Summary
Здесь мы приводим протокол для скрининга библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических препаратов против рака крови.
Abstract
ИСТИНА ген глушителей (называемый после того, как Tr Nase Z L - и tilizing е fficacious ген глушителей) является одним из РНК-направленной молчанием генов технологии, которая использует искусственный небольшой путеводитель РНК (sgRNA) для направления обработки эндорибонуклеазу Трнк 3 ', tRNase Z L , чтобы распознать РНК-мишени. sgRNAs может захватываться клетками без каких-либо реагентов трансфекции и могут подавляют их уровни РНК-мишени и / или индуцировать апоптоз в раковых клетках человека. Мы скринингу библиотеку sgRNA, содержащую 156 sgRNAs гептамер типа для влияния на жизнеспособность клеток костного мозга и клеток лейкемии человека, и обнаружили, что 20 из них могут эффективно индуцировать апоптоз по меньшей мере, одной из линий раковых клеток. Здесь мы приводим протокол для скрининга библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических препаратов против рака крови. Протокол включает в себя, как построить библиотеку sgRNA, как оценить влияние каждого sgRNA на жизнеспособность клеток, и как фуrther оценить эффективные sgRNAs с помощью проточной цитометрии. Около 2000 хитов, как ожидается, будут получены путем скрининга полномасштабной sgRNA библиотеку, состоящую из 16384 гептамеров.
Introduction
ИСТИНА ген глушителей (называемый после того, как Tr Nase Z L - U tilizing е fficacious ген глушителей) является одной из РНК-направленной молчанием генов технологий 1. Эта технология была разработана на основе свойств tRNase Z L (или 3 'tRNase), т - РНК 3' обработки эндорибонуклеазу: он может расщеплять любую РНК - мишень в любой ожидаемой площадке под руководством искусственного небольшой направляющей РНК (sgRNA) признавалось бы предварительно тРНК-подобных или микро-пре-тРНК-подобную структуру , образованную между РНК - мишени и 2 sgRNA - 9. sgRNA, которая, как правило, 7-31 нт в длину, подразделяется на четыре группы, 5'-половины тРНК, гептамер РНК, 14-нт линейной РНК, и крючок РНК.
Мы продемонстрировали эффективность ИСТИНА молчанием генов путем введения различных искусственно разработанных sgRNAs в живые клетки 10 - 15. Мы также показали, что sgRNAs могут быть приняты клетками Wiбез промежуточного каких - либо реагентов трансфекции и могут их уровни подавляют РНК - мишени и / или индуцировать апоптоз в раковых клетках человека 16 - 18. ИСТИНА ген глушителей , кажется, работает на внутри- и системы регулирующей сети межклеточное генов через tRNase Z L и природных sgRNAs 19 - 21.
Мы построили библиотеку , содержащую sgRNA 156 sgRNAs гептамер типа для поиска потенциальных sgRNAs терапевтических гептамер типа для рака 22 крови. Мы просеивают его влияния на жизнеспособность клеток костного мозга и клеток лейкемии человека, и обнаружили, что 20 из них могут эффективно индуцировать апоптоз по меньшей мере, одной из линий раковых клеток. И 4 из них было показано снижение темпов роста опухоли у мышей ксенотрансплантатных экспериментов.
Здесь мы приводим протокол для скрининга библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических препаратов против рака крови. Протокол включает в себя какпостроить библиотеку sgRNA, как оценить влияние каждого sgRNA на жизнеспособность клеток, и как дальше оценить эффективную sgRNAs с помощью проточной цитометрии. Анализ клеточных мишеней РНК sgRNA и оценка эффективных sgRNAs в мышиных моделях ксенотрансплантатов может быть выполнена в соответствии с обычными способами , 17,22, хотя они не включены в данном протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Построение гептамер типа sgRNA Библиотека
- Выберите подмножество 16384 (4 7) 7-нт последовательностей , если библиотека полномасштабная не будет построен.
Примечание: Последовательности могут быть случайными и / или предназначены для решения конкретных клеточных РНК. Что касается последнего, найти шпилька структуры , напоминающие Т-образную руку тРНК в РНК - мишени с помощью соответствующей компьютерной программы и / или визуально, и выберите последовательности , комплементарной 7-нт последовательностей непосредственно после шпилька структур 4,10, 17,18. - Обобщать каждого из выбранных гептамеров как полностью 2' - O - -methylated, 5'- и 3'-фосфорилированный РНК с синтезатором ДНК / РНК. Используйте метод фосфорамидитную на контролируемой порами стекла (CPG) поддержки, а также оставить 5'-концевой 4,4'-диметокситритил (DMT) защитной группы, в последнем цикле (добавление фосфата 5 ') синтеза 23.
Примечание: Пользовательские С.Ю.nthetic РНК могут быть также получены от поставщиков олигонуклеотидных. - После завершения последнего цикла синтеза, переноса CPG с помощью синтезированных олигонуклеотидных из колонки в стеклянной пробирке с завинчивающейся крышкой с тефлоновым вкладышем, добавляют 1 мл 29% гидроксида аммония, и инкубируйте при 55 ° С в течение 8 часов до расщеплять олигонуклеотид от CPG и удаления защитных групп из оснований и фосфатов.
- Выпаривают гидроксида аммония с центробежным испарителе при 40 ° С и повторно растворить олигонуклеотида в 0,2 мл 0,1 М раствора н-hexylammonium ацетата.
- Очищают синтетического олигонуклеотида путем обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием колонки, полистирол-дивинилбензола с буфером, содержащим 10-50% ацетонитрил / 0,1 М н-hexylammonium ацетат. Запустить колонку со скоростью 2,0 мл / мин в течение 25 мин при 80 ° C.
- Добавить 0,25-0,5 мл концентрированной уксусной кислоты к фракционированного образца (1-2 мл), чтобы получить 20% раствор уксусной кислоты, и ИнкубаторыТ.Е. этот раствор в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы удалить группу DMT.
- Высушить пробы с центробежным испарителе при 40 ° С, повторно растворяют его в 1 мл 29% -ного раствора гидроксида аммония, и инкубирование раствора в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы удалить боковую цепь фосфатом 5 '.
- Уменьшение объема (1 мл) образца до 0,3 мл с центробежным испарителе при 40 ° С.
- Диализировать весь Концентрированный образец против дистиллированной воды (500 мл) с применением диализной трубки с молекулярной массой отсечение 1000 при 4 ° С в течение ночи.
- Передача Диализированный пробы из диализной трубки к 1,5-мл пробирку с помощью пипетки, высушить его с центробежным испарителе при 40 ° С, а затем повторно растворить его в воде для инъекций степени злокачественности воды, объем которой должен быть достаточно мал, чтобы сделать раствор более чем 100 мкМ.
- Измерить оптическую плотность пробы РНК при 260 нм с помощью спектрофотометра и регулировать его концентрацию до 100мкМ путем добавления воды для инъекций степени злокачественности воды. Хранить раствор РНК при температуре ниже -20 ° C перед использованием.
2. Скрининг библиотеки sgRNA для Жизнеспособность клеток
- Подготовка 10 3 клеток / 99 мкл / лунку (например, HL60 и RPMI-8226) на блюдо 96-луночного в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина раствора. Подготовьте лунки, содержащие средства массовой информации только для вычитания фона. Для устранения краевых эффектов, добавить стерильную воду, чтобы очистить колодцы окружающей образец скважины.
- Добавить 1 мкл гептамер типа sgRNA (100 мкМ), растворенный в воде для инъекций степени злокачественности воды в каждую лунку. Пробирной каждый sgRNA в трех экземплярах. Инкубируйте планшет при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 увлажненном инкубаторе в течение 3 дней.
- Добавьте соответствующий объем коммерчески доступного раствора WST-8 в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 ° С в том же инкубаторе в течение 1 до 4 ч.
- Измерьте оптическую плотность AT 450 нм с помощью планшет-ридере.
Примечание: В большинстве случаев, линейность между поглощательной и числом жизнеспособных клеток, как представляется, сохраняется, если значение оптической плотности не превышает 1,0.
3. Оценка эффективного sgRNAs с помощью проточной цитометрии
- Подготовка 10 3 клеток / 99 мкл / лунку (например, HL60) на блюдо 96-луночного в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина раствора. Подготовьте по крайней мере 10 скважин для одного sgRNA для тестирования. Для устранения краевых эффектов, добавить стерильную воду, чтобы очистить колодцы окружающей образец скважины.
- Добавить 1 мкл гептамер типа sgRNA (100 мкМ), растворенный в воде для инъекций степени злокачественности воды в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 увлажненном инкубаторе в течение 3 дней.
- Сбор клеток, обработанных таким же sgRNA из, по крайней мере 10 скважин в 5-мл пробирку с пипеткой. Спин пробирку в течение 5 мин в центрифуге при 300 XG, и отказаться от средств массовой информации.
- Добавляют 2 мл 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в пробирку, и вновь приостановить клетки. Спин пробирку в течение 5 мин в центрифуге при 300 мкг, и отбрасывать PBS. Добавьте 150 мкл 1х аннексина V буфера связывания с трубкой, и вновь приостановить клетки.
- Добавьте 2 мкл фикоэритрин (PE) -conjugated аннексина V раствора и 1 мкл 7-aminoactinomycin D (7AAD) раствора в пробирку, хорошо перемешать и инкубировать трубку в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Проанализируйте пробу с использованием проточного цитометра 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шесть гептамер типа sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), и 5'-CACCAGC-3' (H13260) были химически синтезированы в виде 2'- O - метил РНК , содержащей 5'- и 3'-фосфаты.
Эти sgRNAs были исследованы на эффекты на жизнеспособность человека линии лейкозных клеток, HL60, и линии клеток человеческой миеломы, RPMI-8226. Типичные результаты анализов жизнеспособности клеток показаны на рисунке 1. Эти четыре sgRNAs H1885, H3277, H10927 и H13260 были очень эффективны и снижение жизнеспособности HL60 и RPMI-8226 клеток> 80% и> 70% соответственно. Гептамеров H3277 и H10927 были также протестированы на воздействии на нераковая жизнеспособности клеток НЕК293, и было показано, что с трудом Affeкт клетка жизнеспособность 22.
Проточной цитометрии с аннексина V и 7AAD двойное окрашивание проводили в течение HL60 клеток, обработанных гептамер H1885, H3277, H10927, или H13260. В каждом sgRNA, общее количество клеток (56-95%) , в ранних и поздних стадиях апоптоза была намного выше , чем у (4-6%) в ложном (рисунок 2). Эти наблюдения указывают на то, что снижение жизнеспособности клеток HL60 происходит из-за апоптоза.
Рисунок 1. Выживаемость клеток анализы. Жизнеспособность клеток измеряли 72 ч после того, как клетки HL60 (А) или RPMI-8226 - клеток (В) культивировали в отсутствие или в присутствии 1 мкМ невооруженного гептамера типа sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287 или H13260. Относительное количество живой клетки в отсутствие sgRNAs доводят до 100. Ошибкабары указывают на SD (n = 3). *, P <0,002. Печатается лейкемией Research, Vol. 38, Такахаши М. и др., Скрининг библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических агентов против гематологических злокачественных новообразований, рр 808-815, рис. 1, авторскому праву (2014), с разрешения Elsevier. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. проточной цитометрии. В отношении клеток HL60, проточной цитометрии проводили с аннексина V и 7AAD двойного окрашивания. Клетки были проанализированы 72 ч после того, как культивируют в отсутствие или в присутствии 1 мкМ невооруженного гептамера типа sgRNA H1885 (А), H3277 (А), H13260 (А), или H10927 (В). Печатается лейкемией Research, Vol. 38, Такахаши М. и др., Скрининг библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических агентов против гематологических злокачественных новообразований, рр 808-815, рис. 2, авторские права (2014), с разрешения Elsevier. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана адаптируемой и бесшовной технологии программы передачи через Target приводом R & D, Япония науки и технологии агентства, Научно-исследовательский фонд науки Продвижение от Корпорации по содействию и взаимной помощи для частных школ Японии, а числа ЯОРН KAKENHI Грант 24300342 и 15H04313 ,
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
