Summary
Här beskriver vi den detaljerade proceduren av intestinal ischemi-reperfusion hos möss som resulterar i reproducerbara skada utan dödsfall för att uppmuntra standardisering av denna teknik över fältet. Denna modell av intestinal ischemi-reperfusionsskada kan utnyttjas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer för skada och regenerering.
Abstract
Intestinal ischemi är ett livshotande tillstånd associerat med ett brett område av kliniska tillstånd innefattande ateroskleros, trombos, hypotension, nekrotiserande enterokolit, tarm transplantation, trauma och kronisk inflammation. Intestinal ischemi-reperfusion (IR) skada är en följd av akut mesenterialkärlsocklusion, som orsakas av otillräckligt blodflöde genom de mesenteriska kärlen, vilket resulterar i intestinal skada. Reperfusion efter ischemi kan ytterligare förvärra skador på tarmen. Mekanismerna för IR skada är komplexa och dåligt förstådda. Därför experimentella små djurmodeller är kritiska för att förstå patofysiologin för IR skada och utvecklingen av nya terapier.
Här beskriver vi en musmodell för akut tarm IR skada som ger reproducerbar skada på tunntarmen utan dödsfall. Detta uppnås genom att inducera ischemi i området för den distala ileum genom tidsmässigt occluding de perifera och terminala säkerheter grenar av mesenterica superior för 60 min med hjälp av mikrovaskulära klämmor. Reperfusion under 1 timme, eller två timmar efter skada resulterar i reproducerbara skada undersökas av histologisk analys tarmen. Korrekt position mikrovaskulära klipp är kritisk för förfarandet. Därför videoklippet ger en detaljerad visuell steg-för-steg beskrivning av denna teknik. Denna modell av intestinal IR skada kan användas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av skada och förnyelse.
Introduction
Tarmen är mycket känslig för avbrott i blodflöde vilket orsakar ischemi och epitelskada. Reperfusion efter ischemi ger re-syresättning av vävnaden, och kan ytterligare främja patologi. Därför är intestinal ischemi och reperfusionsskada associerad med ett brett spektrum av patologier, inklusive nekrotiserande enterokolit, allograftavstötning i tunntarmstransplantation, komplikationer av bukaortaaneurysm kirurgi, kardiopulmonal bypass, och inflammatorisk tarmsjukdom 1,2. Intestinal IR skada, särskilt akut mesenterialkärlsocklusion, är ett livshotande tillstånd som resulterar i sjuklighet och dödlighet 3.
Även om dåligt kända, är intestinal ischemi-reperfusion (IR) skada tros vara associerade med förändringar i tarmfloran samt produktion av reaktiva syreradikaler och inflammatoriska cytokiner och kemokiner 1,4-6. Detta leder till aktivering av både inate och adaptiva immunmekanismer som främjar inflammation och vävnadsskada 1,7,8.
Djurmodeller är avgörande för att förstå de mekanismer för IR skada, eftersom de möjliggör enkel GAIN- och förlust av funktions genetiska experiment. Flera djurmodeller av IR har utvecklats, vilka innefattar fullständig vaskulär ocklusion, låg flödesischemi, och segmenterade vaskulär ocklusion (sammanfattade i en nyligen omfattande översyn 9). Intestinal ischemi orsakad av fullständig vaskulär ocklusion av mesenterica superior (SMA) är ett enkelt och vanligt förekommande modell av IR i stora djur och gnagare 9-11. Men olika områden av tarmen har olika känslighet för skada. Dessutom varierat utbud av bedövningsmedel, smärtstillande medel, artärocklusion tekniker, liksom inkonsekvens i varaktigheten av ischemisk skada och återhämtning resulterar i varierande grad av skador confounding vår förståelse av biologi IR över flera studies. Tabell 1 visar dessa inkonsekvenser i murina IR studier. Den största nackdelen att använda kortare ischemiska gånger (30-45 min) riktar fönstret återhämtning på som kan observeras urskiljbara skillnader mellan fall och kontroller. Mild skada epitelet kan lösas en timme efter reperfusion, specialiserade patologiska mätvärden kan krävas för att hitta skillnader i epitelial restitution därför. I kontrast, överdriven skada, som sett av 100 min av ischemisk skada kan resultera i den kompletta denudement av epitelet, när restitution inte längre är möjlig, vilket ökar graden av dödlighet, och återhämtningstiden. Därför, här beskriver vi detaljerade förfarandet av tarm IR hos möss, vilket resulterar i reproducerbara skada utan dödsfall för att främja standardisering av denna teknik över vårt område. Denna modell av intestinal IR skada kan användas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av skada och förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier har utförts i enlighet med National Institute of Health riktlinjer och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommitté Trudeau Institute. 8-12 veckor gamla C57BL / 6-möss användes för studien.
1. Förberedelse för kirurgi
- Förbered och sterilisera kirurgiska instrument.
- Förbered isofluran baserade anestesisystemet med noskonen och uppvärmd pad. Se till att uppvärmd pad inte överhettas (<39 ° C).
- Se till att isofluran gas spolnings kapseln är rätt positionerat för att säkerställa att avgasportarna i botten av kapseln inte är blockerade eller tilltäppt på något sätt. Väg gas spolningsbehållaren före förfarandet och dokument vikt på kapseln. Kasta behållaren när behållaren vikt överstiger 50 g av ackumulerad vikt (~ 12 timmar).
2. Anestesi
- Söva mus med 3% isofluran i en induktionskammare (1 L / minO 2).
- Utvärdera anestesidjups av en oförmåga att förbli upprätt, förlust av målmedveten frivilliga rörelser, förlust av blinkreflex, muskelavslappning, och förlust av respons reflexstimulering (tå eller svans nypa med fast tryck).
- Bedöm andningsfrekvens och mönster genom att observera bröstkorgen och buken rörelser. Under optimal narkos ska andningsfrekvensen vara ~ 55-65 andetag per minut.
- Ta bort musen från induktionskammaren och snabbt raka buken området av musen.
- För att förhindra hornhinnan uttorkning, placera intetsägande oftalmologiska salva i ögonen.
- Placera musen på den uppvärmda kudden och ansluta den via noskonen till anestesisystemet. Se till att latex noskon membran passar ordentligt över huvudet av musen och det finns ingen läcka av isofluran.
- Minska isofluran hastigheten till 1,5%, och injicera buprenorfin (0,1 mg / kg) och ketamin (10 mg / kg) subkutant för att förhindra upplindning av den smärt kaskaden.
- torka the huden på operationsområdet med en steril bomullstopp indränkt med Betadine kirurgiska-lösning följt av 70% etanol.
3. kirurgi
- Gör en mittlinjen 3-5 cm laparotomi med drifts sax. Cover drift med steril icke-vidhäftande dyna som fuktats med saltlösning. Isolera blindtarmen och ileum och exponera den överlägsna mesenterica använder svabbar som fuktats i saltlösning.
- För att underlätta klipp ansöker, göra små hack i tarmkäxet kring den överlägsna mesenterica med fina iris scissors.To göra detta, försiktigt lyfta tarmen med dressing pincett och skär tarmkäx på båda sidor av den överlägsna mesenterica artär på önskat klipp läge (Figur 1A). Lägg sedan till några droppar steril koksaltlösning till området av önskat klipp läge innan de ansöker klipp.
Obs! För att utföra skenkirurgi, följer det kirurgiska ingreppet upp till steg 3,2. Applicera inte klipp. Istället hålla vävnaden fuktig efter inlagd varm saline såsom beskrivs i 3,6 under 1 timme. Efteråt vidare till steg 4,1, - Täppa till första ordningens grenar av mesenterica superior med mikrovaskulära klämmor (70 g kraft) med en klämanbringare att skapa en 5-7 cm område av ischemisk ileum intill blindtarmen (Figur 1B). Även placeringen av fartygen är konservativ, kan det finnas små variationer mellan möss (se exempel på figur 1). Därför är 2 eller 3 clips vanligtvis krävs (se var clipsen på Figur 1A, D, E, svarta pilar).
Obs: Använd högkvalitativa fartygs klipp. Högtrycks klipp kan skada fartyg och förhindra regenerering, medan lågtrycks klipp (<30 g) får inte helt blockera blodflödet. - Blockera säkerheter blodflödet genom tarmen med användning av två mikrovaskulära klämmor över fartyg (40 g kraft), demarking regionen för ischemisk tarmen (figur 1). Tilltäppning av kollaterala kärl erfordras för attförhindra blodtillförseln från intilliggande blodkärl (se var clipsen på Figur 1A, D, E, gröna pilar).
- Valfritt: Lägg heparinlösning (6 USP enheter / ml), för att förhindra blodproppar. Droppvis tillsätt 0,5 ml heparinlösning till den isolerade tarmen.
- Våta sterila icke vidhäftande pad ömtåliga våtservetter med saltlösning förvärmas till 37 ° C och gäller för operationsområdet. Se till att våtservetter förblir våt under hela proceduren.
- Behåll ischemi under 60 min med hjälp av 1-1,5% isofluran anestesi hela. Om ischemi förfarande utförs korrekt, kommer den ischemiska regionen ändras till vinröd färg i ca 30 min. Observera att blodkärlen distalt klippet läge förstoras under ischemi (figur 1, höger sida) indikerar framgångsrik ocklusion.
- Noga övervaka musen under ischemi stadiet. Fortsätta att gälla saltlösning till den icke-vidhäftande dyna som täcker operationsstället.
- markerakanterna av det ischemiska området genom att pipettera 20 pl Gill`s 3 hematoxylin på vävnaden för att underlätta skörd av ischemisk vävnad och angränsande frisk vävnad från samma mus för jämförelse (figur 1E, höger panel).
4. Reperfusion Stage
- Vid slutet av ischemi lägga några droppar saltlösning på klippet området och försiktigt bort mikrovaskulära klipp med klämmor. Sedan, tryck försiktigt tarmen tillbaka till bukhålan med hjälp av saltlösning fuktad bomull tips. Avlägsna icke-vidhäftande dynan och stänga bukväggen och hud med användning av 9 mm rostfritt stål sårklämmor. Om reperfusion utförs längre än tre timmar, använda ett absorber vicryl sutur för att stänga bukväggen innan de ansöker lindade klipp på huden.
- Upprätthålla möss i en upphettades ren bur för önskad tid (30 min, 60 min, 120 min, eller 180 min) för reperfusionsfasen.
- Kolla djur åtminstone var 30: e min för att försäkra stabiliteten.
- Euthanize möss genom CO 2 överdos följt av cervikal dislokation vid den önskade tidpunkten efter reperfusion.
- Öppna bukhålan och samla den ischemiska tarmvävnad för vidare analys. Skörd frisk normal vävnad intill den skadade vävnaden som en intern kontroll för att ta hänsyn till någon systemisk reaktion på skada.
Obs: Denna kontroll är mer lämpligt än skenopererade kontrollmössen eftersom skenopererade möss inte genomgår en systemisk reaktion på IR-inducerad skada. - Tvätta ur tarminnehållet med hjälp av 30 ml spruta med fastsatt sondmatning nål fylld med saltlösning och sedan klippa tarmen längdled. Önskas ett prov av tarmen för genuttryck analys, skär en 1,5 mm fragment i längdriktningen, och använda de återstående bit för histologisk analys.
- För histologisk analys, bereda en rulltårta med användning av en pincett för att rulla intestine.
- För att bibehålla den rullad form, placera bitarna av tarmen mellan biopsiskumdynor i vävnads kassetter (figur 2). Placera kassetterna i 10% buffrad formalin.
- Fixera vävnad i formalin under minst 24 h. Ersätta formalin med 70% etanol under ytterligare 24 h. Store vävnad i 70% etanol under obegränsad tid vid rumstemperatur.
- Bädda in i paraffin, skars 5 | j, m sektioner och fläcken med hematoxylin och eosin med hjälp av ett standardprotokoll (Figur 3).
6. Scoring
- Gör det murina ischemi-reperfusionsskada som sammanfattas i tabell 2. Välj en lämplig scoringmetod.
- Valfritt: Dela upp synfältet i fyra sektioner, eftersom skadans allvarlighetsgrad varierar under avsnittet.
- Beräkna medeltalet av varje avsnitt från poängen erhållna blint.
- Jämför betyget den skadade vävnaden mellan fall och kontroll samt att the oskadade vävnad med hjälp av en Kruskal-Wallis test, följt av en Dunns multipla jämförelser test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi optimerat experimentella protokollet IR operation för att erhålla reproducerbara IR-inducerad skada av ileum hos möss. Representativa resultat demonstreras i detta avsnitt.
Figur 1 visar exempel på mikrovaskulära klämmor position för att inducera ischemi i ileum. Svarta pilar visar läget på klipp täppa första ordningens grenar av mesenterica superior. Gröna pilarna visar positionen ytterligare klipp för att blockera blodtillförseln från kollaterala kärl. Notera ökade storleken på ockluderade kärl distalt om clipsen position och färgförändring av det ischemiska området av intestinte. Efter avlägsnande av klippen i slutet av ischemi blodkärl återfå blodflöde och återgå till normal storlek.
Figur 2 visar ett exempel på en vävnadskassett innehållande rulltårta ställdes från conkontroll och ischemiska områden av ileum efter 1 h av ischemi, följt av en 1 tim av reperfusion. En bit av mjälte ingick för att underlätta placering av kontroll och IR tarmen under bearbetning och färgning. Notera färgskillnaden mellan kontroll och ischemisk vävnad.
Figur 3 visar representativa hematoxylin och eosin-färgning av kontroll och ischemiska områden av ileum efter en timme av ischemi, eller en timme av ischemi följt av ett 2 h av reperfusion. Notera allvarliga skador på epitel efter en timme av ischemi kännetecknas av hemorragisk villi, epitel denudement med partiell till fullständig ablation av kryptor och immuncellinfiltration (asterisk). Efter en 2 h av reperfusion villi skada och inflammation kvarstår (asterisk), men det finns ingen vävnad blödning.
Figur 4 visar ett exempel på en analys av inflammatorisk cytokines uttryck på en timme och två timmar efter ischemi-reperfusion i ischemiska och kontroll tarmen. Notera uppreglering av mRNA-expression av TNF, IL-1b, IL-6 och CXCL2 vid 1 h och 2 h efter ischemi-reperfusion jämfört med kontroll frisk vävnad.
Figur 1: Induktion av ischemi använder Kärl Clips (A) isolerat område i tarmen innehåller blindtarmen och ileum.. Små nedskärningar i tarmkäxet kring den överlägsna mesenterica görs för att underlätta klipp ansökan. (B) Mikrovaskulära klipp program med klämmor. (C) Position av mikrovaskulära klipp på mesenterica superior att inducera ischemi. (D, E). Exempel på kärlstruktur och klipp positionering i olika möss. Pilar indikerar det ischemiska området av ileum präglas av hematoxylin. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:.. Vävnadsberedning för histologisk analys Tissue kassett innehållande rulltårta framställda av ischemiska och kontrollregioner av ileum efter en timme av ischemi följt av en en timme av reperfusion Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Hematoxylin och Eosin Färgning av Ileum efter ischemi Hematoxylin och eosin-färgning av kontroll- och ischemiska områden av ileum efter 1 h av ischemi, eller en timme av ischemi.följt av ett 2 h av reperfusion. Barer = 500 pm (krönskivor), 200 nm (bottenpanelema). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Expression av inflammatoriska cytokiner Under ischemi-reperfusion Expression av CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b mättes vid 1 h och 2 h efter ischemi-reperfusion i ischemisk vävnad (IR) och normal kontrollvävnad (C). intill det ischemiska området genom realtids-PCR. n = 3-8 möss per grupp, * p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Felstaplar representerar sem Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| murina Arter | Anestesi / analgesi | Artärocklusion metod | ischemi tid | Tid efter reperfusion | Referens | |||
| Sprague-Dawley-råttor | natriumpentobarbital | Ocklusion av SMA och celiaki artär med hjälp av aneurysm klämma eller klämma | 45 min | 2 tim | 12 | |||
| C57BL6 / 129 | 2% halotan | Ocklusion av mesenteriala arteriole, och de proximala och distala delarna av den ischemiska vävnaden. | 30 till 130 min | 6 tim | 13 | |||
| C57BL / 6 | Ketamin, Isofluran | Ocklusion av SMA använder aneurysmklämmor. Ocklusion av säkerheter Circulation vid den proximala och distala områden. | 1 hr | 1,5 tim | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | natriumpentobarbital | Ocklusion använder aneurysm klämma eller klämma | 40 min | 6 tim | 14 | |||
| C56BL / 6 | isofluran | Ocklusion av SMA och ileocolic artär med hjälp av aneurysm klämma eller klämma | 100 min | 1, 2, 4, 24 h | 15 | |||
| C57BL / 6 | uretan | Ocklusion använder aneurysm klämma eller klämma | 45 min | 60 min | 16 | |||
Tabell 1: Variationer i metodik i Murina Intestinal IR-inducerad skada
| histologi poängsystem | Referens | ||
| Klass 0: Normal slemhinna | 13,17,18 | ||
| Klass 1: subepitelial utrymme på villös spets | |||
| Klass 2: Mer förlängd subepitelial utrymme | |||
| Klass 3: Epitelial lyft längs villösa sidor | |||
| Grad 4: avklädda villi | |||
| Klass 5: Förlust av villi vävnad | |||
| Klass 6: Crypt lager infarkt | |||
| Klass 7: Transmukosal infarkt | |||
| Klass 8: Transmural infarkt | |||
| Klass 0: Normal slemhinna | 4,8,11,19-21 | ||
| Klass 1: sårskorpa av celler på villösa tips | |||
| Klass 3: Villi var frånvarande, men kryptor var fortfarande lätt detekterbar | |||
| Klass 4: total avsaknad av epitelceller strukturer och transmural nekros | |||
| Klass 0: Normal villus | 6,22-31 | ||
| Klass 1: Villi med spets distorsion | |||
| Klass 2: bägarceller och Gugenheims "utrymmen saknas | |||
| Grad 3: Villi med fläckvis störning av epitelcellerna | |||
| Klass 4: Villi med exponerade, men intakt lamina propria med epitelceller sårskorpa | |||
| Klass 5: lamina propria är vätskande | |||
| Klass 6: Villi som visnings blödning eller villi som är utblottad | |||
| Klass 0: Normal histologi 32,33 | |||
| Grad 1: Svag störning av ytepitelet | |||
| Klass 2: Epitelcellsproliferation förlust skada på villus spets | |||
| Klass 3: Mukös vasocongestion, blödning och fokal nekros med förlust av mindre än hälften av villi | |||
| Klass 4: Skador som sträcker sig till mer än hälften av villi | |||
Tabell 2: Histologi poängsystem i Murina Intestinal IR-inducerad skada
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av musmodeller av intestinal IR skada har förbättrat förståelsen av mekanismerna för vävnadsskada och hjälp i utvecklingen av potentiella terapeutiska strategier för att minimera vävnadsskador 7,9,11,34. De kritiska stegen i protokollet är korrekt placering av mikrovaskulära klipp korrekt tidpunkten för ischemi och korrekt histologisk utvärdering av IR-skada.
Varaktigheten av ischemi är kritisk för efterföljande epitelskada. Den typiska tid som krävs för att framkalla reproducerbara IR skada utan sjuklighet och dödlighet av experimentell möss är 45-60 minuter följt av en 2-3 tim reperfusion. Längre perioder av ischemi kan resultera i fullständig förlust av epitel och ökad dödlighet. Till exempel, i en grismodell av jejunal ischemi, 60 min ocklusion resulterade i partiell förlust av villa epitel, medan ocklusion under 120 min ledde till fullständig förlust av villus epitel 35. jagmportantly, kan bakteriefria och genetiskt manipulerade möss visar ökad känslighet för IR-skada, och därför optimal tid av ischemi och reperfusion kan behöva optimeras i preliminära experiment. Även typisk tid för utvärdering av vävnadsskada efter reperfusion är 2-3 timmar, längre tid (12 timmar) krävs för analys av tarmstamcellsmobilisering 36. Dessutom förändringar i kommenfloran och TLR / Nod-förmedlad signalering kan avsevärt påverka resultatet av IR skada 4,8,37-39.
Den rätta position mikrovaskulära klipp är också kritisk för reproducerbar IR skada. Här beskriver vi en modell av IR skada av den murina distala ileum. Distinkta delar av tarmen är kända för att visa olika känslighet för IR-skada. Till exempel, är jejunum mer känslig för IR-skada än ileum och colon 9,34,40. I själva verket, ischemi-reperfusion modell av jejunum genom att täppa till SMA med en endaklämma används ofta för att studera mekanismerna för IR skada (se ref. 9 för en omfattande genomgång av olika metoder för IR-skada hos djur). Emellertid varierar den exakta positionen av klämman och analysen av olika sektioner av tarmen, liksom olika metoder för anestesi mellan dessa studier, vilket gör det svårt att reproducera (se tabell 1). En ytterligare komplikation av IR skada jejunum är hög dödlighet position av den vaskulära klämman nära roten av SMA påverkar blodtillförseln till breda området tarmen. Därför, i den aktuella studien har vi utvecklat ett protokoll för att framkalla konsekvent IR skada terminal ileum, vilket är lätt att reproducera. För att inducera reproducerbara IR skada ileum, är rätt position av vaskulära klipp kritisk. Detta uppnås genom att tillsluta de perifera och sidogrenar av den överlägsna mesenterica artery.The grad av IR-skada kan bedömas genom utvärdering av hematoxylin och eosin ytor med original Chiu / Park eller modifierade poäng system 11,18,34,41,42. Dessutom kan utföras utvärdering av vävnadsskada med användning av terminalt deoxinukleotidyltransferas biotin-dUTP nick end-märkning (TUNEL) färgning av fragmenterat DNA, eller aktivt kaspas-3 immunohistokemisk färgning, analys av neutrofiler genom att mäta myeloperoxidasaktivitet eller immunohistokemisk utvärdering av neutrofiler med användning av Gr -1, eller Ly6G antikropp färgning 7,11. Inflammatoriska cytokiner och kemokiner, såsom IL-1b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2 kan CCL2 utvärderas genom realtids-PCR 2,4,8. Ett exempel på en analys av inflammatorisk cytokin uttrycket visas på figur 4.
Det är viktigt att notera att trots den höga reproducerbarhet och tillgänglighet IR skada av ileum, kan denna modell inte speglar alla kliniska tecken på sjukdom hos människor i särskilt kroniska tillstånd och villkor med partiell ocklusion av mesenterica superior 9 sjukdoms 9,43. Därför modeller med stora djur, såsom grisar utvecklas 9,44. Noggrant val av djurmodell beroende på människans villkor som studeras är kritisk. Sammanfattningsvis beskriver vi en enkel och robust modell av intestinal IR skada som kan användas för att studera cellulära och molekylära mekanismen för epitelial skada och regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ryska Science Foundation bevilja nr. 14-50-00060 och LLC RUSCHEMBIO. Detta arbete stöddes också av den Crohn`s och Colitis grunden av Amerika bevilja 294.083 (till AVT), och av NIH bidrag RO1 DK47700 (till CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
