Summary
在这里，我们提出了一个协议为七聚物型因组库潜在的治疗药物抗血癌的筛查。
Abstract
真基因沉默（TR核苷酸酶Ž 信用证后称为- U tilizingËfficacious基因沉默）是RNA指导的基因沉默技术，它利用的人造小导的RNA（因组）引导的tRNA 3'加工内切核糖核酸酶，tRNasežL的一个，以识别靶RNA。 sgRNAs可以采取由细胞没有任何转染试剂，可以下调它们的靶RNA水平和/或在人类癌细胞中诱导细胞凋亡。我们筛选含有156对人骨髓瘤和白血病细胞的生存力的影响七聚物型sgRNAs一个因组文库，并发现其中20能有效地诱导凋亡的肿瘤细胞株中的至少一种。在这里，我们提出了一个协议为七聚物型因组库潜在的治疗药物抗血癌的筛查。该协议包括如何构造因组文库，如何评估细胞生存力，以及各因组的效果如何复rther评估通过流式细胞仪的有效sgRNAs。约2,000命中预计将通过筛选的16,384七聚体构成的全规模因组文库来获得。
Introduction
真基因沉默（TR核苷酸酶Ž 信用证后称为- U tilizingËfficacious基因沉默）是RNA指导的基因沉默技术1中的一个。这种技术已经开发了基于tRNasežL（或3'tRNase），tRNA的3'加工核酸内切酶的特性：它可以通过识别切割的人造小导RNA（因组）的指导下，在任何预期的网站上的任何靶RNA 9 -靶RNA和因组2之间形成酰tRNA样前或微预tRNA的状结构。因组，这通常是7-31个核苷酸长，被分类为四组，5'-半酰tRNA，七聚体RNA，14-nt的线性RNA和钩的RNA。
15 -我们已经通过引入各种人为设计sgRNAs入活细胞10展示为TRUE基因沉默的效果。我们还表明，sgRNAs可以被细胞的Wi被吸收thout任何转染试剂，可以下调它们的靶RNA水平和/或在人类癌细胞16诱导细胞凋亡- 18。 TRUE基因沉默似乎就通过tRNasežL和自然sgRNAs 19细胞内和细胞间的基因调控网络系统的工作- 21。
我们已经构建了含156七聚物型sgRNAs一个因组文库以寻找潜在的治疗七聚物型sgRNAs对于血癌22。我们筛选其对人骨髓瘤和白血病细胞的生存力的影响，并发现其中20能有效地诱导凋亡的肿瘤细胞株中的至少一种。和他们的4已经显示减少在小鼠异种移植实验肿瘤的生长速率。
在这里，我们提出了一个协议为七聚物型因组库潜在的治疗药物抗血癌的筛查。该协议包括如何构造因组文库，如何评估细胞生存力，以及如何进一步通过流式细胞术评估的有效sgRNAs每因组的效果。可以根据常规方法17,22虽然这些未在此方案包括进行分析因组的细胞靶RNA和有效sgRNAs评价在小鼠异种移植模型。
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Protocol
1.一个七聚物型的构建因组库
- 除非满量程库是要构造选择16,384（4 7）7-核苷酸序列的子集。
注：序列可以是无规和/或设计为靶向特定的细胞的RNA。对于后者，发现发夹结构类似的tRNA的T形臂与立即的发夹结构4,10的下游7-核苷酸序列互补的合适的计算机程序和/或视觉，和选择的序列的辅助靶RNA， 17,18。 - 合成每个选定七聚体的作为完全2'-O-甲基化的，5'-和用DNA / RNA合成3'-磷酸化的RNA。使用的可控孔度玻璃（CPG）载体的亚磷酰胺法，并留下5'-末端4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMT）中的最后一个周期的保护上基（在加入5'磷酸）的合成23。
注意：自定义SYnthetic RNA可从寡核苷酸的供应商也能够得到。 - 最后合成循环结束后，在55℃下转移的CPG与从柱到用聚四氟乙烯衬垫螺帽玻璃小瓶中的合成的寡核苷酸中，添加氢氧化1毫升29％的硫酸铵，孵育它8小时到切割从CPG寡核苷酸和来自基地和磷酸盐除去保护基团。
- 蒸发氢氧化铵用离心蒸发器在40℃和在0.1M正己基为0.2ml乙酸重溶解该寡核苷酸。
- 使用聚苯乙烯 - 二乙烯基苯柱，用含10-50％乙腈/的0.1M正己基乙酸的缓冲液纯化通过反相高效液相色谱法合成的寡核苷酸。为2.0毫升，在80℃下运行柱/分钟25分钟。
- 添加0.25-0.5毫升浓乙酸至分馏样品（1-2毫升），使20％的乙酸溶液，并incuba德此溶液1小时，在室温下除去DMT基团。
- 在40℃干燥用离心蒸发器将样品，在氢氧化1毫升29％硫酸铵重新溶解，并在室温下孵育15分钟，该溶液以除去5'磷酸的侧链。
- 降低样品在40℃下的体积（1ml）中，以约0.3ml用离心蒸发器。
- 透析用分子量的透析管截止1000在4℃过夜对蒸馏水整个浓缩样品（500毫升）。
- 从透析管用吸管转移透析的样品，以1.5毫升管中，在40℃下用离心蒸发器干燥它，并随后在水中换注射级水重新溶解，其容积应小到足以使一个大于100微米的解决方案。
- 测量的RNA样品的光学密度在用分光光度计260nm处，并调整其浓度至100通过加入水换注射级水μM。 -20°C使用前存放在下面的RNA溶液。
2.筛选因组文库的细胞活力
- 制备10 3个细胞/ 99微升/孔（ 例如，HL60和RPMI-8226）上在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基的96孔培养皿中。准备包含媒介只为背景扣除井。消除边缘效果，添加无菌水到清空围绕样品井孔中。
- 加入1μl在水中溶解换注射级水至各孔七聚物型因组（100μM）的。测定每个因组一式三份。在3天，5％CO 2加湿培养箱中孵育该板在37℃。
- 添加市售的WST-8溶液以每孔的适当体积。孵育在37℃的板中进行1至4小时，以同一培养箱。
- 测量吸光度吨，酶标仪450纳米。
注：在大多数情况下，吸光率和存活细胞数之间的线性显示，除非吸光度值超过1.0要维持。
3.有效sgRNAs评价流式细胞仪
- 制备10 3个细胞/在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基的96孔培养皿99微升/孔（ 例如，HL60）。制备至少10井进行测试1因组。消除边缘效果，添加无菌水到清空围绕样品井孔中。
- 加入1μl在水中溶解换注射级水至各孔七聚物型因组（100μM）的。在3天，5％CO 2加湿培养箱中孵育该板在37℃。
- 收集具有相同的因组从至少10个孔处理到一个5毫升试管用移液器细胞。旋管5分钟在离心机中，在300 XG，弃媒体。
- 2毫升1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）添加到管中，并重新悬浮细胞。旋管5分钟在离心机中以300 xg离心，并弃去PBS。添加150微升1×膜联蛋白V结合缓冲液至管中，并重新悬浮细胞。
- 添加2微升藻红蛋白的（PE）缀合的膜联蛋白V溶液和1μl7氨基放线菌素D（7AAD）溶液于管，将它们混合均匀，并孵育管在黑暗中在室温下15分钟。分析用流式细胞仪24的流动的样品。
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Representative Results
六个七聚物型sgRNAs 5'-AUCUUCA-3'（H1885），5'-ACACACA-3'（H3277），5'-GGGGGCG-3'（H10927），5'-GGGGCCC-3'（H10944）， 5'-GCCCCCG-3'（H12287），和5'-CACCAGC-3'（H13260）作为含有5'-和3'-磷酸酯2'-O-甲基RNA的化学合成。
这些sgRNAs检查用于在人白血病细胞系，HL60和人骨髓瘤细胞系，RPMI-8226的存活力的影响。细胞活力测定法的代表性结果示于图1中 ，四个sgRNAs H1885，H3277，H10927和H13260是非常有效的，通过分别> 80％和> 70％，减少的HL60和RPMI-8226细胞的活力。的七聚体H3277和H10927还测试对非癌性的HEK293细胞生存力的影响，并已显示出几乎不AFFE克拉细胞活力22。
与膜联蛋白V和7AAD双染流式细胞仪是为与七聚体H1885，H3277，H10927或H13260处理HL60细胞进行。在每因组，在早期和晚期凋亡阶段总细胞数目（56-95％）是在模拟（ 图2）比（4-6％）高得多。这些观察表明，HL60细胞活力的减少是由于细胞凋亡。
图1.细胞活力测定。细胞活性测定72小时HL60细胞（A）或RPMI-8226细胞（B）分别为在不存在或裸七聚物型因组H1885的1μM，H3277，H10927存在下培养后， H10944，H12287或H13260。在没有sgRNAs的相对活细胞数调整到100错误条表示SD（N = 3）。 *，P <0.002。从白血病研究，卷转载。 38，高桥M。等 ，一个七聚物型因组库针对恶性血液病潜在的治疗剂，第808-815，图的筛选。 1，著作权（2014），爱思唯尔的权限。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.流式细胞术。对于HL60细胞，流式细胞仪用膜联蛋白V和7AAD双重染色进行。在没有或裸七聚物型因组H1885（A），H3277（A），H13260（A），或H10927（B）的1μM下培养后的细胞进行分析72小时。从白血病研究，卷转载。 38，高桥M。等 ，一个七聚物型因组库针对恶性血液病潜在的治疗剂，第808-815，图的筛选。 2，版权所有（2014），爱思唯尔的权限。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Acknowledgments
这项工作是由适应性和无缝技术转移计划，通过目标驱动的研发，日本科学技术振兴机构，从促进和互助公司为日本的民办学校学研究促进基金JSPS KAKENHI授权号码24300342和15H04313的支持， 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
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