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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un Tessuto 3D combinata Engineered Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53885
Automatic Translation
*1, *1, *3, 1, 1,4, 2, 3, 1,4, 1
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
* These authors contributed equally

Abstract

Nel presente studio, abbiamo combinato un 3D polmone modello in vitro tumore con un modello in silico per ottimizzare le previsioni di risposta ai farmaci sulla base di uno specifico background mutazionale. Il modello è generato su un ponteggio suina decellularized che riproduce le caratteristiche tessuto-specifici per quanto riguarda la composizione della matrice extracellulare e l'architettura tra cui la membrana basale. Abbiamo standardizzato un protocollo che permette la generazione di tessuto tumorale artificiale entro 14 giorni di cui tre giorni di trattamento farmacologico. Il nostro articolo fornisce diversi descrizioni dettagliate di 3D lettura le tecniche di screening, come la determinazione del indice di proliferazione Ki67 colorazione, l'apoptosi da surnatanti da M30-ELISA e la valutazione dei epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), che sono strumenti utili per valutare l'efficacia delle composti terapeutici. Abbiamo potuto dimostrare rispetto alla cultura 2D una riduzione della proliferazione nel nostro modello di tumore in 3D che è relatcato alla situazione clinica. Nonostante questa proliferazione più bassa, il modello previsto EGFR risposte farmacologiche -targeted correttamente in base allo stato biomarker come dimostra il confronto delle linee cellulari di carcinoma del polmone HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) e A549 (EGFR wild-type, KRAS - mutato) trattati con il gefitinib inibitore della tirosin-chinasi (TKI). Per studiare le risposte farmacologiche di cellule tumorali più avanzate, abbiamo indotto EMT da un trattamento a lungo termine con TGF-beta-1 come valutato dal vimentina / immunofluorescenza pan-citocheratina. Un flusso-bioreattore è stato impiegato per regolare la cultura a condizioni fisiologiche, che ha migliorato la generazione dei tessuti. Inoltre, mostriamo l'integrazione di risposta ai farmaci in seguito al trattamento con Gefitinib o TGF-beta-1 stimolazione - apoptosi, indice di proliferazione e EMT - in un valore booleano nel modello di silico. Inoltre, spieghiamo le risposte come farmaco di cellule tumorali con uno specifico background mutazionale e conteggioerstrategies contro la resistenza possono essere previsti. Siamo sicuri che il nostro 3D nell'approccio vitro in particolare con la sua espansione in silico fornisce un valore aggiunto per il test anti-droga preclinica in condizioni più realistiche che in coltura cellulare 2D.

Introduction

L'industria farmaceutica sta affrontando alti tassi di attrito fino al 95% nel campo del trattamento del cancro in fase clinica causando costi enormi 1-5. Una ragione di questo deficit è il fatto che attualmente efficacia di potenziali nuovi composti è valutata in screening su larga scala su colture cellulari 2D su linee cellulari di cancro o in modelli animali. I modelli animali hanno una maggiore complessità, ma ci sono differenze cruciali tra i topi e gli uomini 6,7. Negli ultimi dieci anni, modelli di cancro 3D utilizzando diversi approcci sono stati generati per colmare il divario tra la cultura 2D delle linee di cellule di cancro e di un complesso 6,8,9 vivo del tumore. L'impatto ambientale 3D sulla differenziazione cellulare e anche sul segnale è stato dimostrato in diversi studi anni fa (ad es., Da Mina Bissell) 10,11. Oggi, molti modelli di coltura cellulare 3D sono disponibili, come le culture sferoide, idrogeli o chip microfluidica 12-16. Anche se These modelli migliorano la complessità rispetto ai sistemi di coltura convenzionale 2D, la maggior parte essi mancano di un microambiente tessuto che è noto per avere effetti tumorali di supporto e anche gli impatti efficacia del farmaco.

Per risolvere questo problema, abbiamo generato un modello di tumore 3D basata su una impalcatura biologica chiamato SISmuc (piccolo intestino-sottomucosa + mucosa) che è derivato da un digiuno suina decellularized. In tal modo, l'architettura dei tessuti e importanti componenti della ECM come diversi collageni nonché la struttura membrana basale sono conservati 17. Questa caratteristica unica è fondamentale per la generazione modello di tumore di carcinomi che derivano da epiteli e costituiscono circa l'80% dei tumori solidi. Inoltre, il tasso di proliferazione nel nostro modello di tumore tissutale è ridotta rispetto ai tassi artificialmente elevati raggiunti nella cultura 2D. Come proliferazione è un parametro importante per valutare l'efficacia dei farmaci, droga test è abilitato nel nostro modello più similecondizioni per in vivo Tumori 17.

Al fine di valutare il potenziale del nostro modello per prevedere biomarcatore-dipendente efficacia dei farmaci correttamente, i dati qui presenti per due diverse linee di cellule di cancro al polmone che si differenziano per il loro stato di EGFR -biomarker. Questo stato mutazionale ha iniziato ad essere determinato di routine in pazienti con NSCLC. Trattamenti mirati con TKIs come l'EGFR, inibitore della gefitinib contro i tumori recanti un attivando mutazione dell'EGFR mostrano risultati superiori rispetto a quelli con la chemioterapia a base di platino 18-21.

Abbiamo stabilito diverse tecniche di read-out che sono rilevanti per la valutazione dell'efficacia composto. Inoltre, dopo il TGF-beta-1 stimolazione siamo in grado di indagare le azioni composti nelle cellule tumorali che hanno iniziato il processo di EMT, che è pensato per essere un passo importante nella trasformazione maligna 22,23 e che è collegato a resistan di drogace 24.

Il modello di tumore 3D consentire il monitoraggio delle risposte specifiche delle celle a trattamenti mirati, la chemioterapia, o combinazioni di farmaci con buoni contrasti. Per migliorare ulteriormente e velocizzare droga screening e ad incontrare resistenza, è completato da una simulazione in silico. Sulla base di alcuni esperimenti, la risposta tumorale può essere previsto in silico per quanto riguarda il risultato per una gamma completa di farmaci e loro combinazioni.

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Protocol

1. bidimensionale (2D) Cell Culture

  1. Commercialmente ottenere linea di cellule tumorali HCC827 (DSMZ). Cultura della linea di cellule di adenocarcinoma polmonare HCC827 (EGFR mutato, KRAS wild-type) in RPMI-1640 integrato con 20% FCS. Cambiare media ogni 2 - 3 giorni. Dividere le cellule due volte a settimana. Le cellule sono utilizzati fino a raggiungere passaggio 20.
  2. Commercialmente ottenere tumore linea cellulare A549 (DSMZ). Cultura del carcinoma del polmone linea cellulare A549 (EGFR wild-type, KRAS mutato) in RPMI-1640 supplementato con 10% FCS. Eseguire la cultura come sopra indicato. Le cellule sono utilizzati fino a raggiungere passaggio 20.
  3. Testare le cellule regolarmente (ogni 4 - 6 settimane) per le contaminazioni, come contaminazioni micoplasma.
  4. Coltura di cellule A549 o HCC827 su vetrini
    1. Mettere 1 sterile vetrino di vetro in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti utilizzando una pinzetta.
    2. Seme 50.000 cellule tumorali di entrambe le linee di cellule in un volume di 500 microlitri nei pozzetti coni coprioggetti di vetro, rispettivamente.
    3. Culture cellule fino a raggiungere una confluenza del 70% in condizioni di coltura standard (37 ° C; 5% CO 2). Durante questo tempo, aspirare il terreno vecchio con una pipetta Pasteur e aggiungere 500 microlitri mezzo fresco ogni 2 - 3 giorni di coltura.

2. generazione di sistemi di tumore prova su un biologica Collagene Ponteggio

  1. Statici condizioni di coltura
    1. Generare il decellularized piccolo intestino-sottomucosa + mucosa (SISmuc) e fissarlo tra due anelli di metallo, le cosiddette corone di cellule, come descritto in una precedente pubblicazione 25.
    2. Seed 100.000 cellule sia HCC827 o cellule A549 in un volume totale di 500 microlitri sul lato degli ex lume dell'intestino fisso in corone cellulari.
    3. Consentono alle cellule tumorali di aderire per 2 ore a 37 ° C, 5% CO 2. Aggiungere 1 ml di mezzo all'interno della corona cellulare e 1 ml di fuori.
    4. Culture del tumoremodello in condizioni statiche a 37 ° C, 5% CO 2 in incubatrice per 14 giorni. Cambiare terreno di coltura ogni 2 - 3 giorni. Pertanto, aspirare il terreno con una pipetta Pasteur e pipettare 1 ml fresco RPMI con la quantità appropriata di FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) all'interno della corona cellulare e 1,5 ml dello stesso terreno esterno.
  2. Condizioni di coltura dinamici
    1. Impostare il sistema di test tumore con la matrice decellularized all'interno delle corone cellulari e semina delle cellule, come descritto ai sensi del comma 2.1.1 a 2.1.3.
    2. Culture del modello di tumore in condizioni statiche 37 ° C, 5% CO 2 in incubatrice per 3 giorni.
    3. Montare il bioreattore autoclavato e inserire la testa di serie SISmuc come pubblicato in precedenza 25.
    4. Pipettare 45 ml RPMI con la giusta quantità di FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) nel pallone e collegare il dispositivo di campionamento senza ago per il sistema di tubazione tra il bioreattore e ilboccetta di media.
    5. Posizionare il bioreattore nell'incubatrice, collegarlo alla pompa e cultura modello di tumore per altri 14 giorni, con un costante flusso medio (3 ml / min) a 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Cambiare l'intero terreno di coltura dopo 7 giorni. Per questo, spostare il bioreattore dal termostato sotto una cappa a flusso laminare. Aspirare il medium nel pallone multimediale utilizzando una pipetta Pasteur. Sollevare il bioreattore mentre aspirazione per sbarazzarsi del mezzo nel sistema di tubi. Pipettare 45 ml di mezzo fresco nel pallone. Posizionare il bioreattore posteriore nell'incubatrice e collegarlo alla pompa.

3. Il trattamento del tumore Modello statico con Gefitinib

  1. Cultura del modello di tumore come descritto nella sezione 2.1.
  2. Al giorno 11 di cultura, preparare RPMI / FCS con 1 mM gefitinib (2,5 ml per ogni corona cella). Aspirare il vecchio supporto dai pozzi usando una pipetta Pasteur e aggiungere 1 ml di preparato RPMI / FCS / gefitinib all'interno tegli corona cellulare e 1,5 ml dello stesso terreno esterno.
    NOTA: La soluzione gefitinib magazzino scongelato può essere conservato a 4 ° C per una settimana.
  3. Cambiare il medium al giorno 13, come descritto ai sensi del comma 3.2.

4. La stimolazione del modello di tumore statica con TGF-beta-1 per EMT induzione

  1. Cultura del modello di tumore come descritto nella sezione 2.1.
  2. Al giorno 3 della cultura, preparare RPMI / FCS con 2 ng / ml TGF-beta-1 con supporto (2,5 ml per ogni corona cella). Aspirare il vecchio mezzo dai pozzetti usando una pipetta Pasteur e aggiungere 1 ml di preparati RPMI / FCS / TGF-beta-1 all'interno della corona cellulare e 1,5 ml dello stesso terreno esterno. Cambiamento medio integrato con TGF-beta-1 ogni 2 - 3 giorni fino al giorno 14, come descritto in 4.2.

5. Leggere-out

  1. Il prelievo di campioni per Elisa Misure
    1. Prendere campioni dai surnatanti di statico (sezione 2.1) e dinamica (sezione 2.2) cultura durantetrattamento con gefitinib (punto 3) a giorni 11-14 della cultura come indicato in figura 2. Inoltre, prendere un campione prima del trattamento (T0).
    2. In condizioni di coltura statiche, prendere 100 campioni microlitri dall'interno della corona cella. In condizioni di coltura dinamici, avvitare la siringa sul dispositivo di campionamento e prendere 1 ml di mezzo dal sistema di bioreattore. Conservare tutti surnatanti raccolti a -80 ° C fino a quando viene eseguita l'ELISA.
  2. M30-ELISA per apoptosi quantificazione
    1. Per quantificare l'apoptosi nei supernatanti eseguire il saggio morte cellulare secondo le istruzioni del produttore. Portare tutti i reagenti di raggiungere RT prima di eseguire il test.
    2. Vortex tutti i reagenti. Sciogliere la compressa di lavaggio in 500 ml di acqua fresca deionizzata. Diluire HRP Coniugato con 9,2 ml di coniugato tampone di diluizione e mescolare. Pipettare 25 ml di standard o campione per pozzetto.
    3. Aggiungere 75 ml di diluito HRP conjusoluzione cancello per pozzetto. Coprire la piastra e incubare su un agitatore per 4 ore a temperatura ambiente. Lavare la piastra manualmente, 5 volte con 250 ml di soluzione di lavaggio preparata.
    4. Aggiungere 200 ml di 3,3 ', substrato 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) in ogni pozzetto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungere 50 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto. Agitare la micropiastra per 10 secondi e lasciare la micropiastra per 5 minuti prima di leggere l'assorbanza. Determinare l'assorbanza a 450 nm in un lettore di micropiastre. Calcolare la curva standard e le concentrazioni nei campioni utilizzando un programma adatto per la gestione di dati di tipo ELISA quali l'origine.
  3. La colorazione del campione
    1. Fissaggio, paraffina-embedding e la sezione Preparazione del modello 3D
      1. Fissare il SISmuc testa di serie con 2,5 ml 4% paraformaldeide (PFA) per corona cella per 2 ore e integrarlo in paraffina
      2. Preparare 3 micron sezioni di tessuto per la colorazione come pubblicato in precedenza25.
    2. Fissaggio di cellule in coltura 2D Condizioni
      1. Quando viene raggiunto il 70% di confluenza, lavare le cellule coltivate su vetrini a 24-pozzetti una volta con PBS e fissarli con 500 microlitri 4% PFA / pozzetto per 10 min.
      2. Rimuovere PFA e memorizzare i vetrini nel pozzo-piastra coperta con PBS a 4 ° C fino al momento colorazione.
    3. Colorazione H & E
      1. Macchiare le sezioni reidratati con ematossilina / eosina come colorazione panoramica secondo protocolli standard.
    4. Immunofluorescenza colorazione del modello 3D
      1. Per immunofluorescenza, eseguire un recupero dell'antigene ponendo i vetrini deparaffinate e reidratati in una pentola a vapore con tampone citrato preriscaldata (pH 6,0) per 20 min.
        NOTA: Vedere tabella di materiali e attrezzature per la preparazione di di tampone citrato.
      2. Trasferire i vetriniil tampone di lavaggio (0,5 M tampone PBS + 0,5% Tween), sezioni di cerchio con una penna PAP per minimizzare il volume richiesto per soluzioni coloranti e posizionare i vetrini in una camera umida.
      3. Bloccare le sezioni di tessuto con il 5% di siero dalle specie ospite degli anticorpi secondari utilizzati alla lettera 5.3.4.6 per 20 minuti a temperatura ambiente.
      4. Rimuovere il blocco siero picchiettando delicatamente le diapositive per un fazzoletto di carta e applicare l'anticorpo primario alle sezioni circondati in una diluizione in base alle istruzioni del produttore (coniglio anti Ki67 1: 100, coniglio anti vimentina 1: 100, topo anti pan-citocheratina 1 : 100). Incubare O / N a 4 ° C. Per doppia colorazione, anticorpi primari provenienti da diverse specie ospiti devono essere utilizzati.
      5. Lavare accuratamente fuori anticorpo non legato con tampone di lavaggio tre volte per 5 min.
      6. Per il rilevamento di specifici attacchi antigene-anticorpo, applicare anticorpi secondari in diluizione 1: 400 di sezioni e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
      7. Lavare UNBanticorpo ound con tampone di lavaggio tre volte per 5 min.
      8. Montare le diapositive con un mezzo acquoso contenente DAPI di colorazione di contrasto nuclei e lasciarli asciugare O / N.
    5. Immunofluorescenza colorazione di cellule in coltura 2D
      1. Rimuovere PBS e coprire le teste di serie scivola copertura in vetro con 0,2% Triton-X100 in PBS per 5 minuti per permeabilizzazione. Lavare i vetrini coprioggetto di vetro con tampone di lavaggio (0,5 M tampone PBS + 0,5% Tween) per 5 min.
      2. Eseguire le operazioni da 5.3.4.3 a 5.3.4.7. Eseguire tutti i passaggi della piastra a pozzetti su una piattaforma oscillante e rimuovere i reagenti capovolgendo la piastra.
      3. Per il montaggio, individuare una goccia di mezzo acquoso contenente DAPI di colorazione di contrasto nuclei su un vetrino non rivestito e trasferire la polizza di copertura ad esso con le cellule di fronte al mezzo di montaggio con pinze. Lasciare asciugare prima di imaging.
  4. Determinazione dell'indice di proliferazione
    1. eseguire immunofluorescenzamacchiare contro Ki67 secondo la sezione 5.3.4. o 5,3 5.
    2. Prendere immagini fluorescenti delle sezioni di tessuto o cellule in coltura 2D con un microscopio invertito. Utilizzare filtri diversi per scattare immagini di colorazioni DAPI e di colorazioni Ki67. Per la quantificazione, utilizzare 10 immagini di sezioni 3D o 5 immagini di 2D culture (20X di ingrandimento) di ogni condizione da parte non sovrapposti del campione.
    3. Determinare il numero di nuclei e il numero di nuclei positivi per Ki67 in 2D
      1. Conte Ki67 nuclei positivi manualmente utilizzando il contatore delle cellule plug-in del software Fiji 26. Pertanto, aprire l'immagine e fare clic su "Plugins" → "Analizza" → "Cell Counter". Premere il tasto "inizializzare" e selezionare un tipo di contatore. Clicca su ogni nucleo positivo Ki67. Il numero di clic viene visualizzato accanto al tipo di contatore selezionato.
      2. Per il conteggio delle cellule automatico del numero totale di nuclei creare una macro utilizzando Fiji 27,28. AdjUst la macro per ogni linea di colorazione e di cellule. In seguito, un esempio come creare una macro.
        1. Inizia registratore di macro. Aprire un DAPI-immagine e convertirla in formato a 8 bit cliccando su "Immagine" → "Tipo" → "8-bit". Fai clic su "Migliorare il contrasto", impostare 'saturi' come "1" e "normalizzare".
        2. Impostare "maschera di contrasto" per renderla più nitida. Utilizzare un 'raggio' di "1" e 'maschera' di "0.60". Fai clic su "soglia auto", scegliere il metodo di "RenyiEntropy" con "oggetti bianchi su sfondo nero 'per binarise l'immagine.
        3. Fai clic su "Plugins" → "BioVoxxel" → "caratteristiche irregolari spartiacque" con un raggio di erosione del "5" per separare le cellule. Fare clic su "Analizza" → "Analisi Particelle" e impostare la 'dimensione' a "0,02-Infinito".
          NOTA: il numero di particelle / cellule èindicato nella tabella di riepilogo come conteggi.
        4. Fai clic su "Crea" per salvare macro per l'analisi di altre immagini.
    4. Determinare il numero di nuclei e il numero di nuclei positivi per Ki67 in 3D manualmente come descritto nel paragrafo 5.4.3.1.
    5. Calcolare l'indice medio di proliferazione (PI) secondo la seguente formula:
      Equation1
      n = numero di immagini (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico tumore modello di generazione e simulazione di Anti-EGFR terapia nelle celle HCC827

  1. Generation Network utilizzando un software per l'analisi di rete
    1. Utilizzare diversi database noti per generare la rete del tumore in base ai più importanti parametri sperimentali di read-out e lo sfondo mutazionale della linea cellulare HCC827.
    2. Aprire il software di analisi di rete 21 per visualizzare laRete.
      1. Clicca → "Nuovo" → tipo "modelli JoVE_tumor '" File "→ fare clic su" OK "per generare una nuova rete. Fai clic su "Piazza Primo piano del Nord" → "OK" per visualizzare il ricevitore in una doppia membrana. Fai clic su "Proteine ​​generico" per visualizzare i nodi (= proteine) come rettangoli → tipo 'EGFR' → fare clic su "OK"; ripetere questo per ogni nodo della rete.
      2. Etichettare i nodi della rete: Fare clic destro → "Colore & Forma cambiamento ..." → selezionare per i nodi EGFR e (EGF-EGFR) codice di colore "255,0,0" (colore rosso); Per i nodi c-MET e il codice colore (c-MET) "0,255,0" (colore verde); per il codice colore gefitinib "255,255,0" (colore giallo); per il codice colore PI3K-INH "204.204.204" (colore grigio chiaro); per il codice colore MEK-INH "102.102.102" (colore grigio scuro); per tutti gli altri nodi del codice seleziona il colore della rete4; 255,255,255 "(colore bianco).
      3. Fai clic su "fenotipo" per visualizzare i parametri di read-out come esagoni → tipo 'proliferazione' → fare clic su "OK" → Fare clic destro → "Cambia colore e forma ..." → selezionare il codice colore "255.204.204" (colore salmone); ripetere questo per il parametro apoptosi → selezionare il colore del codice "255,51,204" (colore viola).
      4. Visualizza Bordi (= interazioni): Fai clic su "Stato di transizione" per le attivazioni (frecce), fare clic su "inibizione" per inibizioni (frecce spuntate); ripetere questo per ogni interazione in rete.
    3. Fai clic su "File" → "Salva con nome ..." → tipo 'JoVE_tumor models.xml' → fare clic su "Salva" per salvare la rete di segnalazione generato come .xml formato.
  2. In Silico simulazione con SQUAD
    NOTA: SQUAD rappresenta °topologia di rete e un sistema discreto logica booleana (AND, OR, NOT) ed esegue un'analisi stato stazionario. L'analisi di stato stazionario riflette l'equilibrio del sistema e la responsabilità su di stimoli di segnalazione (ad es., L'applicazione di droga o mutazione).
    1. Aprire SQUAD 17 software, fare clic il file 'JoVE_tumor models.xml' "carico di rete" → upload. Fai clic su "Esegui analisi":
      NOTA: Avanti, SQUADRA applica funzione esponenziale di interpolare la connettività di rete booleana, che permette la simulazione dinamica del comportamento della rete nel corso del tempo (colorate curve di attività sigma).
    2. Fai clic su "Avanzate" → "perturbatori" per scrivere un protocollo di simulazione. Simulare anti-EGFR resistenza: Fai clic su "Modifica Protocol"
      1. Fai clic su "perturbazione" → utilizzare standard "InitialState = SS-4" (stato stazionario 4) → Fare clic su "Aggiungi" per aggiungere 'nuovo impulso costante' → Senare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "FLIP" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "0,4" → Fare clic su "OK".
      2. Ripetere questo: Fare clic su "Aggiungi" → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "c-MET" → Selezionare il tempo di "0" → Selezionare il valore "0,4" → Fare clic su "OK"; Fai clic su "Aggiungi" → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "gefitinib" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "1" → Fare clic su "OK".
      3. Impostare un valore di stato di nodo attivo (EGF-EGFR): Fare clic su "activenode" → Fare clic su "Modifica" → stato Selezionare "0.8" → Fare clic su "OK"; per tutti gli altri nodi: Fai clic su "Modifica" → Selezionare stato "0" → Fare clic su "OK". Fai clic su "OK" per salvare il protocollo.
      4. Visualizzare le curve specifici: Vai pannello "Opzioni" → Selezionare "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspasi", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptosi", "proliferazione", "MEK-INH" e "PI3K-INH" per la rappresentazione grafica. Fai clic su "Inizializza" → "Run" per avviare una simulazione completa di risposta del sistema. Fare clic su "Reset" per iniziare una nuova simulazione.
    3. Simulare combinato PI3K inibitore MEK e il trattamento: Fai clic su "Modifica Protocol"
      1. Utilizzare stesso parametro nodo come descritto al punto 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Fai clic su "perturbazione" → Fare clic su "Aggiungi" per aggiungere 'nuovo impulso costante' → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "PI3K-INH" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "1" → Fare clic su "OK"; Fai clic su "Aggiungi"per aggiungere 'nuovo impulso costante' → Selezionare il parametro "Stato" → Seleziona destinazione "MEK-INH" → Selezionare il tempo di "0" → valore Selezionare "1" → Fare clic su "OK".
      2. Fai clic su "OK" per salvare il protocollo. Vai al pannello "Opzioni": Utilizzare stessi nodi per la rappresentazione grafica come descritto al punto 6.2.2.4. Fai clic su "Inizializza" → "Run" per avviare una simulazione completa di risposta del sistema. Fai clic su "Reset" per terminare la simulazione.

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Representative Results

Sulla base del ponteggio SISmuc (Figura 2A a C), abbiamo stabilito un protocollo operativo standardizzato per la generazione, la stimolazione e il trattamento di un sistema di test tumorale 3D (Figura 2D). Questo modello permette la determinazione dell'indice di proliferazione e la quantificazione dell'apoptosi usando M30-ELISA come mostrato in Figura 1 e Figura 3, rispettivamente. Figura 3 mostra rappresentante H & E colorazione dei modelli A549 e HCC827 e una misurazione rappresentante apoptosi con gefitinib. Il modello qui presentato è stato progettato utilizzando l'esempio di EGFR NSCLC -mutated che viene trattata con successo con inibitori mirati nella clinica. Corrispondentemente, solo l'EGFR -mutated HCC827 cellule e non le cellule A549 rispondere agli inibizione EGFR dal gefitinib TKI nel nostro modello come valutato dal aumento dell'apoptosi. Figura 4 Figura 5C e D. Anche in condizioni di coltura dinamici gefitinib ha un forte effetto sul EGFR HCC827 -mutated (Figura 5D).

La figura 6 mostra la topologia della rete (Figura 6A) e descritta nelle simulazioni in silico di anti- resistenza EGFR in HCC827 cellule (Figura 6B, C). La rete di segnalazione è stata generata utilizzando banche dati di letteratura noti come HPRD, KEGG e QIAGEN (Genes & Pathways), risultando in una topologia di 42 nodi e 55 spigoli, visualizzato con il software CellDesigner 26. La simulazione di driver conosciuto mutazioni EGFR (in rosso) e co-attivazione di c-MET (in verde, valore intorno a 0,7) mostra un aumento del Proltasso iferation (curva salmone) e un tasso di diminuzione apoptosi (curva viola) nel corso del tempo che riflette gefitinib (in giallo) Resistenza in HCC827 cellule percorrendo con l'attivazione di MEK e PI3K (Figura 6B, verde scuro e ciano). Modellazione di combinata PI3K e MEK inibitore (scura e le curve di colore grigio chiaro) si traduce in un ritorno dell'effetto anti-EGFR resistenza, riduce la proliferazione e induce l'apoptosi (Figura 6C).

Figura 1
Figura 1. Proliferazione aliquota è ridotta in 3D Rispetto alla 2D coltura cellulare. Le cellule HCC827 Ki67-positivo (rosso in A e B) sono state macchiate in coltura di cellule 2D (A) e colture cellulari 3D su SISmuc (B). Cellule HCC827 e cellule A549 sono state contate e l'indice di proliferazione (percentuale di cellule positive Ki67) è stato determinato (C </ Strong>, un rappresentante contare su cinque). Barre di scala in A e B:. 100 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. SISmuc impalcatura Morfologia e di trattamento con TKI Gefitinib cellule vengono seminate sul SISmuc che consiste di piccola sottomucosa intestinale (SIS) + mucosa (A:. Brightfield, B: cellule DAPI macchiato sopra il SISmuc, C: overlay di a e B) ed è fissata in corone cellulari a giorno 0. Il regime di trattamento è mostrato in D: variazioni medie (MC) vengono eseguite ogni 2 o 3 giorni. Al giorno 11 il trattamento inizia. I supernatanti sono raccolti e utilizzati per M30-ELISA al fine di quantificare l'apoptosi nel corso del tempo (frecce blu e caselle). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Gefitinib trattamento alterazioni cellulari crescita sul SISmuc e induce apoptosi nelle HCC827, ma non in modelli tumorali A549 3D. Senza alcun trattamento, entrambe le linee di cellule formano un monostrato sul SISmuc (A e B) e anche risolvere ex strutture cripta. Mentre il modello di crescita delle cellule A549 non viene modificata dopo il trattamento con gefitinib (C), il numero delle cellule è ridotto HCC827 accompagnata da un cambiamento di forma allungata cella (D). L'apoptosi è indotta da Gefitinib in HCC827 modelli come si è visto da misure M30-ELISA da sovranatanti di coltura (E D:. 100 micron per A a D Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. TGF-beta-1 induce EMT in HCC827 Celle dal SISmuc. HCC827 cellule coltivate in 3D mostrano espressione complessiva di pan-citocheratina (PCK) (verde in A, A1), ma solo singole cellule esprimono vimentina (rosso in A, a2). Dopo TGF-beta-1 stimolazione, le cellule cambiano la loro morfologia ad una forma allungata e l'espressione di vimentina è fortemente aumentato (rosso in B, b2), mentre l'espressione di PCK è mantenuto (verde in B, b1). Bar Scala in B: 100 micron per A B. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Dinamico Cell Culture Aumenta Tissue generazione. Quando coltivate in condizioni 3D in un bioreattore (B), il monostrato dal modello statico (A, colorazione H & E) cambia da un monostrato (A) per un tessuto multistrato (C, H & E colorazione ). HCC827 cellule mostrano una forte risposta ai farmaci in seguito al trattamento con Gefitinib (D, colorazione H & E). Barra della scala in D:. 100 micron per A, C, e D Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura. 6. In Silico tumore modello di generazione e simulazione di topologia Anti-EGFR terapia Resistenza. Rete di una cellula tumorale con i nodi di segnalazione chiave in rosso (pathway EGFR) e verde (c-MET) e dei loro nodi a valle. Il tumore caratteristica di read-out parametri proliferazione (nel salmone) e l'apoptosi (in viola) sono rappresentati come esagono. Le frecce indicano attivazione, le frecce smussati inibizione. Bersagli terapeutici sono rappresentate da rettangoli grigi chiari e scuri, l'inibizione da gefitinib viene visualizzato in giallo (A). Simulazione dinamica da e-funzioni (curve colorate) interpolare la connettività di rete booleana (AND, OR, NOT). EGFR e c-MET co-espressione provoca resistenza gefitinib, come indicato da un aumento della proliferazione (curva salmone) e annuncioecrease di apoptosi (curva viola) dopo circa arbitrario tempo punto 8 (B). Affronta potenziale terapia sia PI3K e MEK dagli inibitori (sotto la curva gialla; stessa attivazione, vedere Protocol). (C) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo stabilito un combinato in vitro / in sistema di prova del tumore silico per le previsioni di trattamento biomarker-guidata. Il modello in vitro valuta diversi aspetti importanti azioni composti come cambiamenti di proliferazione delle cellule tumorali e apoptosi su una determinata sfondo mutazionale che possono anche essere simulati in silico 17. Qui, vi presentiamo il protocollo standardizzato per la generazione di modello di tumore 3D e test composti compresa la quantificazione della proliferazione e l'apoptosi e la creazione di un modello di previsione in silico. Il modello di tumore 3D si basa su linee cellulari tumorali che portano mutazioni specifiche. Le cellule sono coltivate su una matrice di tessuto decellularized in corone cellulari. Matrix decellularization, fissaggio tra i due anelli in metallo (corone cellulari), il montaggio del sistema di bioreattore nonché semina del ponteggio sono state visualizzate in JoVE prima 25.

In vitro Tumore Modello 3D
La traduzione dei risultati qui raggiunti in clinica richiede una accurata selezione di cellule tumorali adatti portanti mutazioni di interesse al fine di classificare i pazienti in base al biomarcatori per farmaci mirati selezionati. Per la medicina stratificata, identificazione di mutazioni del driver druggable dal sequenziamento di nuova generazione è una delle principali preoccupazioni soprattutto in NSCLC e si spera rivelare nuovi marcatori genetici in futuro 29. Per i test in vitro, il composto di interesse dovrebbe riguardare un sito che è molto attivo nella linea cellulare scelto o in cellule primarie. Qui, le linee cellulari HCC827 e A549 sono stati scelti per la loro differenza di stato di mutazione e riportati ipersensibilità (HCC827 cellule) e la sensibilità intermedia (cellule A549) verso il gefitinib TKI nella cultura 2D 30-32. Nella prima fase del 3D generazione modello di tumore, numero e coltura cellulare periodo del tumore selezionato cellule devono essere ADJUsted se vengono utilizzate cellule diverse dal qui menzionati. Per trovare la concentrazione ottimale composto, si consiglia di determinare il valore IC50 con l'aiuto di un test di vitalità disponibile in commercio in 2D. In base a questo test, il composto deve essere usato nella concentrazione IC50 e il successivo maggiore concentrazione nei modelli 3D. Abbiamo scelto tre giorni di trattamento, da un lato, al fine di ottenere risultati entro due o tre settimane, per un facile confronto ai sistemi di test tumorale 2D dall'altro. Tuttavia, periodi di trattamento possono essere prolungati per indagare a lungo-termine effetti. Tuttavia, va considerato che il trattamento a lungo termine o alti dosaggi del composto testato può causare la perdita di cellule completa impedendo così la valutazione della proliferazione o altri marcatori immunoistochimici.

Per affidabile analisi di rete di segnalazione, le risposte tumorali in seguito al trattamento con un certo residuo devono essere analizzati distinguendo tra proliferazione e apoptosi. Questi-outs lettura sono diversamente collegati in rete di segnalazione. Pertanto, l'analisi distintivo di entrambi i parametri consente una migliore comprensione di azione del farmaco e la successiva previsione di destinazione. Come detto prima, la proliferazione delle cellule tumorali è ridotta nel nostro modello 3D rispetto alle condizioni di coltura 2D e pertanto, dovrebbe ridurre falsi positivi dei composti testati citostatici. Per la determinazione dell'indice di proliferazione, il numero totale di nuclei e il numero di nuclei positivi per Ki67 colorazione devono essere quantificata utilizzando il software Fiji per esempio. Questo può essere semplificata dall'uso di macro in culture 2D di cellule tumorali che è, tuttavia, non è possibile se le cellule formano aggregati stretti come questo si traduce in un numero inferiore o superiore di nuclei, rispettivamente. In tutti i casi, le impostazioni macro devono essere accuratamente regolato per ciascuna linea cellulare e la colorazione. L'apoptosi può essere quantificata in modo non invasivo dai surnatanti misurazione citocheratina caspasi-spaccati 18, which è limitato alle cellule con caratteristiche epiteliali, usando M30-ELISA. Questo ha diversi vantaggi: I) Permette di monitorare l'efficacia del trattamento nel tempo e per identificare il punto di partenza di un trattamento efficace. II) I campioni non vengono distrutti e possono essere usati per altre tecniche di visualizzazione. III) l'apoptosi delle cellule epiteliali può essere distinto da apoptosi mesenchimali, che è ottimale in ambienti co-coltura. Questa tecnica, tuttavia, potrebbe essere appropriato per le cellule tumorali che hanno subito EMT, perdendo così il loro fenotipo epiteliale. Così, l'espressione della citocheratina 18 di ciascuna linea di cellule tumorali utilizzati vanno verificate mediante colorazioni immunoistochimiche prima di applicare questa tecnica. Prove di composti può essere eseguita anche in un gambo cellule tumorali-like fenotipo più. Di solito in prova della droga diverse fasi invasive sono trascurati, anche se la maggior parte dei farmaci mirati, come ad esempio TKI, vengono applicate nelle fasi più avanzate del tumore. Il nostro modello permette l'indagine di invasivo o nocellule tumorali n-invasiva, a causa della membrana basale conservato 17 che le cellule devono attraversare durante il processo di invasione. Un passo fondamentale verso la motilità cellulare e l'invasività è EMT che può essere indotta in diversi modelli di cancro al polmone dalla stimolazione con TGF-beta-1 17,33. Questo, tuttavia, riduce la proliferazione e quindi il numero di cellule sull'impalcatura. Questo effetto collaterale negativo può essere aggirata con l'applicazione di condizioni di coltura dinamici che aumenta significativamente la densità delle cellule tumorali in modelli 3D. Anche se il bioreattore regola cultura condizioni fisiologiche, si deve considerare che le proprietà delle cellule e la segnalazione può essere influenzato dall'esposizione alle sollecitazioni di taglio 25.

Utilizzando in silico simulazioni per accelerare Cell-line-specifica Drug Testing
Anche se solo semi-quantitativa, la sequenza di eventi è correttamente modellato dal nostro modello in silico per la curaconsiderando pienamente le mutazioni conosciute per ciascuna linea cellulare specifica. Questo include linee cellulari specifiche modifiche dei diversi livelli di attivazione del recettore, che misura coinvolto chinasi sono attivati ​​e quando e per quanto tempo l'uscita di rete come apoptosi o proliferazione è prevedibile. Per esempio, si può considerare clinicamente noti amplificazioni c-MET che si pensa a verificarsi in circa il 20% dei acquisito EGFR anti-resistenza alla terapia 30. Successivamente, il modello in silico calcola il comportamento di rete corrispondente nel corso del tempo, ad es., Lo sviluppo di resistenza gefitinib rappresentato da un aumento della proliferazione e diminuito l'apoptosi. Nel nostro modello, abbiamo identificato MEK e PI3K come i candidati più promettenti di destinazione. Pertanto, nuovo potenziale combinazione terapeutica può essere rapidamente pre-valutata in silico, che serve come base per ulteriori test in vitro. Inoltre, i dati di uscita di esperimenti in vitro possonoessere utilizzato per affinare il sistema silico da rettifiche di rete che si adattano i risultati sperimentali migliore. Semi-quantitativa in strategie silico hanno alcune limitazioni per quanto riguarda la dimensione della rete (circa 100 interazioni proteina-proteina possono essere considerati). Inoltre, è fondamentale integrare tutti i nodi proteina chiave nella topologia di rete, al fine di ottenere risultati realistici. Il modello in silico dà quindi soltanto un'approssimazione della rete esistente nella cellula tumorale vivente. Tuttavia, questa visione focalizzata ci permette di simulare i cambiamenti specifici di interesse, ad esempio., L'effetto delle combinazioni di farmaci su sfondi diversi mutazioni nella linea cellulare. Questo ci aiuta a capire in modo sistematico la complessità di tali reti di segnalazione cancro così come derivanti nuove strategie terapeutiche.

In conclusione, siamo convinti che abbiamo sviluppato un tessuto ingegnerizzato utile in strumento di vitro che potrebbe essere facilmente integrato in preclitest nica sulla efficacia di composti farmacologici singoli e le loro combinazioni. Per ridurre i costi e il tempo in fase di test, questo modello tumorale è inoltre completata da un in strumento di previsione silico permettendo di estendere i dati raccolti per una previsione specifica delle cellule-tipo di droga e di combinazione di droga effetti tra cui le terapie clinica orientata mirati o nuovi giocatori da considerare (ad es., miRNA).

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sponsorizzata dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF, concessione BD247) dell'Ospedale dell'Università di Wuerzburg e il programma Bayern Fit (concesso a Heike Walles).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

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