Introduction
Fetma, förekommer i cirka 30% av befolkningen i USA, med ett body mass index över 30, har dykt upp som ett utbrett globalt fenomen 1. Fetma tenderar att leda till komplikationer inklusive hjärt- och kärlsjukdomar, typ 2-diabetes och cancer 2-4. Därför behandlar fetma är en viktig prioritering. Fetma manifesteras genom massiv expansion av fettvävnad, och tillskrivs överdriven konsumtion mat och en stillasittande livsstil i det moderna samhället. Därför dechiffrera transkriptionsreglering av adipogenes och lipogenes kunde hålla lovar att behandla fetma eller diabetes 5.
3T3-L1, 3T3-F442A och andra mus adipogena cellinjer har använts för att studera adipogenes eller lipogenes under fettvävnad utveckling. Det finns dock vissa skillnader i regleringsmekanismer mellan cellinjer in vitro och djur in vivo 6. Primära adipos-Derived stamceller (ADSC) i stromala-kärlcellfraktionen kan isoleras direkt från vita fettvävnad och induceras att differentiera. Differentiering av ADSC i adipocyter troligen rekapitulerar processen för adipogenes och lipogenes i fettvävnad utveckling in vivo 7.
Grisar är en lämplig djurmodell för att studera adipogenes och lipogenes i fettvävnad utveckling. Våra tidigare porcina studier 8-10 demonstrerar att uttryck av sterol regulatoriskt element-bindande transkriptionsfaktor 1c (SREBP1c), en viktig transkriptionsfaktor känd för att modulera transkription av lipogen fettsyrasyntas, inhiberas av fleromättade fettsyror (PUFA) i svinlever och fettvävnad. Uttrycket av porcint SREBP1c minskade med PUFA in vivo och in vitro liknar andra arter såsom människor och möss 11-13. Dessa gris studier in vitro är främst i differentiated adipocyter härledda från svin-ADSC (pADSC). Därför kan användas här primär cellkultur pADSC för att tjäna som en pålitlig cellulärt system för att studera fettvävnad utveckling eller andra stamcellstillämpningar.
Protocol
Obs: Denna metod har etablerats och används i forskning rapporterade tidigare 14-17 från detta laboratorium; över tiden den metod modifierades. Det nuvarande förfarandet utfördes med användning av ett genomsnitt av 60 g svin subkutana fettvävnad från en spädgris (7 till 9 dagar gamla) med sådd på 6-brunnars vävnadsodlingsplattor. Alla förfaranden genomfördes vid RT inte annat anges. Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid National Taiwan University.
1. Förbered Digestion Medium
- Skaffa subkutan fettvävnad från nacke och rygg; 40 till 80 g per smågris (7 till 9 dagar gamla), beroende på storleken av svinen. Här använder 60 g av subkutana fettvävnad som erhållits från en gris.
- Förbered matsmältningen medium: väga kollagenas II pulver med totalt 54.000 enheter och lös det i 90 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM,60 g fett) i en 100 ml serologisk flaska (900 enheter av kollagenas / 1,5 ml DMEM / g fett).
- Skaka försiktigt matsmältningen medium på ett skakbord (100 rpm) under minst 15 minuter för att lösa upp och sedan passera matsmältningen mediet genom ett 0,22 pm filter för sterilisering. Förvara vid 4 ° C före användning.
2. Dissekera Subkutan fettvävnad från svin
- Sterilisera alla instrument, glas och plastartiklar och varmt alla medier till 37 ° C före användning.
- Offra Nasse med elektrisk bedövning och avblodning eller genom att använda en metod i enlighet med de lokala IACUC föreskrifter. Utför dissektion noggrant och omedelbart efter smågrisar offras.
- Lägga griskulting på en ren kirurgisk bord (tillbaka uppåt och magen ner). Raka av håret från Nasse tillbaka ta bort allt hår från nacken till svansen och på båda sidor ner till mittlinjen.
- Skrubba grisens dorsala huden med 7,5% povidone-jod tillåta tre gånger (med tre nya oberoende-skurar) och sedan jod att sitta på ytan av huden under ca 10 min.
- Avlägsna povidonjod med flera sprayer av 70% etanol. Använda gaskuddar eller tissuepapper innehållande 70% etanol för att torka av huden i en riktning, att upprepa till dess att ingen uppenbar färg av povidon-jod observeras.
- Använd en skalpell för att separera svin ryggfettskiktet av subkutana fettvävnad tillsammans med den bifogade hudlagret från musklerna samtidigt som du håller upp fett och huden med pincett.
- Omedelbart doppa fettskiktet av subkutana fettvävnad med bifogade hud i en steriliserad bägare (200 ml) innehållande serumfritt DMEM.
- Spraya utsidan av bägare innehållande fettlagret med 70% etanol och placera i ett laminärt flöde cellkultur huva. Placera en stor (40 cm x 30 cm) steriliseras tre lager täckfolie i huven. [En trippel skikt används för att säkerställa kontinuerlig integritet.]
- Placeravävnad med huden vänd nedåt på täckfolien.
- Trimma den återstående muskelvävnad off av fettvävnad med användning av pincett och sax för att undvika kontaminering med muskelvävnad.
- Skär fettet i fyrkantiga bitar (~ 7 cm X 7 cm) med en skalpell eller sax. Sätta dessa bitar av fettlagret till en ny steriliserad bägare (200 ml) innehållande serumfritt DMEM.
- Ställa en anpassad skiva hållare på täckfolie monterad med ett kolstål slicer bladet (figur 1). Ta en bit av fett ur bägaren och placera den på skivaren (skinnskiktet på topp och fettlagret nedan).
- Skiva fettlagret av subkutana fettvävnad i ca 1 mm tjocka bitar. Skiva fettskiktet från huden så nära som möjligt men undvik att skära huden.
- Färs skivad fettvävnad med sax så fina som möjligt.
- Lägg filtrerade matsmältning medium innehållande kollagenas till en 250 ml Erlenmeyerkolv eller en serologisk flaska med hackadfettvävnad (54.000 enheter av kollagenas / 90 ml DMEM / 60 g fett).
- Inkubera och snurra på Erlenmeyer-kolv vid 45 rpm i en orbitalskak under 90 minuter vid 37 ° C för att göra det möjligt för kollagenas att smälta vävnaderna.
Obs: Kontrollera var 15 till 30 minuter för att undvika över matsmältningen. Rötningsprocessen är klar om matsmältningen mediet är ett slam utan betydande vävnads klumpar. - Tillsätt en lika volym (lika med uppslutningsmedium) av odlingsmedium innehållande DMEM / F12 med 10% fetalt bovint serum (FBS) för att stoppa kollagenasdigerering.
Figur 1. En anpassad skivare som används för isolering av pADSC. Dissekerade fettvävnad från svin rygg subkutan fettvävnad består av fettlagret med bifogade hudlagren. En skivare krävs för att skära fettlager cirka 1 mm tjockt med undvikande av överskärning i hudlagren. Från vänster till höger: slice hållare, skivare pad, kolstål skivare blad, och skruvar. Slicer blad sätts in mellan skiva hållare och skivare pad när den är monterad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Insamling av pADSC från Stromal-kärl fraktion
- Passera uppslutningsmedium som innehåller de spjälkade fettvävnad genom ett enda skikt av chiffon i en ren steriliserad 250 ml Erlenmeyer-kolv eller en 250 ml serologisk flaska. Använda en pincett för att trycka mitt på chiffon för att styra och underlätta passagen av digere.
- Töm och vrid chiffong med en pincett för att slutföra passagen.
- Distribuera uppslutningsmediet i fyra 50 ml koniska centrifugrör (~ 40 ml medium per rör).
- Centrifugera vid 700 xg under 10 min för uppsamling av pellet av stromala-vaskulära celler.
- Centrifugera vid 700 xg under 6 min. Dekantera supernatanten.
- Tillsätt 10 ml ACK lyseringsbuffert och sedan suspendera pelleten genom pipettering. Låt den stå i 7 minuter (5 till 10 min) vid RT för att lysera röda blodkroppar i den stromala-vaskulära fraktionen.
- Lägga lika stora mängder av DMEM (10 ml) för att stoppa reaktionen med försiktig skakning av röret och sedan centrifugera vid 700 xg under 10 min.
- Dekantera supernatanten, tillsätt 10 ml DMEM i varje rör, suspendera pelleten med upprepad pipettering, och centrifugera vid 700 xg under 6 min. Upprepa två gånger.
- Samla in och vidarebefordra DMEM (totalt 40 ml DMEM från 4 rör som representerar 60 g fett) med suspenderade celler genom en 100 pm sil i en ny 50 ml koniska rör.
- Försiktigt pipett medium flera gånger för att blanda väl och delprov 20 l cellinnehållande medium blandades med 180 pl 0,4% trypan blå lösning (1:10 utspädning) i en ny 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Räkna cellerna med en hemocytometer och sedan utsäde pADSC vid en densitet av 60.000 celler / cm 2 på en önskad storlek på odlingsskål eller -platta med odlingsmedium innehållande DMEM / F12, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotika penicillin -streptomycin-amfotericin B-lösning (P / S / A). Generellt frö pADSC på 6-brunnars vävnadsodlingsplattor för fettceller eller osteocyte differentiering. Frö pADSC på 10-cm rätter för ytan markör färgning av stamceller eller chondrocyte differentiering.
- Inkubera plattorna eller rätter i 37 ° C inkubator i luft med 5% CO2 för att tillåta cellbindning till plattorna.
4. Identifikations Stem-cellytmarkörer av pADSC med flödescytometri
- Efter 24 timmar, avlägsna mediet helt, tvätta the 10-cm skål två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och skörd cellerna med 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA i 5 min vid 37 ° C.
- Neutralisera trypsin-EDTA med lika mängder av odlingsmediet (1 ml), samla in celler i en ny 15-ml koniska rör och centrifugera sedan vid 400 x g under 7 min.
- Dekantera supernatanten. Tvätta pelleten två gånger i 3 ml iskall FCS-tvättbuffert (PBS innehållande 10% FBS) med användning av resuspension genom att pipettera i kombination med centrifugering vid 400 xg under 7 min.
- Resuspendera, räkna och justera pADSC till 10 6 celler / ml i iskall FCS-tvättbuffert. Placera cellerna (100 | j, l / varje rör) till flera nya 15-ml koniska rör och inkubera rör innehållande pADSC vid 4 ° C under 30 min med antikroppar mot antingen fykoerytrin-konjugerat CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC i-PE eller MHC II-PE för direkt färgning. Stoppa reaktionen genom tvättning av cellerna två gånger i 10 ml FCS-tvättbuffert i kombination med 400 x g centrifugation för 7 min.
- Fix och resuspendera cellerna i fixeringsbuffert (PBS med 0,01% FBS och 1% formaldehyd) för flödescytometri enligt tillverkarens anvisningar och vår tidigare publikation 18.
5. Differentiering av pADSC till adipocyter, osteocyter och kondrocyter
- Differentiering av pADSC till adipocyter
- Förbereda adipocyt induktionsmedium och adipocyt underhållsmedium
- För adipocyt induktionsmedium, förbereda ett L av serumfritt DMEM / F12 (med antibiotika av 1% P / S / A) som innehåller följande: en ml insulin lager (10 mg / ml HEPES-buffert, pH 8), slutlig koncentration = 10 | j, g / ml; 1 | il T3 lager (3,3 ', 5-trijod-L-tyronin, 1 mM i DMSO), slutlig koncentration = 1 nM; 200 | il transferrin lager (50 mg / ml dubbeldestillerat H2O), slutlig koncentration = 10 | j, g / ml; 100 pl dexametason lager (10 mM i etanol), slutlig koncentration = 1 iM; 100 | il rosiglitazon lager (10 mM i DMSO), slutlig koncentration= 1 ^ M.
- Förbered fettceller underhållsmedium med samma tillägg som induktionsmedium, men med utelämnande av dexametason.
- Differentieringsprocessen för adipocyter
Obs: Efter sådd pADSC på 6-brunnsplattor, kommer pADSC att sammanflytande inom 72 timmar.- Efter 3 dagar, avlägsna mediet fullständigt och sedan tillsätt 3 ml fettceller induktionsmedium i varje brunn. Återgå plattorna till inkubatorn. Detta är dag noll av differentiering.
- Efter 3 dagar, ta bort fettceller induktionsmedium fullständigt och ersätta med 3 ml fettceller underhållsmedium var tredje dag. Mogna adipocyter kommer terminalt differentierade med cirka 9 dagar. Över 90% av adipocyter är väl differentierade med hjälp av detta protokoll. Dessa adipocyter är redo för Oil Red O färgning.
- Förbereda adipocyt induktionsmedium och adipocyt underhållsmedium
- Differentiering av pADSC i osteocyter
- Förbered osteocyte induktionsmedium: fullständig kultur medium (DMEM / F12 med 10% FBS och 1% P / S / A) innehållande 1 | iM dexametason, 10 mM β-glycerofosfat och 50 ug / ml askorbat-2-fosfat.
- Differentieringsprocessen för osteocyter
Obs: Efter sådd pADSC på 6-brunnsplattor, kommer pADSC att sammanflytande inom 72 timmar.- Efter 3 dagar, avlägsna mediet helt och tillsätt 3 ml osteocyte induktionsmedium i varje brunn. Återgå plattorna till 37 ° C inkubator. Detta är dag noll av differentiering.
- Ersätt med osteocyte induktionsmedium var tredje dag. Mogna osteocyter bildas med 14 dagar av differentiering. Dessa osteocyter är redo för Alizarin Red S färgning.
- Differentiering av pADSC till kondrocyter
- Förbereda chondrocyte induktionsmedium: aMEM innehållande 1% FBS, 6,25 | ig / ml insulin, 50 | ig / ml askorbat-2-fosfat, och 10 ng / ml transformerande tillväxtfaktor-β1.
- Differentieringsprocessen för kondrocyter
- Trypsinize pADSC med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 5 min, och sedan neutralisera med en ml odlingsmedium. Samla in, räkna och justera pADSC i 15 ml koniska rör med en densitet av 2,5 x 10 5 celler per rör. Använda en hemocytometer för att räkna cellerna.
- Efter centrifugering vid 400 x g under 7 minuter, häll bort supernatanten utan att störa pelleten och tillsätt 1 ml chondrocyte induktionsmedium i en 15 ml tub. Röret återförs till 37 ° C inkubator. Detta är dag noll av differentiering.
- Ersätta kondrocyt induktionsmedium var tredje dag utan att ta bort celler på botten. Mogna kondrocyter bildas i ca 14 dagar. Dessa kondrocyter är redo för toluidinblått O färgning.
6. Färgning av differentierade adipocyter, Osteocytes och kondrocyter
- Oil Red O färgning för differentierade adipocyter
- Vid dag 9, ta bort fettceller underhållsmedium i 6-brunnsodlingsplattor med differentierade adipocyter och sedan tvätta plattan två gånger med PBS. [I de följande stegen, tillsätt tillräckligt utsedda reagens för att täcka varje brunn på 6-brunnar.]
- Fixa adipocyter med 10% formalinlösning under minst 10 min.
- Avlägsna formalinlösning 10% och tvätta plattan två gånger med dubbeldestillerat vatten.
- Efter två tvättningar, tillsätt 100% propylenglykol till odlingsplattan och låt stå i 1 min.
- Ta bort 100% propylenglykol och sedan lägga Oil Red O-lösning (0,5% i propylenglykol) till odlingsplattan. Låt stå i minst 10 minuter på en rocker shaker under försiktig omrörning (100 rpm).
- Ta bort Oil Red O-lösning och sedan ersätta med 60% propylenglykol. Låt stå i 1 min.
- Ta bort 60% propylenglykol och sedan tvätta plattan två gånger med double-destillerat vatten.
- Ersätt med 10% formalinlösning. De färgade lipiddroppar insidan av adipocyter är redo för observation genom Ijusmikroskopi.
- Kvantifiering av intracellulärt Oil Red O (valfria stegen nedan): efter mikroskopisk observation, ta bort 10% formalinlösning och tvätta plattan två gånger med dubbeldestillerat vatten.
- Dränera plattan helt och tillsätt 500 | il av isopropanol till den 6-brunnar.
- Låt isopropanol stå i 6-brunnar på en mjuk rocker skakapparat (100 rpm) under åtminstone 10 min för att upplösa färgämnet av Oil Red O.
- Aspirera isopropanol innehållande Oil Red O och distribuera på en 96-brunnars platta. Kvantifiera den extraherade Oil Red O med hjälp av en spektrofotometrisk avläsning vid 510 nm.
- Alizarin Red S färgning för differentierade osteocyter
- Vid dag 14, ta bort osteocyte induktionsmedium från 6-brunnars plattor med differentierade osteocyter och tvätta plattorna två gånger med PBS. [I following steg, tillsätt tillräckligt utsedda reagens för att täcka varje brunn på 6-brunnar.]
- Fixa osteocyter i 10% formalinlösning under minst 10 min.
- Avlägsna 10% formalinlösning från varje brunn och tvätta plattan två gånger med dubbeldestillerat vatten.
- Efter två tvättar, tillsätt 2% Alizarin Red S-lösning (pH = 4,1 till 4,3) till 6-brunnar och låt stå i minst 15 minuter på en liten rocker skakare (100 varv per minut).
- Avlägsna Alizarin Red S-lösning och sedan tvätta plattan två gånger med dubbeldestillerat vatten.
- Ersätt med 10% formalinlösning. Osteocyter är redo för observation av ljusmikroskop.
- Toluidinblått O färgning för differentierade kondrocyter
- Vid dag 14, aspirera chondrocyte induktionsmedium från 15 ml koniskt rör utan att ta bort sediment av differentierade kondrocyter i botten av röret och tvätta röret två gånger med PBS. [I de följande stegen, tillsätt tillräckligt utsedda reagens cover kondrocyter i botten av röret eller på den del slide.]
- Fixa kondrocyter i 10% formalinlösning under minst 10 min.
- Avlägsna 10% formalinlösning från varje rör och tvätta röret två gånger med dubbeldestillerat vatten.
- Efter två tvättningar, bädda in pellets i OCT-förening och avsnitt med en kryostat med en tjocklek av 5 um.
- Färga objektglaset av kryostatsnitt med toluidinblått O-lösning (0,1% med pH 4,1).
- Avlägsna toluidinblått O lösning och sedan tvätta avsnittet två gånger med dubbeldestillerat vatten.
Obs: Kondrocyter på bilderna är redo för observation av ljusmikroskop.
Representative Results
Den pADSC härlett från gris dorsala subkutant fett såddes på odlingsplattor eller rätter och visas i Figur 2. Morfologin för den pADSC härledd från den stromala-vaskulära fraktionen liknar mus eller människa ADSC. Tjugofyra h efter sådd, är subkonfluent pADSC vidhäftad och har ett expanderat fibroblast-liknande morfologi (Figur 2A). Den pADSC blir sammanflytande inom 72 timmar och är redo för fettceller eller andra mesenkymala-typ differentiering (Figur 2B). pADSC uppvisar stark adipogena potential efter kan observeras kemisk induktion och mogna adipocyter efter 9 dagar av differentiering med över 90% av de pADSCs visar adipogena differentiering (figur 2C).
Att ta itu med de egenskaper pADSC härleds i detta protokoll, var ytmarkörer av pADSC utvärderas genom flödescytometri anallys. Såsom visas i fig 3, ytmarkörer för mesenkymala stamceller, inklusive CD29, CD44, CD90 och MHC I (eller HLA I), i hög grad uttrycktes. Negativa ytmarkörer, såsom CD4a, CD31, CD45 och MHC II (eller HLA II) var knappt detekterbara i pADSC härleds i protokollet (Figur 3). Dessa resultat visar att dessa pADSC uppvisar mesenkymala-typ stamcellsegenskaper utan signifikant endotelial eller hematopoietisk kontamination stamcell, inklusive myeloida eller lymfoida stamfäder.
För att ytterligare bekräfta att pADSC representerar mesenkymala stamceller, var multipotens av pADSC undersöktes genom differentiering i adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Dessa adipocyter, osteocyter och kondrocyter färgades av specifika färgämnen, Oil Red O, Alizarin red S, och toluidinblått O, respektive (Figur 4). Dessa data tyder på att detta protokoll genererade pADSC som behöll multipotency med full egenskaper liknar mesenkymala typ stamceller.
Figur 2. Morfologi av pADSC från svinryggfett regionen. (A) Subkonfluenta pADSC vidhäftade och utvidgas efter 24-h ympning på en 6-brunnars odlingsplatta. (B) pADSC blev sammanflytande efter 72-h sådd på en 6-brunnars odlingsplatta. (C) Mogna adipocyter observerades efter 9 dagar av adipogena differentiering från pADSC. Bilder togs vid 100 gångers förstoring med hjälp av faskontrastmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Identifiering av stamcellsytmarkörer för pADSC. 1 x 10 5 av pADSC omsattes med specifika antikroppar och analyserades med avseende stamcellsmarkörer från flödescytometrianalys. Siffrorna anger procentandelen färgade celler i populationen (röd) jämfört med ofärgade kontroll. X-axeln representerar den relativa fluorescensintensiteten. Y-axeln representerar populationen av celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. multipotenta differentiering av pADSC. Multipotens av pADSC bestämdes genom differentiering pADSC in (A) adipocyter, (B) osteocyter (C) kondrocyter och färgades genom representativa färgämnen, Oil Red O, Alizarin red S, och toluidinblått O, respektive . imaGES togs vid (A) 100 x (B) 200 x, och (C) 100 x förstoring med hjälp av faskontrastmikroskopi, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här presenterar vi ett pålitligt cellulärt system för att studera fettvävnad utveckling i primärcellkultur pADSC. Jämfört med andra odödliggjorda cellinjer, ger denna metod ett bekvämt sätt för att isolera stora mängder av högkvalitativa vuxna mesenkymala stamceller som kan tillämpas för att studera differentieringsprocesser av adipocyter eller andra mesenkymala härstamningar relaterade till djurutveckling in vivo. Det kritiska modifierade steg i detta protokoll är att vi härleda pADSC använder en 7- till 9 dagar gamla spädgris eftersom det är lätt att hantera den lilla griskulting jämfört med äldre grisar och liknar andra arter 19,20, utbytet och multipotens av pADSC minskar när gris åldrar 21.
Potentiella stamcellskällor inkluderar embryonala stamceller (ESC), inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) och postnatal adulta stamceller. Begränsningen av ADSC, klassificeras som vuxna multipotenta stamceller, är att multipotens av adulta stamcelleratt skilja olika linjer är relativt begränsad jämfört med ESC eller iPSC. Men etiska frågor om härledning av ESC och onkogena egenskaper iPSC hindra tillämpningen av ESC och iPSC 22,23. Därför har många forskare fokuserat på vuxna stamceller med insatser för att öka pluripotens. Den vanligaste källan av vuxna mesenkymala stamceller (MSC), som länge har studerats, är benmärgshärledda mesenkymala stamceller 24. Dock är skörde benmärg betraktas som en relativt smärtsam procedur. Ett annat bekymmer är att utbytet av stamceller från benmärgen är ändlig. Benmärgsaspirat ge ett genomsnitt på 6 x 10 6 kärnförsedda celler per ml, och MSC endast representerar 0,001-0,01% av alla de kärnförsedda cellerna. Efter att ha beaktat dessa nackdelar är ADSC föreslagits som en mindre påträngande källa för att få multi stamceller 25,26.
Begränsningar av användningen av ADSC i regenerativ medicin är beroende till stor utsträckning på cellutbyte och kvalitet. Därför är betydelsen av att använda grisar för att isolera ADSC i detta protokoll för att ge en stor mängd högkvalitativa adulta stamceller. Grisen är en användbar djurmodell som representerar människor på grund av den jämförbara organstorlek och många fysiologiska och biokemiska likheter mellan arterna 27-30. Förvärva hADSC från kommersiella företag är dyrt och i många fall cellerna har manipulerats, passerats eller frysförvarade. Förvärva humana kliniska prover är relativt svårt på grund av etiska frågor och produktion av ADSC är begränsad. Vi härleda cirka 6 x 10 5 hADSC per g fett efter kollagenas matsmältningen. Med 100 g kvinnliga bröst fettvävnad (i genomsnitt provtagning), kan totalt 6 x 10 7 celler skördas. Använda en enskild mus, är avkastningen ännu mer begränsad. Totalt 1 x 10 6 celler kan skördas från 0,4 g subkutan mus inguinal fettvävnad från båda benen av en vuxen FVB mus (6-8 veckor gamla). Men i en individuell pig (7 till 9 dagar gamla), totalt 2 x 10 8 celler lätt kan skördas från 60 g av subkutan fettvävnad erhållen från den dorsala fettdepån. Den pADSC härleds i detta protokoll har full mesenkymala-typ multipotens och lämpliga mesenkymala stamceller markörer. Därför pADSC är en gynnsam källa för att erhålla stora kvantiteter av vuxna stamceller utan att kompromissa med stamcells kvalitet.
Tillämpningen av pADSC är inte begränsad till att dechiffrera adipocytdifferentiering inklusive adipogenes och lipogenes. Nyligen har ADSC blivit en populär källa för stamceller inom området regenerativ medicin 22,31,32. Jämfört med andra stamcellskällor, ADSC behålla en unik fördel av att vara lättillgängligt och riklig och deras robusta multipotens har visat sig vara en lovande källa för stamcellsterapi och vävnads engineering 22,33,34. Det enkla tillgängligheten av fettvävnad gör ADSC en av de minst påträngande sätt att få multi stamceller. Nyligen, differentierade vi pADSC till glukoskänsliga insulin-utsöndrande kluster, vilket indikerar att pADSC inte är begränsade till mesenkymala differentiering (opublicerade data). Andra har också visats att ADSC kan differentieras till många celltyper härledda från andra groddblad såsom endodermala hepatocyter (från hADSC 35 eller pADSC 36) eller ektodermala neuroner (från hADSC 37 eller pADSC 38). Således pADSC kan användas för hög genomströmning läkemedel eller biomaterial screening genom att rikta celler till olika differentieringsprocesser för att ge önskade linjerna. Därför pADSC härrör i detta protokoll har potentiell tillämpning i stamcellsterapi och vävnadstransplantation för regenerativ medicin forskning.
Acknowledgments
Författarna vill uttrycka tacksamhet till alla lab medlemmar för omfattande diskussion och teknik stöder i detta protokoll. Forskning som utförs i labbet har finansierats med bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST 103-2314-B-002-126 och MEST 102-2313-B-002-026-My3) och med bidrag från sikta mot toppen University planen (104R350144) av National University, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-001-1 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution | Biological Industries | 03-033-1 | For antibiotics and antimycotic usage |
| αMEM, no nucleosides | Life Technologies | 12561-049 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Life Technologies | 25200072 | |
| CD4a-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700063 | |
| CD29-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700398 | |
| CD31-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700467 | |
| CD44-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700183 | |
| CD45-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700483 | |
| CD90-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700686 | |
| HLA Class I-PE (MHC I) | Sigma-Aldrich | SAB4700640 | |
| HLA-DR-PE (MHC II) | Sigma-Aldrich | SAB4700662 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71740 | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 49752 | |
| TGFB1 Recombinant Human Protein | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Carbon Steel Blades | Thomas Scientific | 6727C18 | |
| Falcon 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Falcon 6-well plate | Corning | 353046 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 |
References
- Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
- Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335 (28), 30-32 (2012).
- Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
- Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. , (2013).
- Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
- Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
- Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
- Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
- Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
- Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
- Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
- Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
- Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
- Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
- Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
- Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
- Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
- Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
- Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
- Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
- Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
- Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
- Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
- Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
- Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
- Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
- Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
- Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
- Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
- Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).
