Abstract
En el presente estudio, se combinaron un modelo de tumor in vitro 3D de pulmón con una en el modelo de silico para optimizar las predicciones de la respuesta al fármaco basado en un fondo mutacional específico. El modelo se genera en un andamio porcino descelularizado que reproduce las características específicas de tejido con respecto a composición de la matriz extracelular y la arquitectura que incluye la membrana basal. Se estandarizó un protocolo que permite la generación de tejido tumoral artificial dentro de los 14 días incluyendo tres días de tratamiento con fármacos. Nuestro artículo proporciona varias descripciones detalladas de 3D técnicas de detección de lectura como la determinación del índice de proliferación Ki67 de tinción, la apoptosis de los sobrenadantes por M30-ELISA y la evaluación de transición epitelial a mesenquimal (EMT), que son herramientas útiles para evaluar la eficacia de compuestos terapéuticos. Hemos podido demostrar comparación con el cultivo 2D una reducción de la proliferación tumoral en nuestro modelo 3D que es related a la situación clínica. A pesar de esta proliferación inferior, el modelo predijo EGFR respuestas de drogas -targeted correctamente de acuerdo con el estado de biomarcadores, como se muestra por comparación de las líneas celulares de carcinoma de pulmón HCC827 (EGFR -mutated, KRAS de tipo salvaje) y A549 (EGFR de tipo salvaje, KRAS - mutado) tratados con gefitinib el inhibidor de la tirosina quinasa (TKI). Para investigar las respuestas de drogas de las células tumorales más avanzados, se indujo EMT por tratamiento a largo plazo con TGF-beta-1 según la evaluación de la vimentina / tinción de inmunofluorescencia pan-citoqueratina. Un flujo-biorreactor fue empleado para ajustar la cultura a las condiciones fisiológicas, lo que mejoró la generación de tejido. Además, se muestra la integración de las respuestas de drogas tras el tratamiento con gefitinib o TGF-beta-1 estimulación - la apoptosis, el índice de proliferación y EMT - en un booleano en el modelo in silico. Además, explicamos cómo las respuestas de drogas de las células tumorales con un fondo de mutación específica y recuentoerstrategies contra la resistencia se pueden predecir. Estamos seguros de que nuestro enfoque en 3D vitro sobre todo con su expansión in silico proporciona un valor adicional para las pruebas de drogas preclínica en condiciones más realistas que en el cultivo de células 2D.
Introduction
La industria farmacéutica se enfrenta a altas tasas de deserción de hasta el 95% en el campo del tratamiento del cáncer en la fase clínica causando enormes costos 1-5. Una razón de este déficit es el hecho de que en la actualidad eficacia de potenciales nuevos compuestos se evaluó en pruebas de detección a gran escala en cultivos de células 2D de líneas celulares de cáncer o en modelos animales. Los modelos animales tienen una complejidad mayor, pero hay diferencias cruciales entre ratones y hombres 6,7. En la última década, los modelos de cáncer en 3D usando diferentes enfoques que se han generado para cerrar la brecha entre la cultura 2D de líneas celulares de cáncer y un complejo de 6,8,9 tumoral in vivo. El impacto de entorno 3D sobre la diferenciación celular y también en la señalización se ha demostrado en varios estudios hace años (por ejemplo., Por Mina Bissell) 10,11. Hoy en día, muchos modelos de cultivo de células en 3D están disponibles, tales como cultivos de esferoides, hidrogeles o chips de microfluidos 12-16. A pesar de que Tsmodelos e mejorar la complejidad en comparación con los sistemas de cultivo 2D convencionales, que en su mayoría carecen de un microambiente del tejido que se sabe que tiene efectos de soporte tumorales y también afecta a la eficacia del fármaco.
Para solucionar este problema, hemos generado un modelo de tumor en 3D basado en un andamio biológico llamado SISmuc (intestino delgado-submucosa + mucosa) que se deriva de un yeyuno porcino descelularizado. De este modo, la arquitectura del tejido y los componentes importantes de la ECM tales como diferentes colágenos, así como la estructura de la membrana basal se conservan 17. Esta característica única es crucial para la generación de modelo de tumor de carcinomas que surgen de epitelio y comprenden alrededor del 80% de los tumores sólidos. Por otra parte, la tasa de proliferación en nuestro modelo de tumor de tejido modificado se reduce en comparación con las tasas artificialmente altos alcanzados en la cultura 2D. Como la proliferación es un parámetro importante en la evaluación de la eficacia del fármaco, las pruebas de drogas está habilitada en nuestro modelo en más similarescondiciones a los tumores in vivo 17.
Con el fin de evaluar el potencial de nuestro modelo para predecir la eficacia del fármaco biomarcador dependiente correctamente, los datos aquí presentes para dos líneas celulares de cáncer de pulmón diferentes que difieren en su estado de EGFR -biomarker. Este estado mutacional ha comenzado a ser determinado de forma rutinaria en pacientes con NSCLC. Tratamientos dirigidos con TKIs como el EGFR gefitinib -inhibidor contra tumores que llevan una activación de demostración mutación de EGFR resultados superiores en comparación con aquellos con quimioterapia basada en platino 18-21.
Hemos establecido varias técnicas de lectura que son relevantes para la evaluación de la eficacia del compuesto. Además, después de TGF-beta-1 estimulación estamos en condiciones de investigar las acciones de compuestos en las células tumorales que se inició el proceso de EMT, que se cree que es un paso importante en la transformación maligna 22,23 y que está conectado a resistan drogasce 24.
El modelo de tumor 3D permiten monitorear las respuestas de células específicas de tratamientos dirigidos a, quimioterapia o combinaciones de fármacos con buenos contrastes. Para mejorar y acelerar el fármaco de selección y para encontrar resistencia, esto se complementa con una simulación en silico. Sobre la base de algunos experimentos, la respuesta del tumor puede ser predicho in silico con respecto al resultado de una amplia gama de fármacos y sus combinaciones.
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Protocol
1. bidimensional (2D) de Cultivos Celulares
- Comercialmente obtener línea de células tumorales HCC827 (DSMZ). Cultura de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón HCC827 (EGFR mutado, KRAS de tipo salvaje) en medio RPMI-1640 suplementado con 20% de FCS. Cambiar el medio cada 2 - 3 días. Dividir las células dos veces a la semana. Utilizar las células hasta que se alcanza el paso 20.
- Comercialmente obtener A549 línea celular tumoral (DSMZ). Cultura del carcinoma de pulmón línea celular A549 (EGFR de tipo salvaje, KRAS mutado) en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FCS. Realice la cultura como se ha indicado anteriormente. Utilizar las células hasta que se alcanza el paso 20.
- Prueba de las células de forma regular (cada 4 - 6 semanas) para contaminaciones tales como contaminaciones micoplasma.
- El cultivo de células A549 o HCC827 en cubreobjetos de vidrio
- Coloca 1 cubreobjetos de vidrio estéril en cada pocillo de una placa de 24 pocillos utilizando una pinza.
- Seed 50.000 células tumorales de las dos líneas celulares en un volumen de 500 l en los pocillos conlos cubreobjetos de vidrio, respectivamente.
- Cultivar las células hasta que alcanzan una confluencia del 70% bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C; 5% de CO 2). Durante este tiempo, se aspira el medio de edad con una pipeta Pasteur y añadir 500 l de medio fresco cada 2 - 3 días de cultivo.
2. Generación de Sistemas de ensayo del tumor en un colágeno Andamios Biológica
- Estáticas condiciones de cultivo
- Generar el descelularizado del intestino delgado-submucosa + mucosa (SISmuc) y fijarlo entre dos anillos de metal, los llamados coronas de células, tal como se describe en una publicación anterior 25.
- Seed 100.000 células de cualquiera de las células A549 HCC827 o en un volumen total de 500 l en el lado de los antiguos lumen del intestino fija en coronas celulares.
- Permitir que las células tumorales que se adhieran durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Añadir 1 ml de medio dentro de la célula y la corona 1 ml externos.
- Cultura del tumormodelo bajo condiciones estáticas a 37 ° C, 5% de CO2 en la incubadora durante 14 días. Cambiar medio de cultivo cada 2 - 3 días. Por lo tanto, aspirar el medio utilizando una pipeta Pasteur y pipeta de 1 ml fresco RPMI con la cantidad apropiada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) en el interior de la corona de células y 1,5 ml del mismo medio exterior.
- Condiciones de cultivo dinámicos
- Configurar el sistema de prueba de tumor con la matriz descelularizado el interior de las coronas de células y la siembra de células como se describe en el apartado 2.1.1 a 2.1.3.
- Cultura del modelo de tumor en condiciones estáticas 37 ° C, 5% de CO2 en la incubadora durante 3 días.
- Montar el biorreactor en autoclave e insertar la cabeza de serie SISmuc según lo publicado previamente 25.
- Pipetear 45 ml de RPMI con la cantidad apropiada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) en el matraz y conectar el dispositivo de muestreo sin aguja para el sistema de tubos entre el biorreactor y elmatraz de medio.
- Coloque el biorreactor en la incubadora, conectarlo a la bomba y la cultura el modelo de tumor durante 14 días adicionales con un constante flujo medio (3 ml / min) a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Cambiar todo el medio de cultivo después de 7 días. Para ello, mover el biorreactor de la incubadora bajo una campana de flujo laminar. Aspirar el medio en el matraz de medios de comunicación usando una pipeta Pasteur. Levante el biorreactor mientras se aspira para deshacerse del medio en el sistema de tubos. Pipetear 45 ml de medio fresco en el matraz. Coloque el biorreactor de nuevo en la incubadora y conectarlo a la bomba.
3. Tratamiento de la modelo de tumor estática con Gefitinib
- Cultura el modelo de tumor tal como se describe en la sección 2.1.
- En el día 11 de la cultura, preparar RPMI / FCS con gefitinib 1 M (2,5 ml por cada corona celular). Aspirar el medio de edad de los pozos utilizando una pipeta Pasteur y se añade 1 ml de RPMI preparado / FCS / gefitinib dentro tque corona celular y 1,5 ml del mismo medio exterior.
NOTA: La solución de la gefitinib descongelado se puede almacenar a 4 ° C durante una semana. - Cambiar el medio el día 13 como se describe en el epígrafe 3.2.
4. Estimulación de el modelo de tumor estática con TGF-beta-1 para EMT inducción
- Cultura el modelo de tumor tal como se describe en la sección 2.1.
- Al día 3 de cultivo, preparar RPMI / FCS con 2 ng / ml de TGF-beta-1 con el portador (2,5 ml para cada corona celular). Aspirar el medio viejo de los pocillos utilizando una pipeta Pasteur y añadir 1 ml de preparado RPMI / FCS / TGF-beta-1 dentro de la corona de células y 1,5 ml del mismo medio exterior. Cambio de medio suplementado con TGF-beta-1 cada 2 - 3 días hasta 14 días, como se describe en 4.2.
5. Leer-outs
- La toma de muestras para las mediciones de ELISA
- Tomar muestras de los sobrenadantes de estática (sección 2.1) y (sección 2.2) cultura dinámica duranteel tratamiento con gefitinib (sección 3) en los días 11-14 de la cultura, como se indica en la figura 2. Además, tomar una muestra antes del tratamiento (T0).
- Bajo condiciones de cultivo estáticas, tomar 100 muestra l desde el interior de la corona de la célula. Bajo condiciones de cultivo dinámicos, el tornillo de la jeringuilla en el dispositivo de muestreo y tomar 1 ml de medio del sistema de biorreactor. Almacenar todos los sobrenadantes recogidos a -80 ° C hasta que se realice la prueba ELISA.
- M30-ELISA para la apoptosis La cuantificación
- Para cuantificar la apoptosis en los sobrenadantes de realizar el ensayo de muerte celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de realizar el ensayo.
- Vórtex todos los reactivos. Disolver la pastilla de lavado en agua desionizada fresca 500 ml. Diluir Conjugado HRP con 9,2 ml de tampón de dilución de conjugado y mezclar. Pipeta de 25 l de patrón o muestra por pocillo.
- Añadir 75 l de la diluido HRP conjusolución de puerta por pocillo. Cubrir la placa e incubar en un agitador durante 4 horas a temperatura ambiente. Se lava la placa de forma manual, 5 veces con 250 l de solución de lavado preparada.
- Añadir 200 l de 3,3 ', 5,5'-sustrato tetrametilbenzidina (TMB) a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. Añadir 50 l de solución de parada a cada pocillo. Agitar la microplaca durante 10 seg y dejar la microplaca durante 5 min antes de leer la absorbancia. Determinar la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas. Se calcula la curva estándar y las concentraciones en las muestras usando un programa adecuado para el manejo de datos de tipo ELISA como origen.
- La tinción de la muestra
- La fijación, inclusión en parafina y sección de la preparación del modelo 3D
- Fijar la SISmuc sembrado con 2,5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) por la corona de células durante 2 horas y incrustarlo en parafina
- Preparar 3 micras secciones de tejido para tinción como se publicó anteriormente25.
- La fijación de las células cultivadas en condiciones de cultivo 2D
- Cuando se alcanza el 70% de confluencia, lavar las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos una vez con PBS y fijarlas con 500 l 4% PFA / pocillo durante 10 minutos.
- Eliminar PFA y almacenar los cubreobjetos de vidrio en la placa de pocillos cubierta con PBS a 4 ° C hasta que se realiza la tinción.
- H & E tinción
- Tinción de las secciones rehidratadas con hematoxilina / eosina como una tinción visión general de acuerdo con protocolos estándar.
- La tinción de inmunofluorescencia del modelo 3D
- Para la tinción de inmunofluorescencia, realizar una recuperación de antígeno mediante la colocación de los portaobjetos desparafinados y rehidratados en una cocina de vapor con tampón citrato precalentado (pH 6,0) durante 20 min.
NOTA: Véase la tabla de materiales y equipos para la preparación de de tampón de citrato. - La transferencia de las diapositivaspara el tampón de lavado (tampón M PBS 0,5 + 0,5% Tween), las secciones de círculo con un lápiz PAP para minimizar el volumen requerido para soluciones de tinción y colocar los portaobjetos en una cámara de humedad.
- Bloquear las secciones de tejido con 5% de suero de la especie del huésped de los anticuerpos secundarios utilizados en la subsección 5.3.4.6 de 20 min a TA.
- Eliminar el suero de bloqueo golpeando suavemente los portaobjetos con un pañuelo de papel y aplicar el anticuerpo primario a las secciones cercadas en una dilución de acuerdo con las instrucciones del fabricante (de conejo anti Ki67 1: 100, de conejo anti vimentina 1: 100, de ratón anti pan-citoqueratina 1 : 100). Incubar O / N a 4 ° C. Para doble tinción, se deben utilizar anticuerpos primarios de diferentes especies huésped.
- lavar con cuidado el anticuerpo no unido con tampón de lavado tres veces durante 5 min.
- Para la detección de fijaciones específicas de antígeno-anticuerpo, se aplican anticuerpos secundarios en la dilución 1: 400 a las secciones y se incuba a RT durante 1 hr.
- Lavar la UnBanticuerpo ound con tampón de lavado tres veces durante 5 min.
- Montar las diapositivas con un medio acuoso que contiene DAPI a contratinción núcleos y deje que se sequen O / N.
- Para la tinción de inmunofluorescencia, realizar una recuperación de antígeno mediante la colocación de los portaobjetos desparafinados y rehidratados en una cocina de vapor con tampón citrato precalentado (pH 6,0) durante 20 min.
- La tinción de inmunofluorescencia de las células cultivadas en 2D
- Retirar PBS y cubrir los cubreobjetos de vidrio se siembra con 0,2% de Triton-X100 en PBS durante 5 min para la permeabilización. Lavar los cubreobjetos de vidrio con tampón de lavado (tampón M PBS 0,5 + 0,5% Tween) durante 5 min.
- Realice los pasos 5.3.4.3 a 5.3.4.7. Ejecutar todos los pasos en la placa de pocillos en una plataforma oscilante y eliminar los reactivos invirtiendo la placa.
- Para el montaje, detectar una gota de medio acuoso que contiene DAPI para contrateñir los núcleos sobre un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento y transferir la hoja de la cubierta a la misma con las células que se enfrenta el medio de montaje con unas pinzas. Deje que se seque antes de exponer.
- La fijación, inclusión en parafina y sección de la preparación del modelo 3D
- Determinación del índice de proliferación
- realizar inmunofluorescenciatinción Ki67 en contra de acuerdo con la sección 5.3.4. o 5.3 5.
- Tomar imágenes fluorescentes de las secciones de tejido o células cultivadas 2D con un microscopio invertido. Utilizar diferentes filtros para la toma de imágenes de tinciones DAPI y de coloraciones Ki67. Para la cuantificación, usar 10 imágenes de secciones 3D o 5 imágenes de 2D culturas (20 aumentos) de cada condición de las partes que no se solapan de la muestra.
- Determinar el número de núcleos y el número de núcleos positivos para Ki67 en 2D
- Contar Ki67 positivos núcleos utilizando manualmente el contador de células plug-in del software Fiji 26. Por lo tanto, abrir la imagen y haga clic en "Plugins" → "Analizar" → "Cell Counter". Pulse el botón "Inicializar" y seleccione un tipo de contador. Haga clic en cada núcleo Ki67 positivo. El número de clics se muestra junto al tipo de contador seleccionado.
- Para el recuento de células automática del número total de núcleos crear una macro utilizando Fiji 27,28. adjUST la macro para cada línea celular y tinción. Siguiendo, ver un ejemplo de cómo crear una macro.
- Iniciar la grabadora de macros. Abra una imagen DAPI y convertirlo a formato de 8 bits haciendo clic en "Imagen" → "Tipo" → "8 bits". Haga clic en "Mejora el contraste", establecer "saturado" como "1" y "normalizar".
- Ajuste "máscara de enfoque" para enfocar la imagen. Use un 'radio' de "1" y una "máscara" de "0,60". Haga clic en "umbral de auto", elegir el método de "RenyiEntropy" con "objetos blancos sobre fondo negro 'a binarise la imagen.
- Haga clic en "Plugins" → "BioVoxxel" → "características irregulares de las cuencas hidrográficas" con un radio erosión de "5" para separar las células. Haga clic en "Analizar" → "Analizar Partículas" y establecer el "tamaño" a "0,02-Infinito".
NOTA: El número de partículas / células esse muestra en la tabla de resumen como recuentos. - Haga clic en "Crear" para guardar la macro para el análisis de nuevas imágenes.
- Determinar el número de núcleos y el número de núcleos positivos para Ki67 en 3D manualmente como se describe en el apartado 5.4.3.1.
- Calcular el índice de proliferación media (PI) de acuerdo con la siguiente fórmula:
n = número de imágenes (3D: 10, 2D: 5)
6. En silico Generación Modelo de tumor y Simulación de la Terapia Anti-EGFR en células HCC827
- Red de Nueva Generación usando un software de análisis de red
- Utilizar diferentes bases de datos conocidos para generar la red tumor basado en las de lectura de parámetros experimentales importantes y el fondo de mutaciones de la línea celular HCC827.
- Abra el software de análisis de red 21 para visualizar elred.
- Haga clic en "Archivo" → "Nuevo" → "modelos tipo JoVE_tumor '→ haga clic en" OK "para generar una nueva red. Haga clic en "Plaza Primer Norte" → "OK" para visualizar el receptor en una membrana doble. Haga clic en "Protein genérico" para visualizar nodos (= proteínas) como rectángulos → tipo "EGFR" → haga clic en "OK"; repetir esto para cada nodo en la red.
- Etiquetar los nodos de la red: Haga clic derecho → "cambio de color y la forma ..." → seleccione para los nodos EGFR y (EGF-EGFR) código de color "255,0,0" (color rojo); Para los nodos de c-MET y código de color (c-MET) "0,255,0" (color verde); para el código de color gefitinib "255,255,0" (color amarillo); para el código de color de PI3K-INH "204204204" (de color gris claro); para el código de color de MEK-INH "102102102" (de color gris oscuro); para todos los demás nodos de la red de seleccionar el código de color4; 255,255,255 "(de color blanco).
- Haga clic en "fenotipo" para visualizar los parámetros de lectura que la hexágonos → tipo "proliferación" → haga clic en "Aceptar" → → Haga clic derecho en "Cambio de color y de la forma ..." → seleccione el código de color "255204204" (salmón color); repetir este parámetro para la apoptosis → elige color de código (color violeta) "255,51,204".
- Visualizar bordes (= interacciones): Haga clic en "estado de transición" para las activaciones (flechas), Haga clic en "Inhibición" de inhibiciones (flechas romas); repetir esta operación para cada interacción en la red.
- Haga clic en "Archivo" → "Guardar como ..." → Tipo 'JoVE_tumor models.xml' → haga clic en "Guardar" para guardar la red de señalización generado como .xml formato.
- Simulación in silico usando PLANTILLA
NOTA: Parte del Equipo representa THe topología de la red como un sistema discreto lógica booleana (AND, OR, NOT) y lleva a cabo un análisis de estado estacionario. El análisis de estado estacionario refleja el equilibrio del sistema y de la responsabilidad sobre los estímulos de señalización (por ejemplo., La aplicación del fármaco o mutación).- Software abierto ESCUADRÓN 17, Haga clic en el archivo 'JoVE_tumor models.xml' "carga de red" → subida. Haga clic en "Ejecutar el análisis":
NOTA: A continuación, se aplica PLANTILLA función exponencial para interpolar la conectividad de red de Boole, que permite la simulación dinámica del comportamiento de la red a través del tiempo (de color curvas de actividad sigmoide). - Haga clic en "Avanzado" → "perturbadoras" para escribir un protocolo de simulación. Simular la resistencia anti-EGFR: Haga clic en "Editar Protocolo"
- Haga clic en "perturbación" → utilizar estándar "initialState = SS-4" (estado estacionario 4) → haga clic en "Agregar" para agregar "nuevo pulso constante '→ Select parámetro "estado" → Seleccionar objetivo "FLIP" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar valor "0.4" → Haga clic en "Aceptar".
- Repita este: Haga clic en "Añadir" → Seleccionar el parámetro "estado" → Seleccionar objetivo "c-MET" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar valor "0.4" → Haga clic en "OK"; Haga clic en "Añadir" → "Estado" Seleccionar el parámetro → Seleccionar objetivo "gefitinib" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar el valor "1" → Haga clic en "Aceptar".
- Establecer un valor de estado de nodo activo (EGF-EGFR): Haga clic en "activenode" → Haga clic en "Editar" → Seleccionar estado "0.8" → Haga clic en "OK"; para todos los demás nodos: Haga clic en "Editar" → Seleccione el estado "0" → Haga clic en "Aceptar". Haga clic en "Aceptar" para guardar el protocolo.
- Mostrar curvas específicas: Ir al panel de "Opciones" → Seleccionar "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspasas", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptosis", "proliferación", "MEK-INH" y "PI3K-INH" para la representación gráfica. Haga clic en "Inicializar" → "Ejecutar" para iniciar una simulación completa de la respuesta del sistema. Haga clic en "Reset" para comenzar una nueva simulación.
- Simular PI3K combinado y tratamiento inhibidor de MEK: Haga clic en "Editar Protocolo"
- Utilizar el mismo parámetro de nodo como se describe en 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Haga clic en "perturbación" → Haga clic en "Añadir" para añadir "nuevo pulso constante" → "Estado" Seleccionar el parámetro → Seleccionar objetivo "PI3K-INH" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar el valor "1" → Haga clic en "OK"; Haga clic en "Añadir"añadir "nuevo pulso constante" → "Estado" Seleccionar el parámetro → Seleccionar objetivo "MEK-INH" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar el valor "1" → Haga clic en "Aceptar".
- Haga clic en "Aceptar" para guardar el protocolo. Ir al panel de "Opciones": Utilizar la misma nodos para la representación gráfica como se describe en 6.2.2.4. Haga clic en "Inicializar" → "Ejecutar" para iniciar una simulación completa de la respuesta del sistema. Haga clic en "Reset" para terminar la simulación.
- Software abierto ESCUADRÓN 17, Haga clic en el archivo 'JoVE_tumor models.xml' "carga de red" → subida. Haga clic en "Ejecutar el análisis":
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Representative Results
Sobre la base del andamio SISmuc (Figura 2A a C), se estableció un protocolo de funcionamiento estándar para la generación, la estimulación y el tratamiento de un sistema de prueba tumor 3D (Figura 2D). Este modelo permite la determinación del índice de proliferación y la cuantificación de la apoptosis utilizando M30-ELISA como se muestra en la Figura 1 y la Figura 3, respectivamente. La figura 3 muestra representativa H & E tinción de los modelos A549 y HCC827 y una medición apoptosis representante con gefitinib. El modelo que aquí se presenta se ha diseñado utilizando el ejemplo de EGFR NSCLC -mutated que es tratado con éxito con inhibidores específicos en la clínica. En consecuencia, sólo el EGFR -mutated HCC827 células y no las células A549 responden a la inhibición de EGFR TKI por el gefitinib en nuestro modelo como evaluado por el aumento de la apoptosis. Figura 4 Figura 5C y D. También en condiciones de cultivo dinámicos gefitinib tiene un fuerte efecto sobre EGFR HCC827 -mutated (Figura 5D).
La Figura 6 muestra la topología de la red (Figura 6A) y detallado en las simulaciones silico de anti-resistencia a la terapia EGFR en HCC827 células (Figura 6B, C). La red de señalización se ha generado utilizando bases de datos conocidos en la bibliografía tales como HPRD, KEGG y QIAGEN (Genes & Pathways), resultando en una topología de 42 nodos y 55 bordes, visualizado con software CellDesigner 26. La simulación del controlador conocido mutación de EGFR (en rojo) y c-MET co-activación (en verde, valor en torno a 0,7) muestra un incremento en proltasa iferation (curva de salmón) y una tasa de disminución de la apoptosis (curva violeta) a través del tiempo que refleja gefitinib (en amarillo) resistencia en HCC827 células ir junto con una activación de MEK y PI3K (Figura 6B, verde oscuro y cian). Modelización de PI3K combinado y el inhibidor de MEK (oscuro y curvas de color gris claro) da como resultado una reversión del efecto anti-resistencia EGFR, reduce la proliferación e induce la apoptosis (Figura 6C).
Figura 1. Proliferación tipo se reduce en comparación con 3D 2D de cultivo celular. HCC827 células Ki67-positivo (rojo en A y B) se tiñeron en cultivo celular 2D (A) y el cultivo de células en 3D SISmuc (B). Células HCC827 y células A549 se contaron y se determinó el índice de proliferación (porcentaje de células Ki67 positivas) (C </ Strong>, un representante de cada cinco contando). Las barras de escala en A y B:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. SISmuc Andamios Morfología y programa de tratamiento con el TKI Gefitinib Las células se siembran en el SISmuc que consta de submucosa del intestino delgado (SIS) + mucosa (A:. Campo claro, B: células DAPI manchado en la parte superior de la SISmuc, C: superposición de a y B) y se fija en coronas de células en el día 0. se muestra el esquema de tratamiento en D: cambios de medio (MC) se llevan a cabo cada 2 a 3 días. En el día 11, el tratamiento comienza. Los sobrenadantes se recogen y se utilizan para M30-ELISA con el fin de cuantificar la apoptosis a través del tiempo (flechas azules y cajas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Tratamiento Gefitinib cambios en las células de crecimiento en el SISmuc e induce la apoptosis en HCC827, pero no en modelos de tumores A549 en 3D. Sin ningún tratamiento, las dos líneas celulares formar una monocapa sobre la SISmuc (A y B) y también resolver estructuras anteriores de las criptas. Mientras que el patrón de crecimiento de las células A549 no se cambia después del tratamiento con gefitinib (C), el número de células HCC827 se redujo acompañado de un cambio a una forma de la célula alargada (D). La apoptosis es inducida por gefitinib en modelos HCC827 como se ve por las mediciones M30-ELISA de sobrenadantes de cultivo (E D:. 100 micras para la A a la D Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. TGF-beta-1 induce la EMT en HCC827 en celdas en el SISmuc. HCC827 células cultivadas en 3D muestran una expresión general de pan-citoqueratina (PCK) (verde en A, A1), pero sólo las células individuales expresan vimentina (rojo en A, a2). Después de TGF-beta-1 estimulación, las células cambian de morfología a una forma alargada y la expresión de vimentina se incrementa fuertemente (rojo en B, b2), mientras que la expresión de PCK se mantiene (verde en B, b1). La barra de escala en B: 100 micras para una B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Cultivo de células Dinámico Mejora Tissue Generation. Cuando se cultiva en condiciones 3D en un biorreactor (B), la monocapa de la modelo estático (A, tinción H & E) cambia de una monocapa (A) a un tejido de múltiples capas (tinción C, H & E ). HCC827 células muestran una fuerte respuesta a los fármacos tras el tratamiento con gefitinib (tinción D, H & E). La barra de escala en D:. 100 micras para A, C, y D Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Higo. 6. En Silico Generación Tumor del modelo y de la simulación de la topología de Anti- EGFR Terapia Resistencia. Red de una célula tumoral con nodos de señalización claves en (vía EGFR) rojo y verde (c-MET) y sus nodos de aguas abajo. El tumor característico parámetros de la proliferación de lectura (en el salmón) y la apoptosis (en violeta) se representan como hexágono. Las flechas indican la activación, inhibición flechas de punta roma. Dianas terapéuticas están representadas por rectángulos grises claros y oscuros, la inhibición por gefitinib se muestra en amarillo (A). Simulación dinámica por e-funciones (curvas de colores) interpolar la conectividad de red booleana (AND, OR, NOT). EGFR y c-MET co-expresión de causa resistencia a gefitinib como se indica por un aumento de la proliferación (curva de salmón) y adecrease de la apoptosis (curva violeta) después de aproximadamente arbitraria tiempo del punto 8 (B). Tacleadas potenciales de terapia tanto PI3K y MEK por inhibidores (bajo la curva amarilla; misma activación, véase el protocolo). (C) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos establecido un combinarse in vitro / in silico sistema de prueba de tumor para las predicciones de tratamiento de biomarcadores guiada. El modelo in vitro evalúa diferentes aspectos importantes de acciones compuestas tales como cambios en la proliferación de células tumorales y la apoptosis en un fondo mutacional específico que también se pueden simular in silico 17. A continuación, presentamos el protocolo estandarizado para la generación de modelos 3D del tumor y el ensayo en recintos incluyendo la cuantificación de la proliferación y la apoptosis y el establecimiento de un modelo predictivo en silico. El modelo de tumor de 3D se basa en líneas de células tumorales que llevan mutaciones específicas. Las células se cultivan en una matriz de tejido descelularizada en coronas de células. Descelularización Matrix, la fijación entre los dos anillos de metal (coronas de células), el montaje del sistema de biorreactor, así como la siembra del andamio se han visualizado en JoVE antes de 25.
In vitro Tumor Modelo 3D
La traducción de los resultados aquí obtenidos en la clínica requiere una cuidadosa selección de las células tumorales adecuadas que llevan mutaciones de interés con el fin de clasificar a los pacientes según biomarcadores para medicamentos dirigidos seleccionados. Para la medicina estratificada, la identificación de mutaciones conductor druggable mediante secuenciación de próxima generación es una preocupación importante sobre todo en NSCLC y se espera que revelar nuevos marcadores genéticos en el futuro 29. Para la prueba in vitro, el compuesto de interés debe dirigirse a un sitio que es altamente activo en la línea celular elegida o en células primarias. Aquí, las líneas celulares HCC827 y A549 se eligieron debido a su diferencia en el estado de mutación de EGFR e informaron de hipersensibilidad (HCC827 células) y la sensibilidad intermedia (células A549) hacia el gefitinib TKI en cultivo 2D 30-32. En el primer paso de la generación de modelo de tumor, el número y el cultivo de células 3D período del tumor seleccionado células tienen que ser ADJUsted si se utilizan células diferentes de las aquí mencionadas. Para encontrar la concentración de compuesto óptima, es aconsejable para determinar el valor de IC50 con la ayuda de un ensayo de viabilidad disponible comercialmente en 2D. Sobre la base de esta prueba, el compuesto se debe utilizar en la concentración IC50 y la siguiente concentración más alta en los modelos 3D. Hemos elegido tres días de tratamiento, por un lado con el fin de obtener resultados dentro de dos a tres semanas y para facilitar la comparación con los sistemas de prueba de tumor en 2D en la otra mano. Sin embargo, los períodos de tratamiento se puede prolongar para investigar-plazo efectos largos. Sin embargo, se debe considerar que el tratamiento a largo plazo o altas dosis de compuesto ensayado pueden causar la pérdida de células completa evitando de este modo la evaluación de la proliferación o de otros marcadores inmunohistoquímicos.
Para el análisis de red de señalización fiable, las respuestas tumorales en el tratamiento con un cierto compuesto tienen que ser analizados para distinguir entre la proliferación y apoptosis. Estos-outs leídos están conectados de manera diferente en la red de señalización. Por lo tanto, el análisis de distintivo de ambos parámetros permite una mejor comprensión de la acción del fármaco y la posterior predicción de destino. Como se mencionó antes, la proliferación de las células tumorales se reduce en nuestro modelo 3D en comparación con las condiciones de cultivo 2D y, por tanto, debería reducir los resultados falsos positivos de compuestos citostáticos probadas. Para la determinación del índice de proliferación, el número total de núcleos y el número de núcleos positivos para la tinción de Ki67 tienen que ser cuantificada usando el software Fiji por ejemplo. Esto se puede simplificar el uso de macros en cultivos 2D de las células tumorales, que es, sin embargo, no es posible si las células forman agregados ajustados ya que esto da lugar a números más bajos o más altos de los núcleos, respectivamente. En todos los casos, los valores de la macro tienen que ajustarse cuidadosamente para cada línea celular y tinción. La apoptosis se puede cuantificar de forma no invasiva de los sobrenadantes de medición citoqueratina caspasa-escindido 18, whICH se limita a las células con características epiteliales, utilizando M30-ELISA. Esto tiene varias ventajas: I) Se permite monitorizar la eficacia del tratamiento en el tiempo y para identificar el punto de partida de un tratamiento eficaz. Ii) muestras no se destruyen y se pueden utilizar para otras técnicas de lectura. III) la apoptosis de células epiteliales se puede distinguir de la apoptosis mesenquimales, que es óptima en la configuración de co-cultivo. Esta técnica, sin embargo, podría no ser apropiado para las células tumorales que se sometieron a EMT, perdiendo así su fenotipo epitelial. Por lo tanto, la expresión de citoqueratina 18 de cada línea de células tumorales utilizada debe ser verificada mediante coloraciones de inmunohistoquímica antes de aplicar esta técnica. Ensayos de compuestos también se puede realizar en un fenotipo de células como más madre tumorales. Por lo general, en las pruebas de drogas diferentes etapas invasivas se descuidan a pesar de que la mayor parte de los fármacos dirigidos, como ITC, se aplican en las fases del tumor más avanzados. Nuestro modelo permite la investigación de los invasivo o ningunacélulas tumorales n invasiva, debido a la membrana basal conservado 17 el que las células tienen que cruzar durante el proceso de invasión. Un paso crucial hacia la motilidad celular y la invasión es la EMT que puede ser inducida en diferentes modelos de cáncer de pulmón por la estimulación con TGF-beta-1 17,33. Esto, sin embargo, reduce el número de células de proliferación y de este modo en el andamio. Este efecto secundario negativo se puede evitar mediante la aplicación de condiciones de cultivo dinámicos que aumenta considerablemente la densidad de células del tumor en los modelos 3D. A pesar de que el biorreactor se ajusta cultura a las condiciones fisiológicas, se ha de tener en cuenta que las propiedades de células y la señalización pueden ser influenciados por la exposición a la tensión de corte 25.
Prueba de la droga utilizando simulaciones in silico para acelerar la línea celular específica
Aunque sólo semi-cuantitativa, la secuencia de eventos está correctamente modelado por nuestro modelo de silico por la atenciónteniendo en cuenta plenamente las mutaciones conocidas para cada línea celular específica. Esto incluye la línea celular modificaciones específicas de los diferentes niveles de activación del receptor, el grado en el que participaron quinasas se activan y cuándo y cuánto tiempo de salida de la red tales como la apoptosis o la proliferación es de esperar. Por ejemplo, se puede considerar clínicamente conocidos amplificaciones c-MET que se cree que ocurre en aproximadamente el 20% de anti-EGFR adquirido resistencia a la terapia 30. Posteriormente, el modelo in silico calcula el comportamiento de la red correspondiente en el tiempo, por ejemplo., El desarrollo de resistencia a gefitinib representado por aumento de la proliferación y la disminución de la apoptosis. En nuestro modelo, hemos identificado MEK y PI3K como los candidatos más prometedores de destino. En consecuencia, la nueva combinación terapéutica potencial puede ser rápidamente pre-evaluada in silico, que sirve como base para nuevos ensayos in vitro. Además, los datos de salida de los experimentos in vitro puedenser utilizados para refinar el sistema en silico por los ajustes de red que se ajustan a los resultados experimentales mejor. Semi-cuantitativa en las estrategias de silico tiene algunas limitaciones en cuanto a tamaño de la red (alrededor de 100 interacciones proteína-proteína pueden ser considerados). Además, es fundamental para integrar todos los nodos de la proteína clave en la topología de la red a fin de producir resultados realistas. Así, el modelo in silico da sólo una aproximación de la red existente en la célula tumoral de estar. Sin embargo, esta visión enfocada nos permite simular los cambios específicos de interés, por ejemplo., El efecto de las combinaciones de fármacos en diferentes fondos de mutaciones en la línea celular. Esto nos ayuda a comprender de forma sistemática la complejidad de este tipo de redes de señalización cáncer, así como derivar nuevas estrategias terapéuticas.
En conclusión, estamos convencidos de que hemos desarrollado un tejido útil herramienta de ingeniería en vitro que podrían ser fácilmente integrado en preclipruebas nica en la eficacia de los compuestos de fármacos individuales y sus combinaciones. Para reducir costes y tiempo en el ensayo, este modelo de tumor está además complementada por una en la herramienta de predicción in silico que permite extender los datos recogidos para una predicción específica del tipo de célula de la combinación de drogas de drogas y los efectos incluyendo terapias orientadas a la clínica de orientación o los nuevos jugadores a tener en cuenta (por ejemplo., miRNAs).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue patrocinada por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF, BD247 subvención) del Hospital de la Universidad de Würzburg y el programa Bayern Fit (concedida a Heike Walles).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | This software was used for drawing the network. |
| Citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. | |
| Citrate buffer working solution | in house production | 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal Calf Serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4% (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37 °C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | - | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5 ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
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