Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

TRUE genet Slå: Screening av en Heptamer-type liten guide RNA bibliotek for potensielle kreft Terapeutiske midler

doi: 10.3791/53879 Published: June 2, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft.

Abstract

TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z L - u tilizing e fficacious genet Slå) er en av RNA-rettet genet stanse teknologier, som benytter en kunstig liten guide RNA (sgRNA) til å veilede tRNA 3 'behandling endoribonuclease, tRNase Z L , for å gjenkjenne et target RNA. sgRNAs kan tas opp av cellene uten transfeksjon reagenser, og kan nedregulere sitt target-RNA-nivå og / eller induserer apoptose i humane kreftceller. Vi har vist en sgRNA bibliotek inneholdende 156 heptamer-type sgRNAs for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordan å konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan du kan further evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Rundt 2000 treff forventes å oppnås ved screening fullskala sgRNA bibliotek består av 16,384 heptamers.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z L - u tilizing e fficacious genet Slå) er en av de RNA-rettet genet Slå teknologier 1. Denne teknologien har blitt utviklet basert på egenskapene til tRNase Z L (eller 3 'tRNase), tRNA 3' behandling endoribonuclease: det kan holde seg noen mål RNA når som forventet stedet i regi av en kunstig liten guide RNA (sgRNA) ved å anerkjenne en pre-tRNA-lignende eller mikro-pre-tRNA-lignende struktur dannet mellom target RNA og sgRNA 2 - 9. sgRNA, som vanligvis er 7-31 nt i lengde, er inndelt i fire grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineær RNA og RNA-krok.

Vi har vist effekt av TRUE genet Slå ved å innføre ulike kunstig designede sgRNAs i levende celler 10-15. Vi har også vist at sgRNAs kan tas opp av celler without noen transfeksjon reagenser og kan nedregulere sine mål RNA nivåer og / eller indusere apoptose i humane kreftceller 16 - 18. TRUE genet Slå ser ut til å fungere på den intracellulære og inter gennettverk system via tRNase Z L og naturlige sgRNAs 19 - 21.

Vi har konstruert en sgRNA bibliotek som inneholder 156 heptamer-type sgRNAs å søke etter potensielle terapeutiske heptamer-type sgRNAs for blod kreft 22. Vi har undersøkt den for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Og fire av dem har vist seg å redusere svulstvekstrater i mus xenograft eksperimenter.

Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordanå konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan man skal videre vurdere effektive sgRNAs av flowcytometri. Analyse for sgRNA cellulære mål RNA og evaluering av effektive sgRNAs i mus xenograft-modeller kan bli utført ifølge konvensjonelle fremgangsmåter 17,22, selv om disse ikke er inkludert i denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bygging av en Heptamer-type sgRNA Library

  1. Velg en undergruppe av 16,384 (4 7) 7-nt sekvenser med mindre fullskala bibliotek skal bygges.
    MERK: Sekvensene kan være tilfeldig og / eller utformet for å målrette bestemte cellulære RNA. For den sistnevnte, finner hårnålstrukturer likner den T-arm av tRNA i en mål-RNA ved hjelp av et passende dataprogram og / eller visuelt, og ved å velge sekvenser komplementære til 7-nt-sekvenser umiddelbart nedstrøms for hårnålstrukturer 4,10, 17,18.
  2. Syntetisere hver av de utvalgte heptamers som et fullt 2'-O-metylert, 5'- og 3'-fosforylert RNA med et DNA / RNA-synthesizer. Bruk fosforamiditt-metoden på kontrollert poreglass (CPG) støtte, og la den 5'-terminale 4,4'-dimetoksytrityl (DMT) beskyttende gruppe på i siste syklus (tilsetning av 5'-fosfat) i syntese 23.
    MERK: Custom synthetic RNA kan også fås fra oligonukleotid-leverandører.
  3. Etter fullførelse av den siste syntesesyklus, overføre CPG med det syntetiserte oligonukleotid fra kolonnen til en glassflaske med en teflonforing skrukork, tilsett 1 ml 29% ammoniumhydroksid, og inkuber det ved 55 ° C i 8 timer for å spalte oligonukleotidet fra CPG og fjerne de beskyttende grupper fra basene og fosfater.
  4. Fordampe ammoniumhydroksyd med en sentrifugefordamper ved 40 ° C og re-oppløsning av oligonukleotidet i 0,2 ml av 0,1 M n-heksylammoniumacetat.
  5. Rens det syntetiske oligonukleotid gjennom reversfase væskekromatografi ved bruk av en polystyren-divinylbenzen-kolonne med en buffer inneholdende 10-50% acetonitril / 0,1 M n-heksylammoniumacetat. Kjør kolonnen ved 2,0 ml / min i 25 min ved 80 ° C.
  6. Legg 0,25-0,5 ml konsentrert eddiksyre til den fraksjonerte prøve (1-2 ml) for å lage en 20% eddiksyreoppløsning, og incubate denne løsning i 1 time ved romtemperatur for å fjerne DMT-gruppen.
  7. Tørk prøven med en sentrifugefordamper ved 40 ° C gjenoppløses det i 1 ml 29% ammoniumhydroksid, og inkuber løsningen i 15 minutter ved romtemperatur for å fjerne sidekjeden av 5'-fosfat.
  8. Reduser volumet (1 ml) av prøven til 0,3 ml med en sentrifugal-fordamper ved 40 ° C.
  9. Dialyser den konsentrerte hele prøven mot destillert vann (500 ml) ved anvendelse av et dialyserør med en molekylvekt cut-off 1000 ved 4 ° C over natten.
  10. Overfør den dialyserte prøve fra dialyserøret til et 1,5 ml rør med en pipette, tørke den med en sentrifugefordamper ved 40 ° C, og deretter på nytt å oppløse det i vann-for-injeksjon grad av vann, hvis volum skal være liten nok til å gjøre en større enn 100 uM løsning.
  11. Måle en optisk tetthet på RNA-prøven ved 260 nm med et spektrofotometer og justere konsentrasjonen til 100uM ved tilsetning av vann-for-injeksjon grad av vann. Oppbevar RNA-oppløsning ved under -20 ° C før bruk.

2. Screening av sgRNA Bibliotek for celleviabilitet

  1. Fremstille 10 3 celler / 99 ul / brønn (for eksempel, HL60 og RPMI-8226) på en 96-brønners skål i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin-løsning. Forbered brønner som inneholder media bare for bakgrunnen subtraksjon. For å eliminere kanteffekter, legge sterilt vann å tømme brønner som omgir prøvebrønner.
  2. Tilsett 1 pl heptamer-type sgRNA (100 uM) oppløst i vann-for-injeksjon grad av vann til hver brønn. Analysen hver sgRNA i tre eksemplarer. Inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 3 dager.
  3. Tilsett en passende volum av et kommersielt tilgjengelig WST-8-løsning til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i den samme inkubator i 1 til 4 timer.
  4. Mål absorbansen ent 450 nm med en mikroplateleser.
    MERK: I de fleste tilfeller vises linearitet mellom absorbans og levedyktig celle nummer skal opprettholdes med mindre absorbans verdien overstiger 1,0.

3. Evaluering av Effektiv sgRNAs ved flowcytometri

  1. Fremstille 10 3 celler / 99 ul / brønn (f.eks HL60) på en 96-brønners skål i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin-løsning. Tilberede minst 10 brønner for en sgRNA som skal testes. For å eliminere kanteffekter, legge sterilt vann å tømme brønner som omgir prøvebrønner.
  2. Tilsett 1 pl heptamer-type sgRNA (100 uM) oppløst i vann-for-injeksjon grad av vann til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 3 dager.
  3. Samle celler behandlet med den samme sgRNA fra minst 10 brønner i en 5 ml rør med en pipette. Spinne rør i 5 minutter i en sentrifuge ved 300 xg, og forkaste media.
  4. Tilsett 2 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) til røret, og re-suspendere cellene. Spinne rør i 5 minutter i en sentrifuge ved 300 xg, og kast PBS. Legg 150 mL av 1x annexin V bindingsbuffer til røret, og re-suspendere cellene.
  5. Tilsett 2 mL av fykoerytrin (PE) konjugerte annexin V-løsning og 1 ul av 7-Aminoactinomycin D (7AAD) oppløsning til røret, blande dem godt og inkuber røret i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Analysere prøven ved hjelp av et strømningscytometer 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De seks heptamer-type sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), og 5'-CACCAGC-3' (H13260) ble kjemisk syntetisert som 2'-O-metyl RNA inneholdende 5'- og 3'-fosfater.

Disse sgRNAs ble undersøkt for virkninger på levedyktigheten til en human leukemicellelinje HL60, og en human myelom-cellelinje, RPMI-8226. Representative resultater av cellenes levedyktighet analysene er vist i figur 1. De fire sgRNAs H1885, H3277, H10927, og H13260 var meget effektiv og redusert levedyktighet av HL60 og RPMI-8226-celler med> 80% og> 70%, respektivt. De heptamers H3277 og H10927 ble også testet for effekter på ikke-kreft HEK293 celle levedyktighet, og har vist seg å knapt affect den celleviabilitet 22.

Flowcytometri med annexin V og 7AAD dobbel farging ble utført for HL60 celler behandlet med heptamer H1885, H3277, H10927, eller H13260. I hver sgRNA, et totalt celletall (56-95%) i tidlige og sene stadier apoptotiske var mye høyere enn det som (4-6%) i mock (figur 2). Disse observasjoner antyder at reduksjonen av HL60 cellelevedyktighet skyldes apoptose.

Figur 1
Figur 1. celleviabilitet analyser. Cellelevedyktigheten ble målt 72 timer etter at HL60-celler (A) eller RPMI-8226-celler (B) ble dyrket i fravær eller nærvær av 1 pM av de nakne heptamer-type sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, eller H13260. De relative levende celle tall i fravær av sgRNAs er justert til 100. FeilLinjene indikerer SD (n = 3). *, P <0,002. Gjengitt fra Leukemi Research, Vol. 38, Takahashi M. et al., Resirkulering av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske midler mot hematologiske maligniteter, pp 808-815, fig. 1, Copyright (2014), med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. strømningscytometri. Med hensyn til HL60-celler, flow-cytometri ble utført med annexin V og 7AAD dobbel farging. Cellene ble analysert 72 timer etter dyrket i fravær eller nærvær av 1 pM av de nakne heptamer-type sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A), eller H10927 (B). Gjengitt fra Leukemi Research, Vol. 38, Takahashi M. et al., Resirkulering av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske midler mot hematologiske maligniteter, pp 808-815, fig. 2, Copyright (2014), med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Tilpasningsdyktig og sømløs Technology Transfer Program gjennom Target-drevet R & D, Japan Science and Technology Agency, Science Research Promotion Fund fra Kampanjen og Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan, og JSP KAKENHI Grant Tall 24300342 og 15H04313 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom heptamer RNA Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge Transgenomic 99-3860
Water-for-injection-grade Water Otsuka Pharmaceutical  7131400A2129
RPMI-1640 medium Wako 189-02025
Fetal Bovine Serum SIGMA-ALDRICH 172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai Tesque 26253-84
96 Well Plate Greiner Bio-one 655 180
Cell Counting Kit-8 DOJINDO 343-07623 WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R TEKAN 510-82851
FACS Round-Bottom Tube BD Falcon 60819-820
Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 51-66121E
PE Annexin V BD Biosciences 51-65875X
7AAD SIGMA-ALDRICH A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur BD Biosciences 342973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. Caister Academic Press. 201-226 (2008).
  2. Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
  3. Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
  4. Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
  5. Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
  6. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
  7. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
  8. Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
  9. Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
  10. Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
  11. Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
  12. Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
  13. Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
  14. Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
  15. Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9, (114121), (2014).
  16. Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7, (38496), (2012).
  17. Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
  18. Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
  19. Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
  20. Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
  21. Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
  22. Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
  23. Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
  24. FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
  25. Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
TRUE genet Slå: Screening av en Heptamer-type liten guide RNA bibliotek for potensielle kreft Terapeutiske midler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).More

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter