Abstract
Dans la présente étude, nous avons combiné un modèle de tumeur in vitro 3D poumon avec un modèle in silico pour optimiser les prévisions de la réponse aux médicaments basés sur un fond mutationnel spécifique. Le modèle est généré sur un échafaudage porcin décellularisé qui reproduit les caractéristiques spécifiques du tissu en ce qui concerne la composition de la matrice extracellulaire et de l'architecture comprenant la membrane basale. Nous avons standardisé un protocole qui permet la production d'un tissu tumoral artificiel dans les 14 jours, y compris trois jours de traitement médicamenteux. Notre article fournit plusieurs descriptions détaillées de 3D en lecture sur les techniques de dépistage , comme la détermination de l'apoptose de la prolifération index Ki67 coloration à partir de surnageants par M30-ELISA et l' évaluation de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), qui sont des outils utiles pour évaluer l'efficacité des des composés thérapeutiques. Nous avons pu montrer par rapport à la culture 2D une réduction de la prolifération dans notre modèle de tumeur 3D qui est related à la situation clinique. En dépit de cette prolifération inférieure, le modèle prédit EGFR -targeted réactions aux médicaments correctement en fonction de l'état des biomarqueurs comme le montre la comparaison des lignées de cellules de carcinome du poumon HCC827 (EGFR -mutated, KRAS-type sauvage) et A549 (EGFR de type sauvage, KRAS - muté) traité avec le gefitinib inhibiteur de la tyrosine-kinase (TKI). Pour étudier la réponse aux médicaments de cellules tumorales plus avancées, nous avons provoqué EMT par un traitement à long terme avec le TGF-bêta-1 évaluée par vimentine / pan-cytokératine coloration par immunofluorescence. Un débit-bioréacteur a été utilisé pour ajuster la culture à des conditions physiologiques, ce qui a amélioré la production de tissus. De plus, nous montrons l'intégration des réponses aux médicaments lors du traitement par le géfitinib ou de TGF-bêta-1 de stimulation - l' apoptose, l' indice de prolifération et EMT - en un booléen dans le modèle in silico. En outre, nous expliquons comment les réactions médicamenteuses de cellules tumorales avec un fond mutationnel précis et le nombreerstrategies contre la résistance peut être prédite. Nous sommes convaincus que notre approche 3D dans vitro en particulier avec son expansion en silico fournit une valeur supplémentaire pour le dépistage des drogues préclinique dans des conditions plus réalistes que dans la culture cellulaire 2D.
Introduction
L'industrie pharmaceutique est confrontée à des taux d'attrition élevés allant jusqu'à 95% dans le domaine du traitement du cancer en phase clinique entraînant des coûts énormes 1-5. Une des raisons de ce manque réside dans le fait qu'à l'heure actuelle l'efficacité des nouveaux composés potentiels est évaluée dans des projections à grande échelle sur des cultures de cellules 2D de lignées cellulaires de cancer ou chez des modèles animaux. Les modèles animaux ont une plus grande complexité , mais il existe des différences cruciales entre les souris et les hommes 6,7. Dans la dernière décennie, des modèles de cancer 3D en utilisant des approches différentes ont été générées pour combler le fossé entre la culture 2D de lignées de cellules cancéreuses et un complexe dans 6,8,9 de la tumeur in vivo. L'impact de l' environnement 3D sur la différenciation cellulaire et sur la signalisation a été démontré dans plusieurs études il y a des années (par exemple., Par Mina Bissell) 10,11. Aujourd'hui, de nombreux modèles de culture cellulaire 3D sont disponibles , telles que les cultures sphéroïdes, des hydrogels ou des puces microfluidiques 12-16. Même si thesmodèles e améliorent la complexité par rapport aux systèmes de culture 2D classiques, ils manquent la plupart du temps un microenvironnement de tissu qui est connu pour avoir des effets tumeur soutien et influe également sur l'efficacité des médicaments.
Pour résoudre ce problème, nous avons généré un modèle de tumeur 3D basé sur un échafaudage biologique appelé SISmuc (intestin grêle-muqueuse + muqueuse) qui est dérivé d'un jéjunum porcin décellularisé. De ce fait, l'architecture tissulaire et des composants importants de la MEC telles que les collagènes différentes, ainsi que la structure de la membrane basale sont conservées 17. Cette caractéristique unique est crucial pour la génération de modèle de tumeur de carcinome de l'épithélium qui se posent et constituent environ 80% des tumeurs solides. En outre, le taux de prolifération dans notre modèle de tumeur génie tissulaire est réduite par rapport aux taux artificiellement élevés obtenus dans la culture 2D. Comme la prolifération est un paramètre important dans l'évaluation de l'efficacité des médicaments, le dépistage des drogues est activé dans notre modèle plus procheconditions in vivo à des tumeurs 17.
Afin d'évaluer le potentiel de notre modèle pour prédire les biomarqueurs dépendant l' efficacité des médicaments correctement, nous les données ici présentes pour deux lignées différentes de cellules du cancer du poumon qui diffèrent par leur statut EGFR -biomarker. Ce statut mutationnel a commencé à déterminer systématiquement chez les patients atteints de CPNPC. Traitements ciblés avec ITK tels que l'EGFR -inhibitor gefitinib contre les tumeurs portant un activant l' EGFR mutation montrent des résultats supérieurs par rapport à ceux avec une chimiothérapie à base de platine 18-21.
Nous avons établi plusieurs techniques de lecture qui sont pertinents pour l'évaluation de l'efficacité du composé. En outre, après TGF-bêta-1 stimulation , nous sommes en mesure d'enquêter sur les actions de composés dans les cellules tumorales qui ont commencé le processus d'EMT, qui est considéré comme une étape importante dans la transformation maligne 22,23 et qui est relié à la drogue resistanCE 24.
Le modèle de tumeur 3D permettent le suivi des réponses spécifiques des cellules à des traitements ciblés, la chimiothérapie, ou des combinaisons de médicaments avec de bons contrastes. Pour améliorer et accélérer la drogue de dépistage et de rencontrer de la résistance, ceci est complété par une simulation de silico. Sur la base de quelques expériences, la réponse de la tumeur peut être prédit in silico quant à l'issue d'une gamme complète de médicaments et de leurs combinaisons.
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Protocol
1. bidimensionnelle (2D) Culture Cellulaire
- obtenir commercialement lignée cellulaire tumorale HCC827 (DSMZ). Culture de la lignée cellulaire d'adénocarcinome du poumon HCC827 (EGFR muté, de type sauvage KRAS) dans RPMI-1640 complété avec 20% de FCS. Changer le milieu tous les 2 - 3 jours. Diviser les cellules deux fois par semaine. Les cellules sont utilisées jusqu'à ce passage 20 est atteint.
- obtenir commercialement tumeur lignée cellulaire A549 (DSMZ). Culture du carcinome du poumon lignée cellulaire A549 (EGFR de type sauvage, KRAS muté) dans RPMI-1640 complété avec 10% de FCS. Effectuer la culture comme indiqué ci-dessus. Les cellules sont utilisées jusqu'à ce passage 20 est atteint.
- Testez les cellules régulièrement (tous les 4 - 6 semaines) pour les contaminations telles que les contaminations de mycoplasmes.
- La mise en culture des cellules A549 ou HCC827 sur des lamelles en verre
- Placer 1 lamelle de verre stérile dans chaque puits d'une plaque de 24 puits en utilisant une pince à épiler.
- les cellules tumorales de semences 50000 des deux lignées cellulaires dans un volume de 500 ul dans les puits avecles lamelles de verre, respectivement.
- La culture des cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 70% dans des conditions standard de culture (37 ° C; 5% CO 2). Pendant ce temps, aspirer l'ancien milieu à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter 500 pi de milieu frais tous les 2 - 3 jours de culture.
2. génération de systèmes de tumeur de test sur un collagène biologique Échafaudages
- Statique Conditions de culture
- Générer l'intestin grêle-muqueuse décellularisé + muqueuse (SISmuc) et le fixer entre deux anneaux métalliques, les couronnes dites cellules, comme décrit dans une publication précédente 25.
- 100 000 cellules de semence, soit HCC827 ou des cellules A549 dans un volume total de 500 pi sur le côté de l'ancienne lumière de l'intestin fixé dans les couronnes de cellules.
- Laisser les cellules tumorales à adhérer pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Ajouter 1 ml de milieu intérieur de la couronne cellulaire et 1 ml à l'extérieur.
- Culture de la tumeurmodèle dans des conditions statiques à 37 ° C, 5% de CO 2 dans l'incubateur pendant 14 jours. Changer le milieu de culture tous les 2 - 3 jours. Par conséquent, aspirer le milieu à l'aide d'une pipette Pasteur et la pipette 1 ml RPMI frais avec la quantité appropriée de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) à l'intérieur de la couronne de cellules et 1,5 ml du même milieu extérieur.
- Dynamique Conditions de culture
- Mettre en place le système de test de la tumeur avec la matrice décellularisé à l'intérieur des couronnes de cellules et l'ensemencement des cellules comme décrit au paragraphe 2.1.1 à 2.1.3.
- La culture le modèle de tumeur dans des conditions statiques à 37 ° C, 5% de CO 2 dans l'incubateur pendant 3 jours.
- Assembler le bioréacteur autoclavé et insérez le SISmuc ensemencée tel que publié antérieurement 25.
- Pipette 45 ml RPMI avec la quantité appropriée de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) dans le flacon et connecter le dispositif d'échantillonnage sans aiguille au système de tuyau entre le bioréacteur et leflacon moyen.
- Placer le bioréacteur dans l'incubateur, le raccorder à la pompe et de la culture le modèle de tumeur pendant 14 jours supplémentaires avec un flux moyen constant (3 ml / min) à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Changer le milieu de culture entière après 7 jours. Pour cela, déplacer le bioréacteur de l'incubateur sous une hotte à flux laminaire. Aspirer le milieu dans le flacon de support à l'aide d'une pipette Pasteur. Soulevez le bioréacteur tout en aspirant à se débarrasser du milieu dans le système de tuyauterie. Pipette 45 ml de milieu frais dans le ballon. Placez le bioréacteur de nouveau dans l'incubateur et le connecter à la pompe.
3. Le traitement du modèle de tumeur statique avec le géfitinib
- Culture du modèle de tumeur tel que décrit dans la section 2.1.
- Au jour 11 de la culture, de préparer RPMI / FCS avec 1 uM gefitinib (2,5 ml pour chaque couronne cellulaire). Aspirer l'ancien milieu des puits à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter 1 ml de prêt RPMI / FCS / gefitinib intérieur til couronne de cellules et 1,5 ml du même milieu extérieur.
NOTE: La solution gefitinib stock décongelé peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine. - Changer le support au jour 13 comme décrit au paragraphe 3.2.
4. La stimulation du modèle de tumeur statique avec le TGF-bêta-1 pour l'induction EMT
- Culture du modèle de tumeur tel que décrit dans la section 2.1.
- Au jour 3 de la culture, la préparation RPMI / FCS avec 2 ng / ml de TGF-bêta-1 avec un véhicule (2,5 ml pour chaque couronne cellulaire). Aspirer le milieu ancien des puits en utilisant une pipette Pasteur et ajouter 1 ml de RPMI préparé / FCS / TGF-bêta 1 à l'intérieur de la couronne de cellules et 1,5 ml du même milieu extérieur. Changement de milieu additionné de TGF-bêta-1 toutes les 2 - 3 jours jusqu'au jour 14, comme décrit sous 4.2.
5. Lire-outs
- Prélèvement d' échantillons pour les mesures ELISA
- Prélever des échantillons à partir des surnageants de statique (section 2.1) et (section 2.2) culture dynamique au cours detraitement par gefitinib (section 3) aux jours 11-14 de la culture comme indiqué dans la figure 2. En outre, prélever un échantillon avant le traitement (T0).
- Dans des conditions de culture statique, prendre 100 ul d'échantillon de l'intérieur de la couronne de la cellule. Dans des conditions de culture dynamique, visser la seringue sur le dispositif d'échantillonnage et de prendre 1 ml de milieu sur le système de bioréacteur. Stocker tous les surnageants recueillis à -80 ° C jusqu'à ce que le test ELISA est effectuée.
- M30-ELISA pour la quantification Apoptose
- Afin de quantifier l'apoptose dans les surnageants effectuer le test de la mort des cellules selon les instructions du fabricant. Laisser tous les réactifs atteindre RT avant d'effectuer le test.
- Vortex tous les réactifs. Dissoudre le comprimé de lavage dans 500 d'eau désionisée fraîche. Diluer HRP Conjugué avec 9,2 ml de Conjugate Dilution Buffer et mélanger. Pipette 25 ul d'étalon ou d'échantillon par puits.
- Ajouter 75 ul de la HRP Conju diluéesolution de porte par puits. Couvrir la plaque et incuber sur un agitateur pendant 4 heures à température ambiante. Laver la plaque manuellement, 5 fois avec 250 pi de solution de lavage préparée.
- Ajouter 200 ul de 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) à chaque puits. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 min. Ajouter 50 ul de solution d'arrêt à chaque puits. Agiter la microplaque pendant 10 secondes et laisser la microplaque pendant 5 minutes avant de lire l'absorbance. Déterminer l'absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques. Calculer la courbe standard et les concentrations dans les échantillons à l'aide d'un programme approprié pour le traitement des données de type ELISA, comme origine.
- Coloration de l' échantillon
- Fixation, Paraffin-enrobage et de la section Préparation du modèle 3D
- Fixer le SISmuc ensemencée en utilisant 2,5 ml de 4% paraformaldéhyde (PFA) par couronne cellulaire pendant 2 heures et l'intégrer dans la paraffine
- Préparer 3 um coupes de tissus pour la coloration telle que publiée précédemment25.
- Fixation des cellules cultivées en 2D conditions de culture
- Lorsque 70% de confluence est atteinte, laver les cellules cultivées sur des lamelles de verre en plaque de 24 puits une fois avec du PBS et les fixer avec 500 pi 4% PFA / puits pendant 10 min.
- Supprimer PFA et stocker les lamelles de verre dans les plaques à puits recouverte avec du PBS à 4 ° C jusqu'à ce que la coloration est effectuée.
- H & E Coloration
- Colorer les sections réhydratés avec hématoxyline / éosine comme une coloration aperçu selon les protocoles standards.
- Immunofluorescence du modèle 3D
- Pour immunofluorescence, effectuer une récupération d'antigène en plaçant les lames déparaffinées et réhydratées dans un cuiseur à vapeur avec un tampon citrate préchauffé (pH 6,0) pendant 20 min.
NOTE: Voir le tableau de matériel et d'équipement de la préparation du tampon citrate. - Transférer les lamesdans le tampon de lavage (tampon 0,5 M de PBS + 0,5% de Tween), des sections de cercle avec un stylo PAP pour minimiser le volume requis pour les solutions de coloration et de placer les lames dans une chambre d'humidité.
- Bloquer les coupes de tissu avec 5% de sérum de l'espèce hôte des anticorps secondaires utilisés dans le paragraphe 5.3.4.6 pendant 20 min à température ambiante.
- Retirer le sérum de blocage en tapotant doucement les lames dans un mouchoir en papier et appliquer l'anticorps primaire aux sections encerclées dans une dilution selon les instructions du fabricant (de lapin anti Ki67 1: 100, lapin anti vimentine 1: 100, souris anti pan-cytokératine 1 : 100). Incuber O / N à 4 ° C. Pour double coloration, des anticorps primaires de différentes espèces hôtes doivent être utilisés.
- Laver soigneusement hors anticorps non lié avec le tampon de lavage trois fois pendant 5 min.
- Pour la détection des liaisons antigène-anticorps spécifiques, appliquer des anticorps secondaires dans la dilution 1: 400 pour les sections et incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Laver unbolide anticorps avec un tampon de lavage à trois reprises pendant 5 min.
- Monter les lames avec un milieu aqueux contenant DAPI à noyaux et laisser contre-colorer les O sec / N.
- Pour immunofluorescence, effectuer une récupération d'antigène en plaçant les lames déparaffinées et réhydratées dans un cuiseur à vapeur avec un tampon citrate préchauffé (pH 6,0) pendant 20 min.
- Immunofluorescence des cellules cultivées en 2D
- Retirer du PBS et couvrir les têtes de série des lamelles de verre avec 0,2% de Triton-X100 dans du PBS pendant 5 min pour perméabilisation. Laver les lamelles de verre avec un tampon de lavage (tampon 0,5 M PBS + 0,5% de Tween) pendant 5 min.
- Effectuer les étapes 5.3.4.3 à 5.3.4.7. Exécuter toutes les étapes du bien-plaque sur une plate-forme à bascule et éliminer les réactifs en inversant la plaque.
- Pour le montage, repérer une goutte de milieu aqueux contenant DAPI à noyaux sur une contre-colorer lame de verre revêtue et transférer la lamelle à elle avec les cellules face au milieu de montage en utilisant une pince. Laissez sécher avant l'imagerie.
- Fixation, Paraffin-enrobage et de la section Préparation du modèle 3D
- Détermination de l' indice de prolifération
- Effectuer immunofluorescencecoloration contre Ki67 conformément à l'article 5.3.4. ou 5,3 5.
- Prendre des images fluorescentes des sections de tissus ou de cellules cultivées en 2D avec un microscope inversé. Utilisez des filtres différents pour prendre des images de colorations DAPI et de colorations Ki67. Pour la quantification, utiliser 10 images de sections 3D ou 5 images de 2D cultures (grossissement 20X) de chaque état des parties ne se chevauchent pas de l'échantillon.
- Déterminer le nombre de noyaux et le nombre de noyaux positifs pour Ki67 en 2D
- Comptez Ki67 noyaux positifs manuellement à l' aide du compteur de cellules de plugin du logiciel Fidji 26. Par conséquent, ouvrez l'image et cliquez sur "Plugins" → "Analyser" → "Cell Counter". Appuyez sur "Initialiser" et sélectionnez un type de compteur. Cliquez sur chaque noyau positif Ki67. Le nombre de clics est affiché à côté du type de compteur sélectionné.
- Pour le comptage automatique des cellules du nombre total de noyaux créer une macro en utilisant Fidji 27,28. Adjust la macro pour chaque ligne de coloration et de la cellule. Après, voir un exemple comment créer une macro.
- Lancer enregistreur de macros. Ouvrez un DAPI-image et de le convertir au format 8 bits en cliquant sur "Image" → "Type" → "8 bits". Cliquez sur "Améliorer le contraste", set 'saturé' «1» et «normaliser».
- Set "masque flou" pour affiner l'image. Utilisez un «rayon» de «1» et un «masque» de «0,60». Cliquez sur "seuil d'auto", choisir la méthode "RenyiEntropy" avec des «objets blancs sur fond noir» pour binariser l'image.
- Cliquez sur "Plugins" → "BioVoxxel" → "traits irréguliers du bassin versant» avec un rayon d'érosion de "5" pour séparer les cellules. Cliquez sur "Analyser" → "Analyser particules" et définir la «taille» à «0,02-Infinity".
REMARQUE: Le nombre de particules / cellules estindiqué dans le tableau sommaire en compte. - Cliquez sur "Créer" pour enregistrer macro pour l'analyse d'images supplémentaires.
- Déterminer le nombre de noyaux et le nombre de noyaux positifs pour Ki67 en 3D manuellement comme décrit au paragraphe 5.4.3.1.
- Calculer l'indice de prolifération moyenne (PI) selon la formule suivante:
n = nombre d'images (3D: 10, 2D: 5)
6. In Silico Tumor Modèle Génération et simulation de la thérapie EGFR Anti- dans les cellules HCC827
- Generation Network en utilisant un logiciel d' analyse de réseau
- Utilisez différentes bases de données connues pour générer le réseau de la tumeur sur la base des importants expérimentaux paramètres de lecture et de l'arrière-plan mutationnelle de la lignée cellulaire de HCC827.
- Ouvrir le logiciel d'analyse de réseau 21 pour visualiser leréseau.
- Cliquez sur "Fichier" → "Nouveau" type → 'modèles' JoVE_tumor → cliquez sur "OK" pour générer un nouveau réseau. Cliquez sur "Square Gros plan Nord" → "OK" pour visualiser le récepteur dans une double membrane. Cliquez sur "Protein générique" pour visualiser les nœuds (= protéines) que des rectangles → type 'EGFR' → cliquez sur "OK"; répéter cette opération pour chaque nœud du réseau.
- Etiqueter les noeuds du réseau: clic droit → "Changer la couleur & Shape ..." → sélectionner pour les noeuds EGFR et (EGF-EGFR) code couleur "255,0,0" (couleur rouge); pour les noeuds c-MET et (c-MET) code couleur "0,255,0" (couleur verte); pour gefitinib code couleur "255,255,0" (couleur jaune); pour PI3K-Inh code couleur "204204204" (couleur gris clair); pour MEK-Inh code couleur "102102102" (couleur gris foncé); pour tous les autres nœuds du code de sélection de couleur réseau4; 255,255,255 "(couleur blanche).
- Cliquez sur "Phénotype" pour visualiser les paramètres de lecture comme hexagones → type 'prolifération' → cliquez sur "OK" → clic droit → → code couleur sélectionnez "255204204" (couleur saumon) "... Changer la couleur & Shape"; répéter cette opération pour le paramètre apoptose → sélectionnez la couleur code "255,51,204" (couleur violet).
- Visualisez Edges (= interactions): Cliquez sur "Transition Etat" pour les activations (flèches), cliquez sur "Inhibition" pour inhibitions (flèches émoussées); répéter cette opération pour chaque interaction dans le réseau.
- Cliquez sur "Fichier" → "Enregistrer sous ..." → type 'JoVE_tumor models.xml' → cliquez sur "Enregistrer" pour enregistrer le réseau de signalisation généré comme .xml le format.
- In Silico Simulation utilisant SQUAD
NOTE: SQUAD représente ee la topologie du réseau en tant que système discret logique booléenne (AND, OR, NOT) et effectue une analyse régulière de l'Etat. L'analyse d'état stable reflète l'équilibre du système et la responsabilité sur des stimuli de signalisation (par ex., L' application de la drogue ou de mutation).- Ouvrez le logiciel SQUAD 17, Cliquez sur "Network Load" → upload 'JoVE_tumor models.xml' du fichier. Cliquez sur "Exécuter l'analyse":
NOTE: Ensuite, SQUAD applique la fonction exponentielle pour interpoler la connectivité réseau booléenne, qui permet la simulation dynamique du comportement du réseau au fil du temps (courbes d'activité sigmoïde de couleur). - Cliquez sur "Avancé" → "perturbateur" pour écrire un protocole de simulation. Simuler la résistance de l' EGFR anti: Cliquez sur "Modifier Protocole"
- Cliquez sur "perturbation" → utiliser standard "InitialState = SS-4" (état stable 4) → Cliquez sur "Ajouter" pour ajouter "nouvelle impulsion constante '→ Select paramètre "état" → Sélectionner cible "FLIP" → Choisir le temps "0" → Sélectionner la valeur "0,4" → Cliquez sur "OK".
- Répétez ceci: Cliquez sur "Ajouter" → Sélectionner le paramètre "Etat" → Sélectionner cible "c-MET" → Choisir le temps "0" → Sélectionner la valeur "0,4" → Cliquez sur "OK"; Cliquez sur "Ajouter" → Sélectionner le paramètre "Etat" → Sélectionner cible "gefitinib" → Choisir le temps "0" → Sélectionner la valeur "1" → Cliquez sur "OK".
- Définir une valeur d'état de nœud actif (EGF-EGFR): Cliquez sur "activenode" → Cliquez sur "Edit" → Choisir le "0.8" → Cliquez sur "OK"; pour tous les autres nœuds: Cliquez sur "Edit" → Sélectionnez l'état "0" → Cliquez sur "OK". Cliquez sur "OK" pour enregistrer le protocole.
- Afficher les courbes spécifiques: Accédez au panneau "Options" → Sélectionnez "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspases", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptose", "prolifération", "MEK-Inh" et "PI3K-Inh" pour la représentation graphique. Cliquez sur "Initialisation" → "Exécuter" pour lancer une simulation complète de la réponse du système. Cliquez sur "Reset" pour démarrer une nouvelle simulation.
- Simuler PI3K combiné et le traitement de l'inhibiteur MEK: Cliquez sur "Modifier Protocole"
- Utiliser le même paramètre de noeud comme décrit sous 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Cliquez sur "perturbation" → Cliquez sur "Ajouter" pour ajouter "nouvelle impulsion constante '→ Sélectionner le paramètre" Etat "→ Sélectionner cible" PI3K-Inh "→ Choisir le temps" 0 "→ Sélectionner la valeur" 1 "→ Cliquez sur" OK "; Cliquez sur "Ajouter"d'ajouter «nouvelle impulsion constante '→ Sélectionner le paramètre" Etat "→ Sélectionner cible" MEK-Inh "→ Choisir le temps" 0 "→ Sélectionner la valeur" 1 "→ Cliquez sur" OK ".
- Cliquez sur "OK" pour enregistrer le protocole. Accédez au panneau "Options": Utiliser les mêmes nœuds pour la représentation graphique comme décrit sous 6.2.2.4. Cliquez sur "Initialisation" → "Exécuter" pour lancer une simulation complète de la réponse du système. Cliquez sur "Reset" pour terminer la simulation.
- Ouvrez le logiciel SQUAD 17, Cliquez sur "Network Load" → upload 'JoVE_tumor models.xml' du fichier. Cliquez sur "Exécuter l'analyse":
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Representative Results
Sur la base de l'échafaudage SISmuc (figure 2A à C), nous avons établi un protocole opératoire normalisé pour la génération, la stimulation et le traitement d'un système de test de la tumeur 3D (figure 2D). Ce modèle permet la détermination de l'index de prolifération et la quantification de l' apoptose en utilisant M30-ELISA comme représenté sur la figure 1 et à la figure 3, respectivement. La figure 3 montre représentant coloration H & E de modèles A549 et HCC827 et une mesure de l' apoptose représentative avec le géfitinib. Le modèle présenté ici est conçu en utilisant l'exemple de l' EGFR NSCLC -mutated qui est traitée avec succès avec des inhibiteurs ciblés dans la clinique. De ce fait , seul le EGFR -mutated HCC827 cellules et non pas les cellules A549 répondent à l' inhibition de l' EGFR par le géfitinib de TKI dans notre modèle , tel qu'évalué par l'augmentation de l' apoptose. Figure 4 figure 5C et D. En outre , dans des conditions de culture dynamiques gefitinib a un effet important sur l' EGFR HCC827 -mutated (Figure 5D).
La figure 6 représente la topologie du réseau (figure 6A) et détaillée dans les simulations in silico de la résistance aux anti - EGFR dans les cellules HCC827 (figure 6B, C). Le réseau de signalisation a été générée en utilisant des bases de données connues de la littérature telles que hpjr, et KEGG QIAGEN (Genes & Pathways), ce qui entraîne une topologie de 42 noeuds et des arêtes 55, visualisées avec un logiciel de CellDesigner 26. La simulation du pilote connu une mutation EGFR (en rouge) et c-MET co-activation (en vert, valeur d' environ 0,7) montre un prol augmentétaux de iferation (courbe de saumon) et une diminution du taux d'apoptose (courbe violette) au fil du temps reflétant gefitinib (en jaune) résistance dans HCC827 cellules va de pair avec une activation de MEK et PI3K (figure 6B, vert foncé et cyan). La modélisation des résultats dans un retour de l'effet anti - résistance à l'EGFR PI3K combinée et de l' inhibiteur de MEK (sombre et courbes gris clair), réduit la prolifération et induit l' apoptose (Figure 6C).
Figure 1. Prolifération taux est réduit en 3D par rapport à la 2D culture cellulaire. Cellules HCC827 Ki67-positive (rouge A et B) ont été colorées en culture 2D cellulaire (A) et de la culture cellulaire 3D sur SISmuc (B). HCC827 cellules et les cellules A549 ont été comptées et l'indice de prolifération (pourcentage de cellules positives à Ki67) a été déterminée (C </ Strong>, un représentant compter sur cinq). Barres d'échelle en A et B:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. SISmuc Échafaudage Morphologie et annexe traitement avec le TKI gefitinib Les cellules sont ensemencées sur la SISmuc qui se compose de sous - muqueuse de l' intestin grêle (SIS) + muqueuse (A:. Clair, B: cellules DAPI colorées au - dessus du SISmuc C: superposition de A et B) et est fixé en couronnes de cellules au jour 0. Le schéma de traitement est représenté dans D: modifications moyennes (MC) sont effectuées tous les 2 à 3 jours. Au jour 11, le traitement commence. Les surnageants sont collectés et utilisés pour M30-ELISA afin de quantifier l' apoptose dans le temps (flèches bleues et des boîtes). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Gefitinib Changements de traitement de la croissance cellulaire sur la SISmuc et induit l' apoptose dans HCC827, mais pas dans la tumeur modèles A549 3D. Sans traitement, les deux lignées de cellules forment une monocouche sur la SISmuc (A et B) et de régler aussi anciennes structures de la crypte. Alors que le modèle de cellules A549 de croissance n'a pas été modifiée après le traitement avec le géfitinib (C), le nombre de cellules est réduite HCC827 accompagnée d'une modification à une forme de cellule allongée (D). L' apoptose est induite par gefitinib dans HCC827 modèles comme on le voit par des mesures M30-ELISA de surnageants de culture (E D:. 100 um A à D S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. TGF-bêta-1 Induit EMT dans HCC827 cellules sur la SISmuc. HCC827 cellules cultivées en 3D montrent une expression globale de pan-cytokératine (PCK) (vert A, a1) mais seulement des cellules individuelles expriment vimentine (rouge A, a2). Après que le TGF-bêta-1 de stimulation, les cellules changent de morphologie à une forme allongée et l'expression de la vimentine est fortement augmentée (rouge à B, B2), tandis que l'expression de la PCK est maintenue (vert B, B1). Barre d'échelle en B: 100 um A B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. dynamique de la culture cellulaire améliore les tissus de génération. Lorsqu'elle est cultivée dans des conditions 3D dans un bioréacteur (B), la monocouche à partir du modèle statique (A, H & coloration E) passe d'une monocouche (A) sur un tissu à couches multiples (C, coloration H & E ). HCC827 cellules présentent une réponse à un médicament solide lors d'un traitement au géfitinib (D, coloration H & E). Barre d'échelle dans D:. 100 um A, C, et D S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figue. 6. Silico Modèle de tumeur de génération et de simulation de la topologie de thérapie anti - EGFR résistance. Réseau d'une cellule tumorale avec des noeuds de signalisation clés en rouge (voie EGFR) et vert (c-MET) et leurs noeuds en aval. La tumeur caractéristique de lecture des paramètres prolifération (dans le saumon) et l'apoptose (en violet) sont représentés comme hexagone. Les flèches indiquent l'activation, des flèches émoussées inhibition. Les cibles thérapeutiques sont représentées par des rectangles gris sombres et claires, l'inhibition par gefitinib est représenté en jaune (A). Simulation dynamique par e-fonctions (courbes colorées) interpoler la connectivité réseau booléenne (AND, OR, NOT). EGFR et c-MET co-expression provoque une résistance de gefitinib comme indiqué par une augmentation de la prolifération (courbe de saumon) et adiminution de l' apoptose (courbe violette) après environ arbitraire du temps point 8 (B). Tacles potentiels de thérapie à la fois PI3K et MEK par des inhibiteurs (sous la courbe jaune, même activation, voir le protocole). (C) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons établi un combiné in vitro / in silico système de test de la tumeur pour les prédictions de traitement biomarqueurs guidée. Le modèle in vitro évalue les différents aspects importants de l' action de composés tels que des modifications de la prolifération des cellules tumorales et de l' apoptose sur un fond mutationnelle spécifique qui peut également être simulé in silico 17. Ici, nous présentons le protocole standardisé pour la 3D génération de modèle de tumeur et de test de composé , y compris la quantification de la prolifération et de l' apoptose et la mise en place d'un modèle prédictif de silico. Le modèle de tumeur 3D est basée sur des lignées cellulaires tumorales portant des mutations spécifiques. Les cellules sont cultivées sur une matrice tissulaire dépourvue de cellules en couronnes de cellules. Matrice décellularisation, la fixation entre les deux anneaux métalliques (couronnes de cellules), l' assemblage du système de bioréacteur ainsi que l' ensemencement de l'échafaudage ont été visualisées dans JoVE avant le 25.
In vitro Tumeur 3D Model
La traduction des résultats ici obtenus dans la clinique exige une sélection minutieuse des cellules tumorales appropriées portant des mutations d'intérêt afin de classer les patients en fonction de biomarqueurs pour les médicaments ciblés sélectionnés. Pour la médecine stratifiée, l' identification des mutations du pilote druggable par séquençage de prochaine génération est une préoccupation majeure en particulier dans le CBNPC et nous espérons révéler de nouveaux marqueurs génétiques à l'avenir 29. Pour les essais in vitro, le composé d'intérêt devrait cibler un site qui est très actif dans la lignée cellulaire choisie ou dans des cellules primaires. Ici, les lignées cellulaires A549 et HCC827 ont été choisis en raison de leur différence de statut mutationnel de l' EGFR et l' hypersensibilité rapportées (HCC827 cellules) et la sensibilité intermédiaire (cellules A549) vers le gefitinib de TKI en culture 2D 30-32. Dans la première étape de génération de modèle 3D de la tumeur, le nombre et la culture cellulaire pendant la tumeur choisie cellules doivent être ADJUsted si les cellules différentes de l'ici mentionnés sont utilisés. Pour trouver la concentration du composé optimal, il est conseillé de déterminer la valeur IC50 à l'aide d'un test de viabilité disponible dans le commerce en 2D. Sur la base de ce test, le composé doit être utilisé dans la concentration IC50 et la prochaine plus grande concentration dans les modèles 3D. Nous avons choisi trois jours de traitement, d'une part, afin d'obtenir des résultats dans les deux à trois semaines pour la comparaison facile à 2D systèmes de test de la tumeur d'autre part. Toutefois, les périodes de traitement peuvent être prolongés pour enquêter-terme des effets à long terme. Néanmoins, il doit être considéré que le traitement à long terme ou à des doses élevées du composé testé peut provoquer une perte complète des cellules en empêchant ainsi l'évaluation de la prolifération ou d'autres marqueurs immunohistochimiques.
Pour l'analyse de réseau de signalisation fiable, les réponses tumorales lors d'un traitement avec un certain composé doivent être analysés en distinguant entre la prolifération et de l'apoptosis. Ces postaux lus sont connectés différemment dans le réseau de signalisation. Ainsi, une analyse distincte des deux paramètres permet une meilleure compréhension de l'action de la drogue et la prédiction de cible ultérieure. Comme mentionné précédemment, la prolifération des cellules tumorales est réduite dans notre modèle 3D par rapport aux conditions de culture 2D et donc, devrait réduire les résultats faux-positifs des composés cytostatiques testés. Pour la détermination de l'indice de prolifération, le nombre total de noyaux et le nombre de noyaux positifs pour la coloration de Ki67 doivent être quantifiés en utilisant le logiciel Fiji par exemple. Cela peut être simplifiée par l'utilisation de macros dans les cultures 2D de cellules tumorales qui est, cependant, pas possible si les cellules forment des agrégats serrés comme cela se traduit par des nombres inférieurs ou supérieurs des noyaux, respectivement. Dans tous les cas, les paramètres macro doivent être soigneusement ajusté pour chaque lignée cellulaire et la coloration. L'apoptose peut être quantifié de manière non invasive à partir des surnageants de mesure de la cytokératine caspase-18 clivée, which est restreinte aux cellules avec des caractéristiques épithéliales, en utilisant M30-ELISA. Cela présente plusieurs avantages: i) Elle permet de surveiller l'efficacité du traitement au cours du temps et pour identifier le point d'un traitement efficace de départ. II) Les échantillons ne sont pas détruits et peuvent être utilisés pour d'autres techniques de lecture. III), l'apoptose des cellules épithéliales peut être distinguée de l'apoptose mésenchymateuse, qui est optimale dans les milieux de co-culture. Cette technique, cependant, pourrait être inappropriée pour les cellules tumorales qui ont subi EMT, perdant ainsi leur phénotype épithélial. Ainsi, l'expression de la cytokératine 18 de chaque lignée de cellules tumorales utilisées doivent être vérifiées par l'avant colorations immunohistochimiques cette technique est appliquée. Essai des composés peut également être réalisée dans une souche tumorale phénotype cellulaire plus semblable. Habituellement, dans le dépistage des drogues différentes étapes invasives sont négligées, même si la plupart des médicaments ciblés, tels que les ITK, sont appliquées dans les stades de tumeurs plus avancées. Notre modèle permet l'étude de invasive ou nonles cellules tumorales n-invasive, en raison de la membrane basale conservé 17 dont les cellules doivent traverser au cours du processus d'invasion. Une étape cruciale vers la motilité cellulaire et l' invasivité est EMT qui peut être induite dans différents modèles de cancer du poumon par la stimulation avec le TGF-bêta-1 17,33. Cependant, cela réduit la prolifération et par conséquent le nombre de cellules sur l'échafaudage. Cet effet secondaire négatif peut être contourné par l'application de conditions de culture dynamique qui augmente fortement la densité des cellules de la tumeur dans les modèles 3D. Même si le bioréacteur ajuste la culture à des conditions physiologiques, il doit être considéré que les propriétés cellulaires et la signalisation peuvent être influencées par l'exposition à une contrainte de cisaillement 25.
Le dépistage des drogues Utilisation in silico Simulations pour accélérer Cell-ligne spécifique
Bien que semi-quantitative, la séquence des événements est correctement modélisé par notre modèle de silico par des soinsprendre pleinement en considération les mutations connues pour chaque lignée cellulaire spécifique. Cela inclut la lignée cellulaire des modifications spécifiques des différents niveaux d'activation du récepteur, la mesure dans laquelle intervient kinases sont activées quand et pendant combien de temps la sortie de réseau tel que l'apoptose ou de la prolifération est à prévoir. Par exemple, on peut considérer cliniquement connus amplifications c-MET qui sont censés se produire dans environ 20% de l' EGFR anti acquise la thérapie résistance 30. Par la suite, le modèle in silico calcule le comportement du réseau correspondant au fil du temps, par exemple., Le développement de la résistance à l'gefitinib représenté par une prolifération accrue et une diminution de l' apoptose. Dans notre modèle, nous avons identifié MEK et PI3K comme candidats les cibles les plus prometteuses. Par conséquent, une nouvelle combinaison thérapeutique potentielle peut être rapidement pré-évaluée in silico, qui sert de base à d' autres essais in vitro. En outre, les données de sortie provenant d' expériences in vitro peutêtre utilisé pour affiner le système en silico par des ajustements de réseau qui correspondent aux résultats expérimentaux mieux. Semi-quantitative dans les stratégies de silico ont certaines limitations en ce qui concerne la taille du réseau (environ 100 interactions protéine-protéine peuvent être pris en compte). Par ailleurs, il est indispensable d'intégrer tous les noeuds de protéines clés dans la topologie du réseau afin d'obtenir des résultats réalistes. Le modèle in silico donne donc qu'une approximation du réseau existant dans la cellule tumorale de vie. Toutefois, ce point de vue ciblée nous permet de simuler les changements spécifiques d'intérêt, par exemple., L'effet des combinaisons de médicaments sur différents milieux mutationnelles dans la lignée cellulaire. Cela nous aide à comprendre systématiquement la complexité de ces réseaux de signalisation du cancer ainsi que dériver de nouvelles stratégies thérapeutiques.
En conclusion, nous sommes convaincus que nous avons mis au point un tissu utile conçu dans l' outil vitro qui pourrait facilement être intégré dans preclitests sur l'efficacité des tech- composés médicamenteux simples et leurs combinaisons. Pour réduire les coûts et le temps dans les tests, ce modèle de tumeur est en outre complété par un dans l' outil de prédiction de silico permettant d'étendre les données recueillies à une prédiction spécifique de type cellulaire des effets des médicaments et de combinaison de médicaments , y compris les thérapies cliniques axés sur ciblée ou de nouveaux acteurs à considérer (par exemple., miARN).
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette recherche a été commanditée par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF, subvention BD247) de l'hôpital universitaire de Würzburg et le programme Bayern Fit (accordé à Heike Walles).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | This software was used for drawing the network. |
| Citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. | |
| Citrate buffer working solution | in house production | 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal Calf Serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4% (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37 °C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | - | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5 ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
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