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Medicine

肠缺血再灌注损伤的小鼠模型

Published: May 11, 2016 doi: 10.3791/53881

Summary

这里,我们描述肠缺血再灌注的小鼠中的详细过程,这导致在重现的损伤而不死亡率鼓励跨字段这种技术的标准化。肠缺血再灌注损伤的该模型可用于研究损伤和再生的细胞和分子机制。

Abstract

肠缺血是具有广泛的临床病症,包括动脉粥样硬化,血栓形成,低血压,坏死性小肠结肠炎,肠移植,创伤和慢性炎症有关的威胁生命的情况。肠缺血再灌注(IR)的损伤为急性肠系膜缺血的结果,通过肠系膜血管引起的血流量不足,导致肠损伤。再灌注缺血可能进一步加剧肠道损伤。 IR损伤的机制是复杂的和理解甚少。因此,实验小动物模型是了解缺血再灌注损伤的病理生理和新疗法的发展至关重要。

这里,我们描述急性肠道IR损伤,提供了小肠的重现性损伤而不死亡率的小鼠模型。这是通过诱导缺血远端回肠的区域由在时间上的occludin实现克用微血管夹子60分钟肠系膜上动脉的周边和终端侧枝。再灌注1小时后,或在通过组织学分析研究了肠的可再现伤伤结果后2小时。微血管剪辑的正确位置的程序是至关重要的。因此,视频剪辑提供这一技术的详细目视一步一步的说明。肠IR损伤的该模型可用于研究损伤和再生的细胞和分子机制。

Introduction

肠道是引起缺血和上皮损伤的血流量的中断非常敏感。缺血再灌注提供了组织的复氧,并能进一步促进病理。因此,肠缺血再灌注损伤是具有广泛的病状,包括坏死性小肠结肠炎,在小肠移植同种异体移植物排斥,腹主动脉瘤手术,心肺旁路和炎性肠病1,2-并发症相关联。肠缺血再灌注损伤,尤其是急性肠系膜缺血,是造成发病率和死亡率3危及生命的疾病。

虽然了解甚少,肠缺血再灌注(IR)的损伤被认为是与肠道菌群的变化以及产生活性氧和炎性细胞因子和趋化因子1,4-6相关联。这导致在这两种激活内特和促进炎症和组织损伤1,7,8适应性免疫的机制。

动物模型对于理解IR损伤的机制的关键,因为它们允许容易GAIN-和失功能遗传实验。已开发红外几种动物模型,其中包括完整的血管闭塞,低流量缺血和分段血管闭塞(在最近的一次全面回顾总结9)。引起肠系膜上动脉(SMA)的完整的血管闭塞肠缺血是IR的大型动物和啮齿动物9-11一个简单而常用的模式。然而,肠道的不同区域有不同的易感性伤害。此外,各种不同的麻醉剂,镇痛药,动脉阻塞技术,以及在可变程度的损伤缺血性损伤和恢复结果的持续时间不一致混杂我们的红外跨多个studie的生物学的理解秒。 表1展示了在小鼠IR研究这些不一致。从使用较短的缺血时间(30-45分钟),最大的缺点是针对在可观察的病例与对照组之间差异明显复苏的窗口。轻度损伤的上皮可以解决再灌注后一小时,因此专门病理指标可能需要找到在上皮恢复原状的差异。与此相反,过大的损坏,由100分钟缺血损伤所看到可能导致上皮,恢复原状不再可能的完整denudement,增加死亡率,和恢复时间。因此,在这里我们描述肠道IR小鼠的详细程序导致重复性的伤害死亡率不鼓励在我们领域这一技术的标准化。肠IR损伤的该模型可用于研究损伤和再生的细胞和分子机制。

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Protocol

动物研究按照健康准则全国学院进行,并由机构动物护理被批准,并使用特鲁多研究所委员会。 8-12周龄的C57BL / 6小鼠用于该研究。

1.准备手术

  1. 准备和消毒手术器械。
  2. 制备基于异氟醚麻醉系统的鼻锥,并加热垫。确保加热垫不会过热(<39℃)。
  3. 确保异氟烷气体清除罐被正确地定位,以确保排气口在所述罐的底部不被堵塞或以任何方式闭塞。称重之前对罐程序和文件重气体清扫罐。当罐的重量超过50g累计重量(〜12小时)的丢弃罐。

2.麻醉

  1. 麻醉小鼠,用3%异氟烷在感应腔室(1升/分钟O 2)。
    1. 通过无力评估麻醉深度,以保持直立,有目的的自主运动,眨眼反射消失,肌肉松弛,以及失去响应的损失反射性刺激(趾或尾掐以坚定的压力)。
    2. 通过观察胸壁和腹部的运动评估呼吸频率和模式。在最佳麻醉,呼吸速率应为每分钟55-65〜呼吸。
    3. 从感应腔除去小鼠,并迅速剃鼠标的腹部区域。
  2. 为预防角膜干燥,将平淡无奇的眼药膏在眼里。
  3. 放置在加热垫鼠标,它通过鼻锥连接到麻醉系统。确保胶乳鼻锥膜牢固地配合在小鼠头部并没有异氟烷的泄漏。
  4. 减少异氟烷率至1.5%,并注入丁丙诺啡(0.1毫克/千克)和氯胺酮(10毫克/千克)经皮下以防止疼痛级联的卷绕。
  5. 擦拭日e皮肤与手术优碘溶液,然后用70%乙醇浸泡消毒棉签操作区。

3.手术

  1. 做一个中线3-5厘米剖腹手术以经营剪刀。用无菌非粘附垫用生理盐水沾湿覆盖操作区域。隔离盲肠和回肠,用在盐水中浸湿的棉签暴露肠系膜上动脉。
  2. 为了方便剪辑应用,在周围用细光圈scissors.To做到这一点,肠系膜上动脉肠系膜做小缺口,轻轻抬起换药镊子肠道,并在需要的剪辑的位置上切断肠系膜上动脉两侧肠系膜( 图1A)。然后,施加片段之前添加无菌生理盐水几滴需要的剪辑的位置的区域。
    注意:要进行假手术,按照手术步骤执行到步骤3.2。不适用剪辑。相反,保持组织通过添加温暖湿润小号艾琳在3.6 1小时描述。随后,执行步骤4.1,
  3. 闭塞使用一个夹具施放创建相邻盲肠( 图1B)的缺血性回肠的5-7厘米区域微血管剪辑(70挤压力g)肠系膜上动脉的第一级分支。虽然船只的位置是保守的,有可能是小鼠之间的细微变化(参见图1的例子)。因此,2或3个片段,通常需要(参见图1A,D,E,黑色箭头的剪辑的位置)。
    注意:使用高品质的容器剪辑。高压剪辑会损害血管和防止再生,而低压剪辑(<30克)可以不完全阻断血流。
  4. 通过使用跨血管2微血管夹子(40克的力)的肠阻塞侧支血流,demarking缺血肠的区域( 图1)。侧支血管闭塞,需要防止从相邻血管的血液供应(参见图1A,D,E,绿色箭头的剪辑的位置)。
  5. 可选:添加肝素溶液(6 USP单位/ ml),以防止血液凝固。滴加到0.5肝素溶液毫升的离体肠管。
  6. 用盐水湿无菌非粘附垫娇嫩湿巾预先加热到37℃,并适用于手术区。确保湿巾在整个过程中保持湿润。
  7. 保持缺血使用整个1-1.5%异氟烷麻醉60分钟。如果正确地执行局部缺血过程中,局部缺血区域将在大约30分钟改变为酒红色的颜色。需要注意的是血管远侧夹子位置指示成功闭塞缺血( 图1,右图)中被放大。
  8. 密切监察在缺血阶段鼠标。继续适用盐溶液到非粘附垫覆盖所述手术部位。
  9. 标记缺血区的通过在组织上吸取20微升Gill`s 3苏木的边缘,以方便收获从同一小鼠的缺血组织和邻近的健康组织进行比较( 图1E,右图)。

4.再灌注阶段

  1. 在缺血的末尾添加上剪辑区域生理盐水滴几滴,轻轻取出微血管剪辑施夹。然后,用盐水湿润棉提示轻轻地推肠道回腹腔。除去非贴壁垫和关闭使用9个毫米的不锈钢伤口夹腹壁和皮肤。如果超过3小时进行再灌注时间越长,使用可吸收的薇乔缝合皮肤上施加缠绕剪辑之前关闭腹壁。
  2. 保持在加热的清洁笼子小鼠的灌注阶段的时间所需量的(30分钟,60分钟,120分钟,或180分钟)。
  3. 检查动物至少每30分钟,以确保稳定性。
  1. 用CO安乐死的小鼠2过量随后在所希望的时间再灌注颈脱位。
  2. 打开腹腔并收集作进一步的分析缺血性肠组织。邻接受伤组织作为内部对照以考虑到损伤任何全身反应收获健康的正常组织。
    注意:此控件是比较合适的比假手术的对照组小鼠,因为假手术小鼠不接受以IR-性损伤全身反应。
  3. 洗出用30毫升注射器填充以生理盐水,然后连接灌胃针切肠肠纵向内容。如果需要对基因表达分析小肠的样品,切1.5毫米片段纵向,并用于组织学分析的剩余片。
  4. 对于组织学分析,使用一对镊子来滚动INTEST准备了瑞士卷国家统计局。
  5. 维持轧制形式,放置肠中的多条组织盒活检泡沫垫( 图2)之间。放置在10%缓冲福尔马林卡匣。
  6. 修复组织在福尔马林中至少24小时。额外24小时替换用70%乙醇福尔马林。商店组织在70%乙醇无限期在室温下。
  7. 在石蜡中嵌入,切为5μm切片并用苏木精和曙红使用标准协议(图3)染色。

6.评分

  1. 分数鼠缺血再灌注损伤如表2。选择一个合适的评分方法。
  2. 可选:划分的视场分为四个部分,因为伤害的严重程度在整个一节有所不同。
  3. 从计算得到盲目得分每一部分的平均品位。
  4. 比较案件和控制之间的受损组织的档次以及为thE使用秩和检验测试,随后邓恩的多重比较试验没有受伤的组织。

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Representative Results

我们优化的IR手术的实验方案获得小鼠回肠的重现性IR损伤的作用。代表性的结果证明了在此部分。

图1示出微血管剪辑位置的例子以诱导回肠的缺血。黑色箭头显示夹闭肠系膜上动脉一级分支的主要片段的位置。绿色箭头表示的附加片段的位置,以阻止来自侧支血管的血液供应。注意闭塞血管远端片段位置和intestinte的缺血区域的颜色变化的大小增加。在缺血的血管的端部除去夹子后恢复血流,并返回到正常大小。

图2示出了从CON制备含有瑞士卷的组织盒的一个例子控制和缺血后的1小时回肠,再灌注的1小时的缺血区。被列入一块脾的处理和染色过程中便于控制和IR肠的定位。注意控制和缺血组织之间的色差。

图3示出控制和1小时后缺血或缺血再灌注的2小时的1小时的回肠的缺血区的代表苏木精和曙红染色。注上皮细胞的缺血后特征的出血性绒毛上皮denudement偏完成隐窝消融和免疫细胞浸润(星号)的1小时的严重损坏。的再灌注绒毛损伤和炎症一个2小时后仍然存在(星号),但目前还没有组织出血。

图4示出炎性CY的分析的一个例子在1小时和缺血性和控制肠缺血再灌注后2小时tokines表达。注意,TNF,IL-1β,IL-6和CXCL2 mRNA表达的上调在1小时和2小时后相比缺血再灌注,以控制健康组织。

图1
图1:采用血管夹缺血诱导 (A)含有盲肠和回肠肠的隔离区在包围肠系膜上动脉,肠系膜小切口的便利剪辑的应用程序。 (B)使用的施夹夹微血管应用。上肠系膜上动脉微血管剪辑(C)的位置来诱导缺血。 (D,E)。在不同的小鼠血管结构和夹子定位的例子。箭头表示通过苏木标记回肠的缺血区域。 <A HREF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:。组织准备组织学分析后含缺血再灌注的1小时1小时从回肠的缺血性和控制区域编制瑞士卷组织盒请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:苏木苏木缺血后回肠HE染色和后1小时缺血或缺血的1小时回肠的控制和缺血区的伊红染色再灌注的2小时。酒吧= 500微米(上图),200微米(下图)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:炎性细胞因子表达缺血再灌注 CXCL2,TNF,IL-6的表达,IL-1b的混合物在1小时和在缺血组织(IR)的缺血再灌注后2小时和正常对照组织(C)的测定期间。相邻通过实时PCR缺血区。 n = 3时 - 8每组小鼠,* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001。误差棒代表SEM 请点击此处查看该图的放大版本。

鼠科 麻醉/镇痛 动脉栓塞法 缺血时间 再灌注后时间 参考
Sprague-Dawley大鼠戊巴比妥钠用动脉瘤夹或钳SMA和腹腔动脉闭塞 45分钟 2小时 12
C57BL6 / 129 2%氟烷肠系膜动脉闭塞,及近端和缺血组织的远侧部分。 30至130分钟 6小时 13
的C57BL / 6 氯胺酮,异氟醚用动脉瘤夹SMA闭塞。抵押circul闭塞通货膨胀在近端和远端区域。 1小时 1.5小时 4,8,11
C3H / HEJ 戊巴比妥钠用动脉瘤夹或钳闭塞 40分钟 6小时 14
C56BL / 6 异氟醚用动脉瘤夹或钳SMA和回结肠动脉闭塞 100分钟 1,2,4,24小时 15
的C57BL / 6 聚氨酯用动脉瘤夹或钳闭塞 45分钟 60分钟 16

表1:变异方法论小鼠肠道IR损伤的作用

组织学评分系统 参考
0级:正常粘膜 13,17,18
1级:在绒毛上皮下尖空间
2级:更多的扩展空间上皮下
3级:沿着两侧绒毛上皮提升
4级:裸露的绒毛
5级:绒毛组织的损失
6级:地穴层梗死
7级:粘膜梗死
8级:跨壁梗死
0级:正常粘膜 4,8,11,19-21
等级1:绒毛提示细胞塌
3级:绒毛缺席,但隐窝仍然容易检测
4级:完全没有上皮结构和透坏死
0级:正常绒毛 6,22-31
1级:与绒毛尖失真
2级:杯状细胞和Gugenheims“空间缺失
3级:与绒毛上皮细胞的破坏片状
4级:与绒毛暴露,但完好的固有层上皮细胞脱落
5级:固有层渗出
6级:绒毛的显示出血或绒毛被剥蚀
0级:正常组织学 32,33
1级:表面上皮破坏轻微
2级:在绒毛上皮尖细胞损失伤害
3级:黏膜血管充血,出血,并用较少的损失比绒毛的一半局灶性坏死
4级:损伤延伸到绒毛多于二分之一

表2:组织学评分系统在小鼠肠道IR损伤的作用

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Discussion

肠道缺血再灌注损伤的小鼠模型的发展大大提高了组织损伤机制的理解和潜在的治疗策略的发展援助,以尽量减少组织损伤7,9,11,34。此协议的关键步骤是微血管剪辑的正确定位,缺血再灌注损伤的缺血和适当的组织学评价的正确时机。

缺血的持续时间是为后续上皮损伤是至关重要的。以诱导可重复的IR损伤无发病率和实验小鼠的死亡率通常所需的时间是45-60分钟,随后一个2-3小时的再灌注。缺血过长,则可能导致上皮和死亡率增加的完全丧失。例如,在空肠缺血猪模型,60分钟闭塞导致别墅上皮的部分损失,而闭塞120分钟导致绒毛上皮35的完全丧失。一世mportantly,胚芽和无遗传操作的小鼠可显示于IR损伤,缺血再灌注因此最佳时间增加的灵敏度,可能需要在初步实验进行优化。虽然对于再灌注后的组织损伤的评价典型时间是2-3小时,时间较长(12小时)所需的肠干细胞动员36的分析。另外,在共生菌群和TLR /点头介导的信号的变化可以显著影响的IR损伤4,8,37-39的结果。

微血管剪辑的正确位置也可重复缺血再灌注损伤的关键。在这里,我们描述了小鼠回肠远端的IR损伤模型。肠道的不同部分被称为显示给IR损伤的敏感性不同。例如,空肠是IR损伤比回肠和结肠9,34,40更敏感。事实上,空肠缺血再灌注模型由一个单一阻断SMA夹子通常用于研究IR损伤的机制(见文献9的动物中的IR-损伤不同的方法的全面综述)。然而,剪辑的精确位置和小肠的不同部分的分析,以及麻醉的方法不同,这些研究之间变化,使得难以再现( 见表1)。空肠的IR损伤的额外的并发症是高死亡率,因为血管夹接近SMA的根部的位置影响血液供应肠的广泛领域。因此,在目前的研究中,我们开发的协议以诱导回肠末端,这是很容易再现的一致IR损伤。为了诱导回肠可重放IR损伤,血管夹的适当的位置是至关重要的。这是通过阻断缺血再灌注损伤的肠系膜上artery.The程度的外设和侧枝达到可使用原照/ PAR HE染色切片的评估进行评估K或修改评分系统11,18,34,41,42。此外,可以使用片段化的DNA,或活性的caspase-3免疫组织化学染色,嗜中性粒细胞的分析的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色,通过测量髓过氧化物酶活性或使用的Gr嗜中性粒细胞的免疫组织化学的评估来执行组织损伤的评价-1,或Ly6G抗体染色7,11。炎性细胞因子和趋化因子,如IL-1β,TNF,IL-6,CXCL1,CXCL2,CCL2可以通过实时PCR 2,4,8进行评估。炎性细胞因子表达的分析的一个例子示于图4。

要注意的是,尽管高再现性和回肠的IR损伤的可达性,该模型可能无法反映人类疾病的所有临床迹象,特别是慢性疾病状况和对肠系膜上动脉9的部分闭塞的条件是非常重要的9,43在生产过程中的活性氧的水平。因此,在使用大型动物,如猪模型正在开发9,44。根据所研究的人类状况的动物模型的精心选择是至关重要的。总之,我们描述了可以使用来研究上皮损伤和再生的细胞和分子机制肠IR损伤的容易且稳健的模型。

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Acknowledgments

是由俄罗斯科学基金会支持这项工作,不授予。 14-50-00060和LLC RUSCHEMBIO。这项工作也是由美国Crohn`s和结肠炎基金会授予294083(至AVT),由美国国立卫生研究院授予RO1 DK47700(CJ到)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heated Pad Sunbeam E12107-819 Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine Vasco UCAP 0001-0000171 Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone Parkland Scientific ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge Parkland Scientific 80000, 80120
Induction Chamber Surgivet V711802
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-10 Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper  Oster  Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment Webster 8804604
Buprenorphine McKesson 562766 Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl) Pfizer NADA 45-290 Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips Puritan medical products 806-WC Autoclave before use
Betadine Purdue Products 67618-150-17 10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution Aspen 46066-807-60 Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer BIOSEB BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g Roboz Surgical  RS5424, RS5435 Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g Roboz Surgical  RS6472 Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps World Precision Instruments 14189 Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin Thermo Scientific 14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm Cell Point Scientific 201-1000
Autoclip applier Beckton Dickinson 427630
Byopsy foam pad Simport M476-1
Tissue cassette Fisher Healthcare 15182701A Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin Fisher Scientific 245-684
Surgical iris scissors World Precision Instruments 501263-G SC Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors World Precision Instruments 501219-G Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps Roboz Surgical  RS-5228, RS-8122 Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg Sigma 2106
Reflex wound clip removing forceps Roboz Surgical  RS-9263 Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile Coviden 1050
Fisherbrand transfer pipets Fischer Scientific 13-711-5AM Use pipets to dropwise add saline

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References

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肠缺血再灌注损伤的小鼠模型
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Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, More

Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (111), e53881, doi:10.3791/53881 (2016).

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