Introduction
Ожирение, в настоящее время около 30% населения в США, с индексом массы тела более 30, стала преобладающей во всем мире явления 1. Ожирение ведет к тому связанных с ним осложнений , включая сердечно - сосудистые заболевания, сахарный диабет 2- го типа и рак 2-4. Поэтому, имея дело с ожирением является важным приоритетом. Ожирение проявляется массового расширения жировой ткани, а также объясняется чрезмерным потреблением пищи и сидячего образа жизни в современном обществе. Следовательно, расшифровка регуляции транскрипции адипогенеза и липогенеза может перспективны для лечения ожирения или диабета 5.
3T3-L1, 3T3-F442A и другие мышиные липогенный клеточные линии были применены для изучения липогенез или липогенез в процессе развития жировой ткани. Тем не менее, существуют некоторые расхождения в регуляторных механизмов между клеточными линиями в пробирке и животных в естественных условиях 6. Первичная жировой ткани Деривед стволовые клетки (ADSC) в клеточной фракции стромальных-сосудистой системы могут быть выделены непосредственно из белых тканей при старении и индуцировать дифференцировку. Дифференциация ADSC в адипоциты , скорее всего повторяет процесс адипогенеза и липогенеза в развитии жировой ткани в естественных условиях 7.
Свиньи являются подходящая животная модель для изучения липогенез и липогенеза в развитии жировой ткани. Наши предыдущие исследования свиные 8-10 показывают , что экспрессия стерол регуляторный элемент-связывающий фактор транскрипции 1c (SREBP1c), что является важным фактором транскрипции , известного модулировать транскрипцию липогенных синтазы жирных кислот, подавляется полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в свиной печени и жировой ткани. Выражение свиных SREBP1c снизилось на ПНЖК в естественных условиях и в пробирке похож на другие виды , такие как у людей и мышей 11-13. Эти свиньи исследования в пробирке, в первую очередь в Differentiated адипоциты, полученные из свиных ADSC (pADSC). Таким образом, эта первичная культура клеток из pADSC может быть использован, чтобы служить в качестве надежной системы сотовой связи с целью изучения развития жировой ткани или других приложений стволовых клеток.
Protocol
Примечание: Этот метод был создан и используется в исследованиях сообщалось ранее 14-17 из этой лаборатории; с течением времени методология была изменена. Текущая процедура была выполнена с использованием в среднем 60 г свиных подкожной жировой ткани из одного поросенка (от 7 до 9 дней) с посевом на 6-луночных культуральных планшетах. Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное. Все эксперименты на животных были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) Национального университета Тайваня путем.
1. Подготовить Пищеварение Medium
- Получение подкожной жировой ткани от шеи и спины; От 40 до 80 г на поросенка (от 7 до 9 дней), в зависимости от размера свиней. Здесь используют 60 г подкожной жировой ткани, полученных от одной свиньи.
- Готовят пищеварение среды: вес порошка коллагеназы II в общей сложности 54000 единиц и растворить его в 90 мл модификации Дульбекко среде Игла (DMEM,60 г жира) в 100 мл серологической флакон (900 единиц коллагеназы / 1,5 мл DMEM / г жира).
- Аккуратно перемешивайте переваривания среды на качалке таблице (100 оборотов в минуту) в течение не менее 15 мин для растворения, а затем передать переваривания среды через фильтр 0,22 мкм для стерилизации. Хранить при температуре 4 ° С перед использованием.
2. Рассеките подкожная жировая ткань из Свиней
- Стерилизовать все инструменты, стекло и изделия из пластмасс и тепло все средства массовой информации до 37 ° C перед использованием.
- Жертвоприношение поросенка с электрическим потрясающем и обескровливания или с помощью метода, в соответствии с местными нормативами IACUC. Выполните рассечение тщательно и сразу же после того, как поросята в жертву.
- Положите поросенка на чистую операционном столе (обратно вверх и вниз живот). Сбрить волосы от поросенка обратно, удалив все волосы от шеи до хвоста и с обеих сторон вниз к средней линии.
- Скраб свиньи спинной кожи с 7,5% povidone-йода в три раза (с тремя новыми независимыми-скрабы), а затем позволить йод сидеть на поверхности кожи в течение приблизительно 10 мин.
- Удалите повидон-йода с несколькими брызгами 70% этанола. Используйте марлевые тампоны или тканевые бумаги, содержащие 70% этанола, чтобы протирать кожу в одном направлении, повторяя, пока не наблюдается никакого очевидного цвет повидон-йода.
- Используйте скальпель, чтобы отделить свиной спинной жировой слой подкожной жировой ткани вместе с прикрепленным слоем кожи от мышц, удерживая вверх жир и кожу с помощью щипцов.
- Немедленно погрузить толстый слой подкожного жировой ткани с прилегающей кожей в стерилизованную стакане (200 мл), содержащей бессывороточной DMEM.
- Брызги снаружи стакана, содержащего жировой слой с 70% этанола и место в ламинарного потока капот культуре клеток. Поместите большой (40 см х 30 см) стерилизуют трехслойную фольгу в капот. [Тройной слой используется для обеспечения непрерывной целостности.]
- Поместитеткани с кожей вниз на оберточную фольгу.
- Обрежьте оставшуюся мышечную ткань от жировой ткани с помощью пинцета и ножниц, чтобы избежать загрязнения с мышечной ткани.
- Обрежьте жир на квадратные куски (~ 7 см х 7 см) с помощью скальпеля или ножниц. Поместите эти кусочки жирового слоя в новый стерилизованного стакане (200 мл), содержащей бессывороточной DMEM.
- Установить настроенную держатель среза на оберточную фольгу в сборе с углеродистой стали слайсера лезвия (рисунок 1). Возьмите одну часть жира из стакана и поместите его на резателя (скин-слой на верхней и жировой слой ниже).
- Нарезать жировой слой подкожной жировой ткани в приблизительно 1 мм толщиной штук. Нарезать жировой слой с кожи как можно ближе, но избежать нарезка кожи.
- Фарш нарезанный жировой ткани с ножницами в виде мелких, насколько это возможно.
- Добавьте отфильтрованный пищеварение среды, содержащей коллагеназы в 250 мл колбу Эрленмейера или серологического бутылки с фаршажировой ткани (54000 единиц коллагеназы / 90 мл DMEM / 60 г жира).
- Инкубируют и взболтать коническую колбу при 45 оборотах в минуту в орбитальном шейкере в течение 90 мин при 37 ° С, чтобы позволить коллагеназы переваривать ткани.
Примечание: Проверьте каждые 15 до 30 минут, чтобы избежать чрезмерного пищеварения. Процесс переваривания завершается, если переваривание среда представляет собой суспензию без существенных сгустки ткани. - Добавить равный объем (равный пищеварительную среде) культуральной среде, содержащей DMEM / F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы остановить коллагеназы.
Рисунок 1. Настроенная слайсер используется для изоляции pADSC. Рассеченные ткани жировой ткани из свиных спинных подкожной жировой ткани состоят из жировой слой с вложенными слоями кожи. Слайсера требуется разрезать толстый слой толщиной приблизительно 1 мм с избегания перепредставленныхнарезка в слои кожи. Слева направо: держатель среза, слайсера прокладки, углеродистой стали слайсера лезвия и винтов. Slicer лезвие вставляется между держателем среза и слайсера площадку в собранном. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
3. Сбор pADSC из стромальных-сосудистой фракции
- Пропускают переваривание среду, содержащую переваренных жировой ткани через один слой шифона в чистую стерилизованную 250 мл колбу Эрленмейера, или 250 мл серологической бутылки. Используйте пинцет, чтобы нажать на середину шифона, направляющей и содействия прохождению дайджеста.
- Слить и скрутить шифон с пинцетом, чтобы завершить прохождение.
- Распределить переваривание среды в четыре 50 мл конические пробирки для центрифугирования (~ 40 мл среды на пробирку).
- Центрифуга при 700 х г в течение 10 мин, чтобы собрать осадок стромальных-сосудистых клеток.
- Центрифуга при 700 мкг в течение 6 мин. Декантируют супернатант.
- Добавляют 10 мл ACK лизирующего буфера, а затем ресуспендируют осадок пипетированием. Пусть стоять в течение 7 мин (от 5 до 10 мин) при комнатной температуре, чтобы лизировать красные кровяные клетки в стромальных-сосудистой фракции.
- Добавить равное количество DMEM (10 мл), чтобы остановить реакцию при осторожном встряхивании трубки, а затем центрифугировать при 700 х г в течение 10 мин.
- Слейте супернатант, добавьте 10 мл DMEM в каждую пробирку, ресуспендируют осадок с повторным пипетированием и центрифуге при 700 мкг в течение 6 мин. Повторите дважды.
- Собрать и передать DMEM (в общей сложности 40 мл DMEM из 4 трубок, представляющих 60 г жира) с подвесными клетками через сито 100 мкм в новый 50 мл коническую трубку.
- Аккуратно пипетку Mediгм несколько раз, чтобы хорошо перемешать и аликвоты по 20 мкл клеточной среде, содержащей в смеси с 180 мкл 0,4% -ным раствором трипанового синего (разведение 1:10) в новой 1,5 мл пробирку Эппендорфа.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра , а затем семян pADSC при плотности 60000 клеток / см 2 на желаемом размера чашки для культивирования или пластины с питательной средой , содержащей DMEM / F12, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков пенициллина -streptomycin-амфотерицин раствор В (P / S / A). Как правило, засеять pADSC на 6-луночные планшеты для тканевых культур для адипоцитов или остеоцитарного дифференциации. Семя pADSC на 10-см чашки для поверхностного окрашивания маркера стволовых клеток или хондроцитов дифференцировки.
- Инкубируйте пластины или блюда в 37 ° C инкубаторе в воздухе с 5% CO 2 , чтобы позволить прикрепление клеток к пластинам.
4. Идентификация стволовых клеток поверхностных маркеров pADSC методом проточной цитометрии
- Через 24 часа, полностью удалить среду, моют гое 10-см чашку дважды фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) и урожай клеток с 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С.
- Нейтрализовать трипсин-ЭДТА с равным количеством культуральной среды (1 мл), собирают клетки в новом 15-мл коническую трубку, а затем центрифуге при 400 × г в течение 7 мин.
- Декантируют супернатант. Промывают осадок дважды в 3 мл охлажденной льдом FCS-буфером для промывки (PBS, содержащей 10% FBS), используя ресуспензию пипеткой в сочетании с центрифугированием при 400 х г в течение 7 мин.
- Ресуспендируют, граф, и корректировать pADSC до 10 6 клеток / мл в охлажденном льдом FCS-буфера для промывки. Место клетки (100 мкл / каждая трубка) на несколько новых 15-мл конические пробирки и инкубировать пробирки, содержащие pADSC при температуре 4 ° С в течение 30 мин с антителами против либо фикоэритрин-конъюгированного CD4a (CD4a-РЕ), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE или MHC II-PE для прямого окрашивания. Остановить реакцию путем промывки клетки дважды в 10 мл FCS-промывочного буфера в сочетании с 400 × г centrifugatионов в течение 7 минут.
- Фикс и ресуспендирования клеток в фиксации буфера (PBS с 0,01% FBS и 1% формальдегида) для проточной цитометрии в соответствии с инструкциями изготовителя и нашей предыдущей публикации 18.
5. Разграничение pADSC в адипоциты, остеоциты и хондроциты
- Дифференциация pADSC в адипоциты
- Приготовьте адипоцитов индукционную среду и адипоцитов поддерживающую среду
- Для адипоцитов индукционной среде, готовят 1 л сыворотки DMEM / F12 (с антибиотиками 1% P / S / A), содержащий следующие действия: 1 мл инсулина запас (10 мг / мл HEPES-буфера, рН 8), конечная концентрация = 10 мкг / мл; 1 мкл Т3 запас (3,3 ', 5-Трийод-L-тиронина, 1 мМ в ДМСО), конечная конц = 1 нМ; 200 мкл трансферрина запас (50 мг / мл бидистиллированной H 2 O), конечная конц = 10 мкг / мл; 100 мкл дексаметазон запас (10 мМ в этаноле), конечная конц = 1 мкМ; 100 мкл розиглитазон запас (10 мМ в ДМСО), конечная конц= 1 мкМ.
- Подготовка среды обслуживания адипоцитов с теми же добавками, как индукционной среде, но с пропуском дексаметазона.
- Процесс дифференциации адипоцитов для
Примечание: После засева pADSC на 6-луночные планшеты, pADSC будут сливающийся в течение 72 часов.- После 3-х дней, удалите среду полностью и затем добавляют 3 мл адипоцитов индукционной среды в каждую лунку. Возвращение пластины в инкубатор. Это нулевой день дифференцировки.
- После 3-х дней, удалите адипоцитов индукционную среду полностью и заменить с 3 мл поддерживающей среды адипоцитов каждые три дня. Зрелые адипоциты будет окончательно дифференцированные около 9 дней. Более 90% адипоцитов хорошо дифференцированы с использованием этого протокола. Эти адипоциты готовы к окрашиванию Oil Red O.
- Приготовьте адипоцитов индукционную среду и адипоцитов поддерживающую среду
- Дифференциация pADSC в остеоциты
- Подготовка остеоцит индукции среды: полная культура mediuм (DMEM / F12 с добавлением 10% FBS и 1% P / S / A), содержащий 1 мкМ дексаметазон, 10 мМ b-глицерофосфата и 50 мкг / мл аскорбата-2-фосфат.
- Процесс Дифференциация для остеоцитах
Примечание: После засева pADSC на 6-луночные планшеты, pADSC будут сливающийся в течение 72 часов.- После 3-х дней, удалите среду полностью и добавляют 3 мл остеоцит индукционной среды в каждую лунку. Возвращение пластины к 37 ° С инкубатор. Это нулевой день дифференцировки.
- Заменить остеоцит индукционной среде один раз в три дня. Зрелые остеоцитами сформирует 14 суток дифференцировки. Эти остеоцитами готовы к ализарин красный S окрашивания.
- Дифференциация pADSC в хондроциты
- Готовят хондроцитов индукционной среде: αMEM, содержащий 1% FBS, 6,25 мкг / мл инсулина, 50 мкг / мл аскорбата-2-фосфат, и 10 нг / мл трансформирующего фактора роста & beta; 1.
- Процесс Дифференциация для хондроцитов
- Trypsinize pADSC с 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин и затем нейтрализуют 1 мл культуральной среды. Сбор, рассчитывать и корректировать pADSC в 15 мл конические пробирки с плотностью 2,5 × 10 5 клеток на пробирку. Используйте гемоцитометра для подсчета клеток.
- После центрифугирования при 400 × г в течение 7 мин, отбросить супернатант, не нарушая гранул и прибавляют 1 мл хондроцитов в индукционной среде 15 мл трубки. Трубка возвращается в 37 ° С инкубатор. Это нулевой день дифференцировки.
- Заменить хондроцитов индукционной среде каждые три дня без удаления клеток на дне. Зрелые хондроциты формируют в приблизительно 14 дней. Эти хондроциты готовы к окрашиванию толуидиновым синим O.
6. Окрашивание Дифференцированные адипоциты, OsteocyTES и Chondrocytes
- Окрашивание масло Красный O для дифференцированных адипоцитов
- На 9-й день, удалить среду обслуживания адипоцитов в 6-луночные культуральные планшеты с дифференцированными адипоцитов, а затем промыть пластину дважды PBS. [В следующих шагах, добавьте достаточное количество обозначенными реагентами, чтобы покрыть каждую лунку 6-луночного планшета.]
- Закрепить адипоцитов с помощью 10% -ного раствора формалина в течение не менее 10 мин.
- Удалите 10% -ный раствор формалина и помыть плиту дважды с дважды дистиллированной водой.
- После двух промывок добавляют 100% пропиленгликоля к культуральной пластины и дайте постоять в течение 1 мин.
- Удалите 100% пропиленгликоля, а затем добавляют раствор масла Красный O (0,5% в пропиленгликоле) к культуральной пластины. Дайте постоять в течение по крайней мере 10 мин на рокера шейкере при осторожном перемешивании (100 оборотов в минуту).
- Удалить масляный раствор Красный O, а затем заменить 60% пропиленгликоля. Дайте постоять в течение 1 мин.
- Удалите 60% пропиленгликоля, а затем промойте пластину дважды double дистиллированной воды.
- Заменить 10% -ным раствором формалина. Окрашенные липидные капли внутри адипоцитов готовы к наблюдению с помощью световой микроскопии.
- Количественное внутриклеточная Oil Red O (дополнительные шаги ниже): после того, как под микроскопом, удалить 10% раствором формалина и промойте пластину дважды с дважды дистиллированной водой.
- Слить пластину полностью и добавить 500 мкл изопропанола в 6-луночный планшет.
- Пусть изопропиловый спирт стоять в 6-луночного планшета на пологом качающегося шейкере (100 оборотов в минуту) в течение не менее 10 мин для растворения красителя Oil Red O.
- Аспирируйте изопропилового спирта, содержащего масла Red O и распределяют по 96-луночного планшета. Количественно добытой нефти Red O с использованием спектрофотометрического считывания при 510 нм.
- Ализарин красный S окрашивание для дифференцированного остеоцитах
- На 14-й день, удалить остеоцит индукционной среде из 6-луночные планшеты с дифференцированными остеоцитов и мыть тарелки в два раза с PBS. [В followiнг шаги, добавьте достаточное количество назначенных реагентов, чтобы покрыть каждую лунку 6-луночного планшета.]
- Фикс остеоцитов в 10% растворе формалина в течение не менее 10 мин.
- Удалите 10% -ный раствор формалина из каждой лунки и промойте пластину дважды с дважды дистиллированной водой.
- После двух промывок добавляют 2% раствор Ализарин Красный S (рН = 4,1-4,3) к 6-луночного планшета и дайте постоять в течение по крайней мере 15 мин на пологом качающегося шейкере (100 оборотов в минуту).
- Удалить решение ализарин красный S, а затем промойте пластину дважды дважды дистиллированной водой.
- Заменить 10% -ным раствором формалина. Остеоциты готовы к наблюдению с помощью световой микроскопии.
- Толуидиновым синим O окрашивание дифференцированных хондроцитов
- На 14-й день, аспирация хондроцитов индукционной среде из 15 мл коническую трубку, не удаляя отложения дифференцированные хондроцитов в нижней части трубы и промыть трубку дважды PBS. [В следующих шагах, добавьте достаточное количество назначенных реагентов для бухтойR хондроцитов в нижней части трубы или на участке ползуна.]
- Фикс хондроциты в 10% растворе формалина в течение не менее 10 мин.
- Удалите 10% -ный раствор формалина из каждой пробирки и промойте трубку дважды с дважды дистиллированной водой.
- После двух промываний, встраивать гранулы в ОСТ соединение и секции с криостат при толщине 5 мкм.
- Пятно скольжении секций криостата с раствором толуидиновым синим O (0,1% с рН 4,1).
- Удалить решение толуидиновым синим O, а затем промыть участок дважды с дважды дистиллированной водой.
Примечание: хондроцитов на слайдах готовы к наблюдению с помощью световой микроскопии.
Representative Results
PADSC , полученный из свиной дорсальной подкожной жировой клетчатки были высеяны на культуральные чашки или блюд и показано на рисунке 2. Морфология pADSC , полученной из стромальных-сосудистой фракции похожа на мыши или человека ADSC. Через двадцать четыре часа после посева, субконфлюентные pADSC приклеены и имеют расширенную фибробластический морфологией (рис 2А). PADSC будет сливающиеся в течение 72 ч и готовы к адипоцитов или других мезенхимальных типа дифференциации (рис 2В). pADSC демонстрируют сильную Adipogenic потенциал после химической индукции и зрелые адипоциты можно наблюдать через 9 суток дифференцировки с более чем 90% от pADSCs , показывающих Adipogenic дифференциации (рис 2С).
Для решения характеристик pADSC, полученных в этом протоколе, поверхностные маркеры pADSC оценивали с помощью проточной цитометрии анальноголиз. Как показано на рисунке 3, поверхностные маркеры мезенхимальных стволовых клеток, в том числе CD29, CD44, CD90 и MHC I (или HLA - I), были высоко выражены. Отрицательные поверхностные маркеры, такие как CD4a, CD31, CD45 и MHC II (или HLA II) были едва обнаружим в pADSC , полученных в протоколе (рисунок 3). Эти результаты показывают, что эти pADSC демонстрируют мезенхимальных типа характеристики стволовых клеток без значительного эндотелиальной или загрязнения гемопоэтических стволовых клеток, в том числе миелоидных или лимфоидных клеток-предшественников.
Для дальнейшего подтверждения, что pADSC представляют мезенхимальные стволовые клетки, то мультипотентность из pADSC был осмотрен дифференцировке в адипоциты, остеоциты и хондроциты. Эти адипоциты, остеоциты и хондроциты окрашивают специальными красителями, масло Красный O, ализарин красный S, и толуидиновым синим O, соответственно (Рисунок 4). Эти данные указывают на то, что этот протокол генерируется pADSC, что удерживаемой муltipotency с полными характеристиками, напоминающими клетки-предшественники мезенхимальных типа.
Рисунок 2. Морфология pADSC из свиных шпика области. (А) субконфлюентные pADSC придерживалась и расширен после 24-часового посева на планшет для культивирования 6-луночного. (Б) pADSC стали конфлюэнтны после 72-часового посева на планшет для культивирования 6-луночного. Наблюдались (C) Зрелые адипоциты через 9 дней адипогенной дифференциации от pADSC. Изображения были сделаны при 100 - кратном увеличении , используя фазово - контрастной микроскопии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Идентификация стволовых клетокповерхностные маркеры для pADSC. 1 х 10 5 из pADSC подвергали взаимодействию со специфическими антителами и анализировали на содержание маркеров стволовых клеток с помощью проточной цитометрии. Цифры указывают процент окрашенных клеток в популяции (красный) по сравнению с неокрашенным контролем. Ось Х представляет собой относительную интенсивность флуоресценции. Ось ординат представляет собой популяцию клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. мультипотентны дифференциация pADSC. Мультипотентность из pADSC определяли путем дифференцирования pADSC в (А) адипоцитов, (В) остеоцитов (С) хондроцитов и окрашивают представительными красители, масло Красный O, ализарин красный S, и толуидиновым синим O, соответственно , ИмаGES были взяты в (А) 100 х, (В) 200 х, и (C) 100 - кратное увеличение с помощью фазово - контрастной микроскопии, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Здесь мы представляем надежную сотовую систему для изучения развития жировой ткани в первичной культуре клеток pADSC. По сравнению с другими линии иммортализованных клеток, этот метод обеспечивает удобный способ для выделения большого количества высококачественных взрослых мезенхимальных стволовых клеток , которые могут быть применены для изучения процессов дифференцировки адипоцитов или других мезенхимальных родословных , связанные с развитием животных в естественных условиях. Критическое модифицированный шаг в этом протоколе является то , что мы получаем pADSC с использованием 7- до 9-дневного поросенка , потому что легко обрабатывать небольшое поросенка по сравнению с более старыми свинок и похожи на другие виды 19,20, выход и мультипотентность из pADSC уменьшается по мере свиней в возрасте от 21 года .
Потенциальные источники стволовых клеток включают эмбриональные стволовые клетки (ESC), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSC) и послеродовые взрослых стволовых клеток. Ограничение ADSC, классифицируется как взрослых мультипотентных стволовых клеток, является то, что мультипотентность взрослых стволовых клетокв дифференциации расходящиеся родословных относительно ограничен по сравнению с ESC или IPSC. Однако этические вопросы , касающиеся вывод ESC и онкогенных свойств IPSC ограничить применение ESC и IPSC 22,23. Таким образом, многочисленные исследователи сосредоточились на взрослых стволовых клеток с усилиями по укреплению плюрипотентности. Наиболее распространенным источником взрослых мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые уже давно изучены, является костного мозга мезенхимальных стволовых клеток 24. Тем не менее, сбор костного мозга считается относительно болезненной процедурой. Другая проблема заключается в том, что выход стволовых клеток из костного мозга конечна. Аспираты костного мозга дают в среднем 6 × 10 6 ядросодержащих клеток на мл, и MSC представляют лишь от 0,001 до 0,01% от всех ядросодержащих клеток. После рассмотрения этих недостатков, ADSC предлагается в качестве менее навязчивым источника для получения мультипотентны стволовых клеток 25,26.
Ограничения по использованию ADSC в regeneraный медицины зависят в значительной степени от урожайности и качества клеток. Таким образом, значение использования свиней, чтобы изолировать ADSC в данном протоколе является, чтобы получить большое количество высококачественных взрослых стволовых клеток. Свинья является полезной моделью для животных , представляющая людей из - за сопоставимого размера органов и многих физиологических и биохимических сходство между видами 27-30. Приобретение hADSC от коммерческих компаний стоит дорого, а во многих случаях клетки манипулировали, пассировать или криоконсервации. Эквайринг клинических образцов человека довольно сложно из-за этических проблем и производство ADSC ограничено. Получим примерно 6 х 10 5 hADSC на г жира после коллагеназы. С 100 г женской груди жировой ткани (в среднем выборки), в общей сложности 6 × 10 7 клеток могут быть собраны. Используя индивидуальный мышь, выход еще более ограничен. В общей сложности 1 × 10 6 клеток могут быть собраны из 0,4 г подкожного I мышиnguinal жировой ткани с обеих ног взрослого FvB мыши (6-8 недель). Тем не менее в одной отдельной свиньи ( от 7 до 9 дней), в общей сложности 2 х 10 8 клеток может быть легко собран из 60 г подкожной жировой ткани , полученной из дорсальной депо жира. PADSC полученный в этом протоколе имеют полный мезенхимальных типа мультипотентность и соответствующие маркеры мезенхимальных стволовых клеток. Поэтому pADSC являются благоприятным источником для получения большого количества взрослых стволовых клеток без ущерба для качества стволовых клеток.
Применение pADSC не ограничивается расшифровкой дифференциацию адипоцитов включая адипогенеза и липогенеза. В последнее время ADSC стали популярным источником стволовых клеток в области регенеративной медицины 22,31,32. По сравнению с другими источниками стволовых клеток, ADSC сохраняют уникальное преимущество быть легко доступны и в изобилии, и их надежный мультипотентность было продемонстрировано перспективным источником для терапии стволовых клеток и тканей еngineering 22,33,34. Легкая доступность жировой ткани делает ADSC одним из наименее интрузивных способов получить мультипотентных клеток-предшественников. В последнее время мы дифференцированы pADSC в глюкозу реагирующих кластеров секретирующих инсулин, указывая, что pADSC не ограничиваются мезенхимальной дифференцировки (неопубликованные данные). Другие также было продемонстрировано , что ADSC можно дифференцировать на многих типах клеток , полученных из других зародышевых листков , таких как энтодермальных гепатоцитов (от hADSC 35 или pADSC 36) или эктодермы нейронов (от hADSC 37 или pADSC 38). Таким образом, pADSC могут быть использованы для высокой пропускной способности лекарственного средства или биоматериала скрининга, направляя клетки расходящихся процессов дифференцировки с получением желаемых линий. Поэтому pADSC полученный в этом протоколе имеют потенциальное применение в терапии стволовых клеток и трансплантации тканей для регенеративной медицины исследований.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить благодарность всем членам лаборатории для широкого обсуждения и техника поддерживает в этом протоколе. Исследования, проведенные в лаборатории была поддержана грантами Министерства науки и технологии (MOST 103-2314-B-002-126 и МОСТ 102-2313-B-002-026-MY3) и грантов от цели, для плана Top университета (104R350144) Национального университета, Тайвань.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-001-1 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution | Biological Industries | 03-033-1 | For antibiotics and antimycotic usage |
| αMEM, no nucleosides | Life Technologies | 12561-049 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Life Technologies | 25200072 | |
| CD4a-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700063 | |
| CD29-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700398 | |
| CD31-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700467 | |
| CD44-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700183 | |
| CD45-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700483 | |
| CD90-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700686 | |
| HLA Class I-PE (MHC I) | Sigma-Aldrich | SAB4700640 | |
| HLA-DR-PE (MHC II) | Sigma-Aldrich | SAB4700662 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71740 | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 49752 | |
| TGFB1 Recombinant Human Protein | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Carbon Steel Blades | Thomas Scientific | 6727C18 | |
| Falcon 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Falcon 6-well plate | Corning | 353046 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 |
References
- Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
- Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335 (28), 30-32 (2012).
- Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
- Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. , (2013).
- Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
- Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
- Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
- Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
- Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
- Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
- Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
- Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
- Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
- Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
- Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
- Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
- Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
- Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
- Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
- Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
- Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
- Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
- Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
- Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
- Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
- Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
- Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
- Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
- Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
- Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).
