Abstract
Bu çalışmada, biz belirli bir mutasyon birikimine göre ilaç yanıtının tahminler optimize etmek için siliko modelinde bir bir in vitro 3D akciğer tümörü modeli birleştirdi. Model bazal membran içeren hücre dışı matris kompozisyon ve mimarlık ile ilgili dokuya özgü özellikleri üretir bir decellularized domuz iskele üzerinde oluşturulur. Biz ilaç tedavisinin üç gün olmak üzere 14 gün içinde yapay tümör dokusu nesil sağlayan bir protokol standardize. Bizim makale 3D birkaç ayrıntılı açıklamaları Okuması tarama teknikleri etkinliğini değerlendirmek için yararlı araçlar vardır mezenkimal geçiş M30-ELISA ile süpernatanlarından proliferasyon indeksi Ki67 boyama kıyafetleri, apoptoz tespiti ve epitel değerlendirilmesi (EMT), gibi sağlar terapötik bileşikler. Biz 2B kültürüne Relat olan 3D tümör modelinde çoğalması bir azalma karşılaştırıldığında gösterisi olabilirKlinik duruma ed. Bu, daha az çoğalma rağmen, model HCC827 akciğer karsinoma hücre çizgilerinin karşılaştırılması ile gösterildiği gibi doğru bir şekilde biyomarker durumuna göre EGFR -targeted ilaç yanıtları tahmin (EGFR -mutated Kras vahşi tip) ve A549 (EGFR vahşi tip Kras - tirozin-kinaz inhibitörü (TKİ) gefitinib ile tedavi) mutasyona uğramış. vimentin / pan-sitokeratin immünofloresan boyama ile değerlendirilen daha gelişmiş tümör hücrelerinin ilaca cevabı araştırmak için, TGF-beta-1 uzun vadeli tedavisi ile EMT neden olmuştur. Bir akış biyoreaktör dokusu oluşumunu geliştirilmiş fizyolojik koşullar, kültürün ayarlamak için kullanıldı. Apoptoz, proliferasyon indeksi ve EMT - - Boolean içine siliko modelinde Ayrıca, gefitinib tedavisi veya TGF-beta-1 stimülasyon üzerine ilaç yanıtları entegrasyonunu göstermektedir. Buna ek olarak, belirli bir mutasyon arka plan ve sayısı ile tümör hücrelerinin kadar ilaca cevabı açıklardirence karşı erstrategies tahmin edilebilir. Biz özellikle de siliko genişlemesi ile in vitro yaklaşımında bizim 3D ve 2D hücre kültüründe daha gerçekçi koşullarda klinik öncesi uyuşturucu testi için ek bir değer sağlar eminiz.
Introduction
İlaç endüstrisi çok büyük maliyetler 1-5 sebep klinik fazda kanser tedavisi alanında% 95'e varan yüksek aşınma oranları ile karşı karşıyadır. Bu açık bir nedeni, şu anda potansiyel yeni bileşiklerinin etkinliği kanseri hücre çizgilerinin 2B hücre kültürlerinde ya da hayvan modellerinde geniş ölçekli taramalarında değerlendirilir gerçektir. Hayvan modelleri daha yüksek bir karmaşıklık var ama fareler ve erkekler 6,7 arasında önemli farklılıklar vardır. Son on yılda, farklı yaklaşımlar kullanarak 3D kanser modelleri 2D kanser hücre çizgilerinin kültürü ve in vivo tümör 6,8,9 bir kompleks arasındaki boşluğu doldurmak için oluşturulmuştur. Hücre farklılaşması üzerine ve aynı zamanda sinyalizasyon 3D çevrenin etkisi yıllar önce çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (örneğin., Mina Bissell tarafından) 10,11. Bugün, birçok 3D hücre kültürü modelleri, sfero kültürlerin, hidrojeller veya mikroakışkan cips 12-16 olarak mevcuttur. Hatta thes rağmenE modelleri çoğunlukla, aynı zamanda, tümör-destekleyici etkileri ve etkiler ilacın etkinliği olduğu bilinen bir doku mikro-eksikliği geleneksel 2B kültür sistemlerine kıyasla karmaşıklığı artırır.
Bu sorunu gidermek için, biz bir decellularized domuz jejunum türetilmiştir SISmuc (küçük-bağırsak-submukoza + mukoza) olarak adlandırılan biyolojik iskele dayalı bir 3D tümör modeli oluşturulur. Böylece, doku mimarisi ve farklı kolajenler yanı sıra bazal membran yapısı olarak ECM önemli bileşenleri 17 korunur. Bu eşsiz özellik epitelyumdan ortaya çıkan ve katı tümörlerin yaklaşık% 80 ihtiva karsinom tümör modeli üretimi için çok önemlidir. Ayrıca, doku mühendisliği tümör modelinde proliferasyon hızı 2B kültür elde yapay yüksek oranlara göre azalır. çoğalma ilaç etkinliğini değerlendirmede önemli bir parametredir gibi uyuşturucu testi daha benzer bizim modelinde etkindirin vivo koşullar 17 tümörler.
Doğru olarak EGFR -biomarker statüsünde farklılık iki farklı akciğer kanseri hücre hatları için, biz burada mevcut verileri biyobelirtecin bağımlı ilaç etkinliğini tahmin etmek bizim modelin potansiyelini değerlendirmek için. Bu mutasyon durum KHDAK hastalarında rutin belirlenmeye başlamıştır. Bu tür platin bazlı kemoterapi 18-21 olanlara göre bir aktive EGFR mutasyon göstermek üstün sonuçlar taşıyan tümörlere karşı EGFR -inhibitor gefitinib olarak TKİ ile hedefe yönelik tedaviler.
Biz bileşik etkinliğini değerlendirmek için önemli olan birkaç okuma-out teknikleri kurdu. Ayrıca, TGF-beta-1 ile uyarıldıktan sonra habis dönüşüm 22,23 önemli bir adım olduğu düşünülmektedir ve ilaç dayanı bağlı olan EMT sürecini başlatan, tümör hücrelerinde bileşik işlemleri araştırabilirizce 24.
3D tümör modeli hedeflenen tedaviler, kemoterapi, ya da iyi tezat ilaç kombinasyonlarına hücreye özel yanıtları izlemek izin verir. Geliştirmek ve uyuşturucu taraması hızlandırmak ve direnç karşılaşma için, bu siliko simülasyon bir tamamlanmaktadır. Bir kaç deneylere dayanarak, tümör yanıtı ilaçlar ve bunların kombinasyonları bir dizi için sonuçlarına ilişkin siliko tahmin edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İki boyutlu (2D) Hücre Kültürü
- Ticari olarak, tümör hücre çizgisi HCC827 (DSMZ) elde. Kültür RPMI-1640 içinde akciğer adenokarsinomu hücre soyu HCC827 (mutasyona uğramış EGFR Kras vahşi tip)% 20 FCS ile takviye edilmiştir. 3 gün - her 2 orta değiştirin. Bir haftada iki kez hücreleri bölün. geçidi 20 ulaşana kadar hücreleri kullanılır.
- Ticari olarak tümör hücre dizisi A549 (DSMZ) edinin. Kültür akciğer karsinoma hücre soyu, A549 (EGFR vahşi tip Kras mutasyona uğramış), RPMI-1640 içinde% 10 FCS ile takviye edilmiştir. yukarıda belirtildiği gibi kültür gerçekleştirin. geçidi 20 ulaşana kadar hücreleri kullanılır.
- (- 6 hafta her 4) gibi mikoplazma kontaminasyon olarak kontaminasyon için düzenli hücreleri test edin.
- Cam lamelleri A549 veya HCC827 hücreleri Kültürleme
- Bir cımbız kullanarak 24 oyuklu plakanın her bir 1, steril cam lamel.
- Wells 500 ul bir hacimde her iki hücre hattına Tohum 50,000 tümör hücreleriCam lamelleri, sırasıyla.
- Kültür hücreleri, standart kültür koşulları altında% 70 konfluent ulaşana kadar (37 ° C,% 5 CO2). Bu süre zarfında, bir Pasteur pipeti kullanarak eski orta aspire ve her 2 500 ul taze orta ekleyin - kültür 3 gün.
Biyolojik Kollajen Scaffold Tümör Testi Sistemleri 2. Nesil
- Statik Kültür Koşulları
- Hücresizleştirilmiş ince bağırsak-alt mukozayı + mukozayı (SISmuc) oluşturmak ve önceki yayında 25'te tarif edildiği gibi, iki metal halkalar olarak adlandırılan hücre tepeleri arasındaki sabitleyin.
- Hücre kron sabit gut eski lümeninin yüzüne 500 ul toplam hacim içinde HCC827 ya A549 hücreleri, ya bir tohum 100,000 hücre.
- Tümör hücreleri, 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 2 saat boyunca yapışmaya izin verin. Hücre taç içinde 1 ml orta ekleyin ve dışarıda 1 ml.
- tümör Kültür37 ° C'de statik koşullar altında bir model, 14 gün boyunca kuluçka makinesi içinde% 5 CO2. 3 gün - her 2 kültür ortamı değiştirin. (:% 10, HCC827:% 20 A549) hücre taç içinde ve dışında aynı ortamın 1.5 ml Bu nedenle, bir Pasteur pipeti ile pipet FCS uygun miktarda, 1 ml taze RPMI kullanılarak orta aspire.
- Dinamik Kültür Koşulları
- 2.1.3 için alt bölüm 2.1.1 bölümünde açıklandığı gibi hücre kron ve hücre tohumlama içinde decellularized matriks ile tümör testi sistemi kurmak.
- Kültür, statik koşullar altında bir tümör modeli 37 ° C, 3 gün boyunca kuluçka makinesi içinde% 5 CO2.
- Otoklava biyoreaktör monte edin ve daha önce 25 olarak yayınlanan numaralı seribaşı SISmuc yerleştirin.
- Pipet FCS uygun miktarda 45 ml RPMI (A549:% 10, HCC827:% 20) flask içine ve biyoreaktör arasındaki boru sistemine iğnesiz örnekleme cihazı bağlamakOrta bir şişe.
- , Inkübatör biyoreaktör yerleştirin, 37 ° C,% 5 CO2 de sabit bir orta akış (3 mL / dakika) ile pompa ve kültüre ilave 14 gün boyunca, tümör modeli bağlayın.
- 7 gün sonra tüm kültür ortamı değiştirin. Bunun için, bir laminar akış başlığı altında inkübatörden biyoreaktör hareket ettirin. Pasteur pipeti kullanarak medya şişede orta aspire. boru sisteminde orta kurtulmak için aspire ederken biyoreaktör yukarı kaldırın. balona Pipet 45 ml taze ortam. geri kuvöz içine biyoreaktör yerleştirin ve pompa bağlayın.
Gefitinib ile statik Tümör Modelinin 3. Tedavi
- Kültür bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi tümör modeli.
- kültürün 11. günde, 1 uM gefitinib (her bir hücre taç 2.5 mi) ile RPMI / FCS hazırlar. Pasteur pipeti kullanarak kuyulardan eski orta aspire ve t içinde hazırlanan RPMI / FCS / gefitinib 1 ml ekleyino hücre taç ve dışında aynı ortamda 1.5 ml.
Not: çözülmüş gefitinib stok çözeltisi bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. - alt bölüm 3.2 altında açıklanan günde 13 de orta değiştirin.
EMT İndükleme TGF-beta-1 ile statik Tümör Modeli 4. stimülasyonu
- Kültür bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi tümör modeli.
- Kültür 3. günde, 2 ng / ml TGF-beta-1 bir taşıyıcı ile (her bir hücre taç 2.5 mi) ile RPMI / FCS hazırlar. Pasteur pipeti kullanarak kuyulardan eski orta aspire ve 1 hazırlanmış RPMI / FCS / TGF-beta-1 hücre taç içinde ml ve dışında aynı ortamda 1.5 ml ekleyin. 4.2 altında tarif edildiği gibi, 14 gün kadar 3 gün - Orta TGF-beta-1, her 2 ile takviye edilmiş değiştirin.
5. Oku-çıkışları
- ELISA Ölçümleri Numune alınması
- Statik (bölüm 2.1) ve dinamik (bölüm 2.2) kültür süpernatantlar sırasında numune almayagün kültür 11-14 Şekil 2'de gösterildiği gibi en gefitinib (bölüm 3) ile tedavi. Ayrıca, tedavi (T0) öncesinde bir örnek almak.
- Statik kültür koşulları altında, hücre taç içinden 100 ul örnek almak. Dinamik kültür koşulları altında, örnekleme cihazı şırınga vida ve biyoreaktör sistemin dışına 1 ml orta almak. ELISA gerçekleştirilene kadar -80 ° C'de ve toplanan yüzey maddeleri saklayın.
- Apoptoz Niceleme için M30-ELISA
- Üst fazlar, üreticinin talimatlarına göre hücre ölümü tahlili gerçekleştirmek apoptozu ölçmek için. tüm reaktifler tahlil yapmadan önce RT ulaşmasına izin verin.
- Vortex tüm reaktifler. 500 ml yeni, iyonu giderilmiş su, yıkama tableti çözülür. Konjuge Seyreltme Tampon 9.2 ml HRP Eşlenik sulandırılır ve karıştırılır. Pipet standart veya numune başına kuyunun 25 ul.
- seyreltilmiş HRP konjugat 75 ul ekleyinoyuk başına kapısı çözeltisi. plaka Kapak ve oda sıcaklığında 4 saat süre ile bir çalkalama inkübe. plakayı yıkayın, el ile hazırlanan yıkama çözeltisi 250 ul 5 kez.
- Her bir oyuğa, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) substrat 3,3 '200 ul ekle. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Her bir oyuğa durdurma çözeltisi 50 ul ekle. 10 saniye mikroplağı çalkalayın ve absorbansı okumadan önce 5 dakika boyunca mikroplağı bırakın. mikroplaka okuyucu içinde 450 nm'deki absorbans belirler. Standart eğri ve Menşe olarak ELISA tipi verilerini işlemek için uygun bir program kullanarak örneklerinde konsantrasyonları hesaplayın.
- örnek Boyama
- Tespit, Parafin gömme ve 3D Model Bölüm Hazırlanması
- 2 saat boyunca hücre taç başına 2.5 ml% 4 paraformaldehid (PFA) kullanılarak numaralı seribaşı SISmuc düzeltmek ve parafin içine gömmek
- Daha önce yayınlanan boyama 3 um doku bölümleri hazırlanması25.
- 2B kültür koşullarında yetiştirilen hücreler sabitlenmesi
- % 70 birleştiği ulaşıldığında, bir kez PBS ile 24 oyuklu plaka cam lameller üzerine kültürlenmiş hücreler yıkama ve 500 ul% 4 PFA / oyuk 10 dakika sabitleyin.
- PFA çıkarın ve boyama gerçekleştirilir kadar 4 ° C 'de PBS ile kaplı iyi plaka cam lameller saklayın.
- H & E Boyama
- standart protokollere göre bir genel boyama olarak da Hematoksilin / Eosin ile yeniden hidrate edilmiş kısımlar Leke.
- 3D Model immunofluorescent Boyama
- immünofloresan boyama, 20 dakika boyunca ısıtılmış sitrat tamponu (pH 6.0) ile buhar ocak içine deparafinize ve rehidre slaytlar yerleştirerek bir antijen alımı gerçekleştirmek.
NOT: sitrat tamponu hazırlamak için Malzeme ve Ekipmanları en tablosuna bakın. - slaytlar aktarınYıkama tamponu (0.5 M PBS tamponu +% 0.5 Tween) için, PAP kalemle daire bölümleri boyama çözümü için gerekli hacmi en aza indirmek için ve bir nem odasında slaytlar yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca alt bölüm Genel bakış 5.3.4.6 kullanılan ikincil antikor konak türlerinden% 5 serum ile doku bölümleri bloke.
- 100, tavşan anti vimentin 1: 100, fare anti-pan sitokeratin-1 üreticinin talimatlarına (Ki67 1 anti tavşan uygun bir seyreltme çevrelediği bölümlere birincil antikor yavaşça kağıt doku slaytlar dokunarak bloke serumu çıkarın ve geçerli : 100). 4 ° C'de O / N inkübe edin. çift boyama için, farklı ev sahibi türünden birincil antikorlar kullanılmalıdır.
- Dikkatle 5 dakika boyunca yıkama tamponu ile üç kez, bağlanmamış antikor yıkayın.
- bölümlere 400 ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin: spesifik bir antijen-antikor bağlama belirlenmesi için, seyreltme 1 sekonder antikor uygulayın.
- unb yıkayınYıkama tamponu ile ikamesi, antikor, 5 dakika için üç kez.
- çekirdekleri counterstain ve kuru O / N onlara izin DAPI içeren sulu ortam ile slaytlar monte edin.
- immünofloresan boyama, 20 dakika boyunca ısıtılmış sitrat tamponu (pH 6.0) ile buhar ocak içine deparafinize ve rehidre slaytlar yerleştirerek bir antijen alımı gerçekleştirmek.
- 2B Kültür Hücrelerinin immunofluorescent Boyama
- PBS çıkarın ve geçirgenliği 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 Triton-X100 ile tohumlanır cam kapak slipi üzerinde kapsamaktadır. 5 dakika boyunca yıkama tamponu (0.5 M PBS tamponu +% 0.5 Tween) ile cam kapak slipi üzerinde yıkanır.
- 5.3.4.7 adımları 5.3.4.3 yapınız. sallanan bir platform üzerinde iyi plaka tüm adımları çalıştırır ve plakayı baş aşağı çevirerek reaktifler uzaklaştırılır.
- Montaj için, kaplanmamış bir cam slayt üzerine çekirdekleri counterstain ve forseps kullanılarak montaj orta bakan hücreleri ile buna kapak kayma aktarmak için DAPI içeren sulu bir ortam içinde bir damla nokta. görüntüleme önce kurumaya bırakın.
- Tespit, Parafin gömme ve 3D Model Bölüm Hazırlanması
- Çoğalma Endeksi Belirlenmesi
- immunofluorescent gerçekleştirin5.3.4 uygun Ki67 karşı boyama. veya 5.3 5.
- bir inverted mikroskop ile doku bölümleri veya 2D kültürlenmiş hücrelerin flüoresan görüntülerini almak. DAPI boyamalar ve Ki67 boyamalar görüntülerini çekmek için farklı filtreleri kullanın. ölçümü için, numunenin çakışmayan parçaları ile her bir durum 3D bölümden 10 görüntü ya da 2 boyutlu kültürleri (20x büyütme) 5 görüntülerin kullanımı.
- 2B Ki67 için çekirdek sayısını ve pozitif çekirdeklerin sayısını belirler
- Ki67 el Yazılımın Fiji 26 eklenti hücre sayacını kullanarak olumlu çekirdekleri sayın. Bu nedenle, görüntüyü açmak ve "Eklentiler" → "Analiz" → "Hücre Sayaç" tıklayın. Basın "Başlatma" ve karşı türünü seçin. Her Ki67 pozitif çekirdeğin üzerine tıklayın. tıklama sayısı, seçilen sayaç tipi yanında gösterilir.
- Çekirdeklerin toplam sayısının otomatik hücre sayımı Fiji 27,28 kullanarak bir makro oluşturun. adjust her boyama ve hücre hattı için makro. Ardından, bir makro oluşturmak için nasıl bir örnek görmek.
- Makro kaydedici başlatın. DAPI-görüntü açın ve "Görüntü" → "Tip" → "8-bit" tıklayarak 8 bit biçimine dönüştürmek. Set "normalleştirmek", "1" olarak "doymuş" ve "kontrast geliştirin" tıklayın.
- Görüntüyü netleştirmek için "keskin olmayan maske" olarak ayarlayın. "0.60" nin "1" ve "maske" bir 'yarıçapı' kullanın. Görüntüyü binarise için 'siyah zemin üzerine beyaz nesneler' ile yöntem "RenyiEntropy" seçin, "auto eşiği" tıklayın.
- Hücreleri ayırmak için "5" bir erozyon yarıçapı ile "Eklentiler" → "BioVoxxel" → "havza düzensiz özellikler" i tıklayın. → "Analiz" seçeneğini tıklayın "Parçacıklar Analiz" ve "0.02-Infinity" için "beden" olarak ayarlayın.
NOT: partiküller / hücre sayısısayıları olarak özet tabloda gösterilmiştir. - Daha fazla görüntü analizi için makro kaydetmek için "Create" düğmesine tıklayın.
- fıkrasında 5.4.3.1 açıklandığı gibi manuel olarak 3D çekirdeklerin sayısını ve Ki67 pozitif çekirdeklerin sayısını belirler.
- aşağıdaki formüle göre ortalama proliferasyon endeksi (PI) hesaplayın:
n = görüntü sayısı (3D: 10, 2D: 5)
HCC827 Hücreleri Anti-EGFR Tedavisinin Silico Tümör Modeli Üretimi ve Simülasyon 6.
- Ağ Nesil Şebeke Analizi Yazılımı kullanarak
- Önemli deneysel okuma-out parametreleri ve HCC827 hücre hattının mutasyon birikimine göre tümör ağı oluşturmak için bilinen farklı veritabanları kullanın.
- Görselleştirmek için ağ analizi yazılımı 21 açınağ.
- "Dosya" → "Yeni" → tipi 'JoVE_tumor modellerini tıklayın → Yeni bir ağ oluşturmak için "Tamam" a tıklayın. Bir çift zarında reseptörü görselleştirmek için "Tamam" "Kare Closeup North" → tıklayın. dikdörtgenler → tipi 'EGFR' → "Tamam" a tıklayın olarak düğümleri (= proteinler) görselleştirmek için "Genel Protein" üzerine tıklayın; ağdaki her düğüm için bu tekrarlayın.
- ağdaki düğümler Etiket: Sağ tıklayın → "Renk Değişimi ve Şekil ..." → düğümleri EGFR ve (EGF-EGFR) renk kodu "255,0,0" (kırmızı renk) için seçin; düğümleri, c-MET ve (c-MET) renk kodu "0,255,0" (yeşil renk) için; Gefitinib renk kodu için "255,255,0" (rengi sarı); PI3K-Inh renk kodu için "204204204" (renk açık gri); MEK-Inh renk kodu için "102102102" (renk koyu gri); ağ seçme renk kodu diğer tüm düğümler için4; 255255255 "(beyaz renk).
- altıgenler → tipi 'çoğalması' olarak okuma-out parametreleri görselleştirmek "fenotipe" tıklayın → "Tamam" a tıklayın → Sağ → "Değişim Renk & Şekli ..." Seçenek → renk kodu "255204204" (renk somon) tıklayın; select renk kodu "255,51,204" (renk mor) → Parametre apoptosis için bu tekrarlayın.
- engellemeler için (körelmiş oklar) "önlenmesinin" tıklayın, aktivasyon (oklar) için "Devlet Geçiş" tıklayın;: Kenarları (= etkileşimler) görselleştirmek ağdaki her etkileşim için bu tekrarlayın.
- "Dosya" → "Farklı Kaydet ..." → türü 'JoVE_tumor models.xml tıklayın → .xml biçiminde ortaya çıkan sinyal ağı kaydetmek için "Kaydet" düğmesine tıklayın.
- Silico Simülasyon SQUAD kullanarak
NOT: KADRO inci temsile ağı ayrı bir mantıksal Boole sistemi (AND, OR, NOT) olarak topoloji ve kararlı durum analizi yapar. Kararlı durum analiz sistemi denge ve sinyalizasyon uyaranlara üzerine sorumluluk (örn., Ilaç uygulaması veya mutasyon) yansıtır.- Açık KADRO 17 yazılım, yükleme → "Load Ağı" 'JoVE_tumor models.xml' dosyasını tıklayın. "Run analizi" ni tıklayın:
NOT: Sonraki, KADRO zamanla ağ davranış dinamik simülasyonu (renkli sigmoid aktivite eğrileri) izin verir Boolean ağ bağlantısı, katmak için üstel fonksiyonu uygular. - Bir simülasyon protokolü yazmak için "Gelişmiş" → "Perturbator" tıklayın. Anti EGFR direnci benzetin: Click "Düzenle Protokolü"
- "Pertürbasyon" → standart kullanımı "initialstate = SS-4" (kararlı hal 4) → "Yeni Sabit Pulse 'eklemek için" Add "düğmesine tıklayın → Se tıklayınlect parametresi "devlet" Select zaman → → Hedef seç "FLIP" "0" → Seç değer "0.4" → "Tamam" ı tıklayın.
- Bu tekrarlayın: → Seç parametre "devlet" → Hedef seç "c-MET" → Seç zaman "0" → Seç değer "0.4" → "Tamam" Click "Ekle" yi tıklayın; Click Seç zaman → → Seç parametresi "devlet" → Hedef seç "Gefitinib" "Ekle" "0" → Seç değer "1" → "Tamam" ı tıklayın.
- aktif düğüm (EGF-EGFR) bir devlet değerini ayarlayın: "activenode" tıklayın → "Düzenle" → Seç devlet "0,8" → "Tamam" Tıklayın; Diğer tüm düğümler için: "Düzenle" yi tıklayın → durumu "0" → "Tamam" ı tıklayın seçin. protokolü kaydetmek için "OK" tıklayın.
- Belirli eğrileri görüntülemek: paneline gidin "Seçenekler" → "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "kaspaz", "(c-MET)", "PI3K" "(EGF-EGFR)" seçin, "gefitinib", "apoptoz", "çoğalma", "MEK-Inh" ve grafiksel gösterimi için "PI3K-Inh". Sistemin tepki tam bir simülasyonu başlatmak için "Başlat" → "Çalıştır" a tıklayın. "Reset" seçeneğini tıklayın, yeni bir simülasyon başlatmak için.
- Kombine PI3K ve MEK inhibitörü tedavisi benzetin: Click "Düzenle Protokolü"
- 6.2.2.3 - 6.2.2.1 altında tarif edildiği gibi aynı düğüm parametresini kullanın. → "Add" tıklayın "yeni Sabit Pulse '→ Seç parametresi" devlet "→ Hedef seç" PI3K-Inh "→ Seç zaman" 0 "→ Seç değer" 1 "→" Tamam "ı tıklayın eklemek için" pertürbasyon "üzerine tıklayın; Click "Ekle"Seç zaman → 'yeni Sabit Pulse' → Seç parametresi "devlet" → Hedef seç "MEK-Inh" eklemek için "0" → Seç değer "1" → "Tamam" ı tıklayın.
- protokolü kaydetmek için "OK" tıklayın. "Seçenekler" paneline gidin: 6.2.2.4 altında tarif edildiği gibi grafiksel gösterimi için aynı düğümleri kullanın. Sistemin tepki tam bir simülasyonu başlatmak için "Başlat" → "Çalıştır" a tıklayın. simülasyon bitirmek için "Reset" düğmesine tıklayın.
- Açık KADRO 17 yazılım, yükleme → "Load Ağı" 'JoVE_tumor models.xml' dosyasını tıklayın. "Run analizi" ni tıklayın:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SISmuc iskele (C Şekil 2A) temelinde, bir 3D tümörü test sistemi (Şekil 2D) üretilmesi, stimülasyon ve tedavisi için bir standart operasyon protokolü kurulmuştur. Bu model, proliferasyon indisi ve sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi M30-ELISA kullanılarak apoptoz miktarının belirlenmesini mümkün kılar. 3 gösterir A549 ve HCC827 modelleri Örnek H & E boyama ve gefitinib sadece bir temsili apoptoz ölçümü Şekil. Burada sunulan model, başarılı bir klinikte hedeflenen inhibitörleri ile tedavi edilir EGFR -mutated KHDAK örneği kullanılarak tasarlanmıştır. Buna karşılık, sadece EGFR HCC827 hücreleri -mutated ve A549 hücreleri apoptoz artışı tarafından değerlendirilir olarak modelinde TKİ gefitinib ile EGFR inhibisyonu yanıt. Şekil 4 Şekil 5C ve D'de gösterildiği gibi. Ayrıca dinamik kültür koşulları gefitinib altında bir akış-biyoreaktör gelişmiş doku nesil dinamik kültür koşulları EGFR -mutated HCC827 (Şekil 5D) üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir.
Şekil 6 ağ topoloji (Şekil 6A) ve HCC827 hücreleri (Şekil 6B, C) anti-EGFR tedavisi direnci siliko simülasyonları detaylı gösterir. Sinyalleşme ağı CellDesigner yazılımı 26 ile görüntülendi 42 düğümleri ve 55 kenarlarının bir topoloji ile sonuçlanan, örneğin HPRD, KEGG ve QIAGEN (Genes & Pathways) olarak bilinen literatür veritabanları kullanılarak elde edilmiştir. Bilinen sürücü mutasyon EGFR (kırmızı) ve c-MET ko-aktivasyon simülasyon (yeşil, değer yaklaşık 0.7) artmış Prol gösteririferation oranı (somon eğrisi) ve MEK ve PI3K (Şekil 6B, koyu yeşil ve mavi) bir aktivasyonu ile birlikte gidiyor HCC827 hücrelerinde direnç (sarı) Gefitinib yansıtan zamanla azalmış apoptoz oranı (mor eğri). Kombine PI3K ve MEK inhibitörü (koyu ve açık gri eğrileri) anti-EGFR direnç etkisi reversion sonuçları, modellenmesi çoğalmasını azaltır ve apoptoz (Şekil 6C) neden olur.
Şekil 1. Çoğalma Hızı. 2B Hücre Kültürü ile karşılaştırıldığında 3D Azaltılmış Ki67 pozitif HCC827 hücreleri (kırmızı A ve B) SISmuc (B) 2D hücre kültürü (A) ve 3D hücre kültüründe boyandı edilir. HCC827 hücreleri ve A549 hücreleri, C (sayılmış ve proliferasyon indeksi (Ki67 pozitif hücrelerin yüzdesi) tespit edilmiştir </ Strong> bir temsilcisi) beş üzerinden sayma. Ölçek A bar ve B:. 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
TKİ Gefitinib ile Şekil 2. SISmuc İskele Morfoloji ve Tedavi Programı Hücreler ince bağırsak submukozaya (DİE) + mukozada (A oluşur SISmuc üzerine numaralı seribaşı. Aydınlık, B: DAPI boyanan hücrelerin SISmuc, C üstünde: bindirme A ve B) ve 0. günde hücre kron giderilmiştir tedavisi Şema D'de gösterilmektedir: Orta değişiklikler (MC), her 2 ila 3 günde yapılır. 11. günde tedavi başlar. Süpernatanlar toplanmış ve M30-eli için kullanılanZamanla apoptoz ölçmek için SA (Mavi oklar ve kutular). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil A549 3D Tümör Modelleri 3. Gefitinib Tedavisi Değişiklikleri Hücre HCC827 içinde SISmuc ve İndükler Apoptoz Büyüme, ama değil. Herhangi bir tedavi olmaksızın, her iki hücre hatları SISmuc (A ve B) bir tek tabaka oluşturur ve aynı zamanda eski kript yapılarının yerleşmek. A549 hücrelerinin büyüme paterni gefitinib (C) ile tedavi sonrasında değişmez birlikte, HCC827 hücrelerin sayısı, uzunlamasına hücre şekli (D) bir değişiklik eşlik azaltılır. Kültür süpernatanlanndan M30-ELISA ölçümleri ile görülen Apoptoz E (HCC827 model gefitinib indüklenir D Ölçek çubuğu:. D A 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SISmuc üzerinde HCC827 Hücrelerde Şekil 4. TGF-beta-1 İndükler EMT. 3D kültüre HCC827 hücreleri pan-sitokeratin (PCK) genel ifade göstermek (A yeşil, a1) ama sadece tek hücreler, A (kırmızı vimentin ifade a2). TGF-beta-1 ile uyarıldıktan sonra, hücrelerin uzatılmış bir şekle morfoloji değiştirme ve vimentin sentezlenmesi güçlü arttırılır (b kırmızı, B2), PCK ifadesi korunur ise (B yeşil, B1). B Ölçek çubuğu: A 100 mikron B. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Dinamik Hücre Kültürü artırır doku üretimi. Bir biyoreaktör içinde 3D koşulları (B), statik modeli (A, H & E boyama) çok tabakalı bir doku, bir tek tabaka (A) değişiklikleri (C, H & E boyama ile ilgili tek tabaka altında kültüre edildiği zaman ). HCC827 hücreleri gefitinib tedavisi (d, H & E boyama) üzerine güçlü bir ilaç yanıtını gösterir. D Ölçek çubuğu:. A, C, ve D 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
İncir. Silico Tümör Modeli Üretimi ve Anti-EGFR Tedavi Direnci. Ağ kırmızı (EGFR yolunun) anahtar sinyal düğümlerle bir tümör hücresinin topoloji ve yeşil (c-MET) ve mansap düğüm Simülasyon 6.. karakteristik tümör okuma-out parametreleri (somon) çoğalması ve (mor) apoptoz altıgen olarak temsil edilir. Oklar aktivasyonu, körleşmiş oklar inhibisyonu belirtir. Tedavi hedefleri, koyu ve açık gri renkli dikdörtgenler tarafından temsil edilir, Gefitinib ile inhibisyonu sarı (A) 'da gösterilmektedir. Çoğalması (somon eğrisi) ve reklamın bir artış gösterdiği gibi, e-fonksiyonları (renkli eğriler) (NOT AND, OR) Boole ağ bağlantısı katmak tarafından Dinamik simülasyon. EGFR ve c-MET ortak ifade gefitinib direnci nedenyaklaşık keyfi bir zaman noktasında 8 (B) sonra apoptosis (mor eğrisi) ecrease. (Sarı eğrinin altındaki, aynı aktivasyon, protokol bakınız) Potansiyel tedavi ele almaktadır inhibitörleri tarafından PI3K ve MEK hem. (C) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir in vitro kombine kurduk / Biyomarker güdümlü tedavi tahminleri için siliko tümör testi sisteminde. In vitro model gibi aynı zamanda siliko 17 simüle edilebilir belirli bir mutasyon arka planda tümör hücre çoğalması ve apoptoz değişiklikler gibi bileşik eylemlerin farklı önemli yönlerini değerlendirir. Burada, 3D tümör modeli üretimi ve çoğalması ve apoptoz ölçümü ve siliko modelinde bir habercisiydi kurulması da dahil olmak üzere bileşik test için standart bir protokol mevcut. 3D tümör modeli mutasyonları taşıyan tümör hücre çizgileri dayanır. Hücreler, hücre kron bir decellularized doku matrisi üzerinde yetiştirilmektedir. Iskele matris biyoreaktör sisteminin monte decellularization, iki metal halkalar (hücre kron) arasındaki sabitleme yanı sıra tohum, 25 önce Jüpiter olarak görüntülenmiştir.
in Vitro 3D Tümör Modeli
kliniğe burada elde edilen sonuçların çeviri seçilen hedeflenen ilaçlar için biyomarkerların göre hastaları sınıflandırmak için ilgi mutasyonlar taşıyan uygun tümör hücrelerinin bir dikkatli seçimi gerektirir. Tabakalı tıp, yeni nesil dizileme ile druggable sürücü mutasyonlar kimlik özellikle KHDAK önemli bir husustur ve umarım gelecek 29 yeni genetik işaretleri ortaya çıkaracaktır. In vitro olarak test edilmesi için, ilgi konusu bileşiği, seçilen bir hücre hattı veya primer hücrelerde yüksek ölçüde aktif bir sitesini hedeflemelidir. Burada, hücre çizgileri HCC827 ve A549 EGFR mutasyon statüsünde farkı nedeniyle seçilmiştir ve aşırı duyarlılık (HCC827 hücreler) ve 2B kültür 30-32 bölgesindeki TKİ gefitinib yönelik ara duyarlılık (A549 hücreleri) rapor edilmiştir. Seçilen tümör 3D tümör modeli üretimi, hücre sayısı ve Kültür döneminin ilk adımda hücreler Adju gerekirBurada sözü edilen farklı hücreleri kullanılır Bu durumda STED'in. uygun bileşik konsantrasyonu bulmak için, 2D bir ticari olarak temin edilebilir canlılığı deneyi yardımıyla IC50 değerini belirlemek için tavsiye edilir. Bu testte göre, bileşik IC50 konsantrasyon ve 3 boyutlu bir model bir sonraki daha yüksek konsantrasyonda kullanılır. Biz iki üç hafta içinde ve diğer taraftan 2B tümör test sistemleri kolay karşılaştırma için sonuçlar elde etmek amacıyla bir yandan tedavi üç gün seçtiniz. Ancak, tedavi süreleri uzun vadeli etkileri araştırmak için uzatılabilir. Bununla birlikte, uzun süreli tedavisi, test edilen bileşiğin, yüksek dozlarda, böylece çoğalma ve diğer immünohistokimyasal belirleyicisinin önlenmesi tam hücre kaybına neden olabilir dikkate alınmalıdır.
güvenilir bir sinyalleşme ağı analizi için, belirli bir bileşik ile işlenmesi üzerine Tümör yanıtları çoğalması ve apo arasında ayrım analiz edilmesi gerekirpitozis. Bu okumaları farklı sinyal ağında bağlanır. Bu nedenle, her iki parametre ayrı bir analiz ilaç etkisi ile daha sonraki hedef tahmini daha iyi anlaşılmasını sağlar. Daha önce belirtildiği gibi, tümör hücrelerinin çoğalması, 2B kültür koşullarına göre 3B modelinde azaltılır ve bu şekilde, test edilen bileşiklerin sitostatik yanlış pozitif sonuçlara azaltmalıdır. proliferasyon endeksinin belirlenmesi için, çekirdek sayısı ve Ki67 boyama için pozitif çekirdeklerin sayısı, örneğin bir yazılım Fiji kullanılarak ölçülebilir gerekir. Bu, bu çekirdeklerin daha düşük ya da daha yüksek sayılar sonuçlanır Hücreler sıkı agregatlar oluştururlar halinde, sırasıyla, ancak, mümkün olmayan tümör hücrelerinin 2B kültürlerinde makro kullanımı ile, basitleştirilebilir. Her durumda, makro ayarlar her bir hücre hattı ve boyama için dikkatli bir şekilde ayarlanması gerekir. Apoptoz, WH kaspaz-yarılan sitokeratinin 18 ölçüm süpernatanlardan non-invaziv ölçülebilirIch M30-ELISA kullanılarak, epitel özelliklere sahip hücreler ile sınırlıdır. Bunun çeşitli avantajları vardır: I) Bu zamanla tedavi etkinliğini izlemek ve etkili bir tedavi başlangıç noktasını belirlemek için izin verir. II) Numuneler yok değildir ve diğer Okuması teknikleri için kullanılabilir. III) Epitelyal hücre apoptoz ko-kültür ortamlarında optimal mezenkimal apoptoz, ayırt edilebilir. Bu teknik, bununla birlikte, bu şekilde bunların epiteliyal fenotipi kaybederek EMT yapılan tümör hücreleri için uygun olabilir. Bu teknik, uygulanmadan önce Böylece, kullanılan her tümör hücre çizgisinin sitokeratin 18 sentezlenmesi immunohistokimyasal boyamalar doğrulanmalıdır. Bileşiklerin Test aynı zamanda daha tümör kök hücre benzeri fenotipinde gerçekleştirilebilir. Genellikle uyuşturucu testi farklı invaziv aşamaları gibi TKİ'ler olarak hedeflenen ilaçların çoğu, daha ileri tümör aşamalarında uygulanır olsa bile ihmal edilmektedir. Bizim modelimiz yok invaziv veya soruşturma sağlarHücreler işgali sırasında geçmek zorunda nedeniyle korunmuş bazal membranın 17 n-invaziv tümör hücreleri. Hücre motilitesi ve invaziv önemli bir adım, TGF-beta-1 17,33 ile stimülasyon farklı akciğer kanser modellerinde indüklenebilir EMT olup. Ancak bu, bir platform üzerinde bu şekilde çoğalması ve hücre sayısını azaltır. Bu olumsuz yan etki güçlü 3D modellerinde tümör hücre yoğunluğunu arttırır dinamik kültür koşulları uygulanarak atlatılabilir. Biyoreaktör fizyolojik koşullara kültür ayarlar da, hücre özellikleri ve sinyal stres 25 makaslama tarafından beslendiği edilebilir göz önünde bulundurulmalıdır.
Silico Simülasyonları yılında Kullanımı Hız-up Hücre-line özel Uyuşturucu Testi
Sadece yarı-kantitatif rağmen, olayların sırası düzgün bakım ile siliko modelinde kızımız tarafından modellenmiştirTam her özel hücre hattı için bilinen mutasyonlar dikkate. Bu hücre hattı, farklı reseptör aktivasyon seviyesi belirli değişiklikleri içerir, ne ölçüde kinazlar devreye dahil, ne zaman ve ne kadar süre ağ çıkış apoptoz veya çoğalması beklenen bu şekilde. Örneğin, bir kazanılmış anti-EGFR terapi direncinin 30 yaklaşık% 20 meydana düşünülmektedir ve klinik olarak, c-met amplifikasyonlar düşünülebilir. Daha sonra, In silico modeli, zamanla ilgili ağ davranışını hesaplar örneğin., Gefitinib direnç gelişimi artan çoğalması ile temsil ve apoptozu azalmıştır. Bizim modelde, en umut verici hedef adayları olarak MEK ve PI3K belirledi. Sonuç olarak, yeni potansiyel tedavi kombinasyonu, hızlı bir şekilde in vitro test etmek için bir temel olarak hizmet eden, siliko önceden değerlendirilebilir. Buna ek olarak, in vivo deneylerden edinilen çıkış verileri olabilirEn iyi deneysel sonuçlar uygun ağ ayarlamaları siliko sisteminde rafine etmek için kullanılabilir. Siliko stratejilerinde yarı-kantitatif (100 protein-protein etkileşimleri kabul edilebilir civarında) ağ boyutu ile ilgili bazı sınırlamalar vardır. Ayrıca, gerçekçi sonuçlar elde etmek için ağ topolojisinde içine tüm anahtar protein düğümleri entegre etmek çok önemlidir. In silico modeli böylece canlı tümör hücresinde mevcut şebekenin sadece bir yaklaşım verir. Ancak, bu odaklı görünüm ilgi belirli değişiklikler, örneğin., Hücre-line farklı mutasyon arka planlarda ilaç kombinasyonlarının etkisini simüle etmek için bize izin verir. Bu bize sistematik olarak yeni tedavi stratejileri kaynaklanan yanı sıra kanser sinyal ağlarının karmaşıklığı anlamak için yardımcı olur.
Biz kolayca precli entegre edilebilir in vitro aracında tasarlanmış bir yardımcı doku geliştirdik Sonuç olarak, eminizTek ilaç bileşikleri ve bunların kombinasyonları etkinliği üzerine nical testi. Test maliyetleri ve süreyi azaltmak için, bu tümör modeli ayrıca siliko öngörü aracı bir klinik odaklı hedefe yönelik tedaviler veya dikkate yeni oyuncuların da dahil olmak üzere ilaç ve ilaç kombinasyonu etkileri hücre türüne özgü öngörüsüne toplanan verileri genişletmek için izin vererek tamamlanmaktadır (örn., miRNA'ların).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Wuerzburg Üniversitesi Hastanesi Disiplinlerarası Klinik Araştırma (IZKF, hibe BD247) Merkezi ve (Heike Walles verilen) Bayern Fit programı sponsor oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | This software was used for drawing the network. |
| Citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. | |
| Citrate buffer working solution | in house production | 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal Calf Serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4% (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37 °C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | - | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5 ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
- BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
