umiddelbart nedstrøms for hårnålstrukturer 4,10, 17,18. - Syntetisere hver av de utvalgte heptamers som et fullt 2'-O-metylert, 5'- og 3'-fosforylert RNA med et DNA / RNA-synthesizer. Bruk fosforamiditt-metoden på kontrollert poreglass (CPG) støtte, og la den 5'-terminale 4,4'-dimetoksytrityl (DMT) beskyttende gruppe på i siste syklus (tilsetning av 5'-fosfat) i syntese 23.
MERK: Custom synthetic RNA kan også fås fra oligonukleotid-leverandører. - Etter fullførelse av den siste syntesesyklus, overføre CPG med det syntetiserte oligonukleotid fra kolonnen til en glassflaske med en teflonforing skrukork, tilsett 1 ml 29% ammoniumhydroksid, og inkuber det ved 55 ° C i 8 timer for å spalte oligonukleotidet fra CPG og fjerne de beskyttende grupper fra basene og fosfater.
- Fordampe ammoniumhydroksyd med en sentrifugefordamper ved 40 ° C og re-oppløsning av oligonukleotidet i 0,2 ml av 0,1 M n-heksylammoniumacetat.
- Rens det syntetiske oligonukleotid gjennom reversfase væskekromatografi ved bruk av en polystyren-divinylbenzen-kolonne med en buffer inneholdende 10-50% acetonitril / 0,1 M n-heksylammoniumacetat. Kjør kolonnen ved 2,0 ml / min i 25 min ved 80 ° C.
- Legg 0,25-0,5 ml konsentrert eddiksyre til den fraksjonerte prøve (1-2 ml) for å lage en 20% eddiksyreoppløsning, og incubate denne løsning i 1 time ved romtemperatur for å fjerne DMT-gruppen.
- Tørk prøven med en sentrifugefordamper ved 40 ° C gjenoppløses det i 1 ml 29% ammoniumhydroksid, og inkuber løsningen i 15 minutter ved romtemperatur for å fjerne sidekjeden av 5'-fosfat.
- Reduser volumet (1 ml) av prøven til 0,3 ml med en sentrifugal-fordamper ved 40 ° C.
- Dialyser den konsentrerte hele prøven mot destillert vann (500 ml) ved anvendelse av et dialyserør med en molekylvekt cut-off 1000 ved 4 ° C over natten.
- Overfør den dialyserte prøve fra dialyserøret til et 1,5 ml rør med en pipette, tørke den med en sentrifugefordamper ved 40 ° C, og deretter på nytt å oppløse det i vann-for-injeksjon grad av vann, hvis volum skal være liten nok til å gjøre en større enn 100 uM løsning.
- Måle en optisk tetthet på RNA-prøven ved 260 nm med et spektrofotometer og justere konsentrasjonen til 100uM ved tilsetning av vann-for-injeksjon grad av vann. Oppbevar RNA-oppløsning ved under -20 ° C før bruk.
2. Screening av sgRNA Bibliotek for celleviabilitet
- Fremstille 10 3 celler / 99 ul / brønn (for eksempel, HL60 og RPMI-8226) på en 96-brønners skål i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin-løsning. Forbered brønner som inneholder media bare for bakgrunnen subtraksjon. For å eliminere kanteffekter, legge sterilt vann å tømme brønner som omgir prøvebrønner.
- Tilsett 1 pl heptamer-type sgRNA (100 uM) oppløst i vann-for-injeksjon grad av vann til hver brønn. Analysen hver sgRNA i tre eksemplarer. Inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 3 dager.
- Tilsett en passende volum av et kommersielt tilgjengelig WST-8-løsning til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i den samme inkubator i 1 til 4 timer.
- Mål absorbansen ent 450 nm med en mikroplateleser.
MERK: I de fleste tilfeller vises linearitet mellom absorbans og levedyktig celle nummer skal opprettholdes med mindre absorbans verdien overstiger 1,0.
3. Evaluering av Effektiv sgRNAs ved flowcytometri
- Fremstille 10 3 celler / 99 ul / brønn (f.eks HL60) på en 96-brønners skål i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin-løsning. Tilberede minst 10 brønner for en sgRNA som skal testes. For å eliminere kanteffekter, legge sterilt vann å tømme brønner som omgir prøvebrønner.
- Tilsett 1 pl heptamer-type sgRNA (100 uM) oppløst i vann-for-injeksjon grad av vann til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 3 dager.
- Samle celler behandlet med den samme sgRNA fra minst 10 brønner i en 5 ml rør med en pipette. Spinne rør i 5 minutter i en sentrifuge ved 300 xg, og forkaste media.
- Tilsett 2 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) til røret, og re-suspendere cellene. Spinne rør i 5 minutter i en sentrifuge ved 300 xg, og kast PBS. Legg 150 mL av 1x annexin V bindingsbuffer til røret, og re-suspendere cellene.
- Tilsett 2 mL av fykoerytrin (PE) konjugerte annexin V-løsning og 1 ul av 7-Aminoactinomycin D (7AAD) oppløsning til røret, blande dem godt og inkuber røret i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Analysere prøven ved hjelp av et strømningscytometer 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De seks heptamer-type sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), og 5'-CACCAGC-3' (H13260) ble kjemisk syntetisert som 2'-O-metyl RNA inneholdende 5'- og 3'-fosfater.
Disse sgRNAs ble undersøkt for virkninger på levedyktigheten til en human leukemicellelinje HL60, og en human myelom-cellelinje, RPMI-8226. Representative resultater av cellenes levedyktighet analysene er vist i figur 1. De fire sgRNAs H1885, H3277, H10927, og H13260 var meget effektiv og redusert levedyktighet av HL60 og RPMI-8226-celler med> 80% og> 70%, respektivt. De heptamers H3277 og H10927 ble også testet for effekter på ikke-kreft HEK293 celle levedyktighet, og har vist seg å knapt affect den celleviabilitet 22.
Flowcytometri med annexin V og 7AAD dobbel farging ble utført for HL60 celler behandlet med heptamer H1885, H3277, H10927, eller H13260. I hver sgRNA, et totalt celletall (56-95%) i tidlige og sene stadier apoptotiske var mye høyere enn det som (4-6%) i mock (figur 2). Disse observasjoner antyder at reduksjonen av HL60 cellelevedyktighet skyldes apoptose.
Figur 1. celleviabilitet analyser. Cellelevedyktigheten ble målt 72 timer etter at HL60-celler (A) eller RPMI-8226-celler (B) ble dyrket i fravær eller nærvær av 1 pM av de nakne heptamer-type sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, eller H13260. De relative levende celle tall i fravær av sgRNAs er justert til 100. FeilLinjene indikerer SD (n = 3). *, P <0,002. Gjengitt fra Leukemi Research, Vol. 38, Takahashi M. et al., Resirkulering av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske midler mot hematologiske maligniteter, pp 808-815, fig. 1, Copyright (2014), med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. strømningscytometri. Med hensyn til HL60-celler, flow-cytometri ble utført med annexin V og 7AAD dobbel farging. Cellene ble analysert 72 timer etter dyrket i fravær eller nærvær av 1 pM av de nakne heptamer-type sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A), eller H10927 (B). Gjengitt fra Leukemi Research, Vol. 38, Takahashi M. et al., Resirkulering av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske midler mot hematologiske maligniteter, pp 808-815, fig. 2, Copyright (2014), med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Tilpasningsdyktig og sømløs Technology Transfer Program gjennom Target-drevet R & D, Japan Science and Technology Agency, Science Research Promotion Fund fra Kampanjen og Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan, og JSP KAKENHI Grant Tall 24300342 og 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
