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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

वसा डिपो विशेष Sca1 की immunomagnetic पृथक्करण Published: August 11, 2016 doi: 10.3791/53890
Automatic Translation
1, 1
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, Biointerfaces Institute, University of Michigan

Introduction

स्टेम सेल प्रतिजन 1 (Sca1, या Ly6A / ई) पहली बार एक कोशिका की सतह मार्कर hematopoietic और mesenchymal स्टेम सेल 5,6 द्वारा व्यक्त के रूप में पहचान की थी। माउस वसा डिपो से प्राप्त वसा ऊतकों के stromal संवहनी अंश (SVF) fibroblasts, मैक्रोफेज, संवहनी endothelial कोशिकाओं, neuronal कोशिकाओं, और वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं 7 के शामिल कोशिकाओं की एक विषम आबादी है। वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं, या वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs) गैर लिपिड से लदी कोशिकाओं है कि कोलेजन युक्त परिवाहकीय बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 8 में निवास कर रहे हैं। CD34 +: Sca1 + 9 और CD29 + - लगभग SVF का 50% ASCs, जो वंश नकारात्मक (लिन) के रूप में की विशेषता है से मिलकर बनता है। ; वसाकोशिका पूर्वज है, जो इन विट्रो में वसाकोशिका भेदभाव करने में सक्षम हैं - CD24: इन कोशिकाओं के अधिकांश Sca1 + हैं हालांकि, केवल कोशिकाओं का एक अंश (SVF का 0.08%) Sca1 का गठन किया + कोशिकाओं कि proliferating और इन विवो की स्थिति 9 में adipocytes में फर्क के लिए पूरी तरह से सक्षम हैं। CD24 से CD24 + कोशिकाओं भेदभाव के बिना Sca1 + SVF का उपयोग करने का संभावित चेतावनी के बावजूद - immunomagnetic सेल जुदाई का उपयोग वसा डिपो से, कोशिकाओं को अलग-थलग Sca1 + ASCs एक कुशल और व्यावहारिक दृष्टिकोण प्राथमिक वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं की सेल स्वायत्त phenotype निर्धारित करने के लिए है।

मोटापा और मधुमेह, ऊतक फाइब्रोसिस और सूजन के क्षेत्र में विकास और टाइप -2 मधुमेह 3 रखरखाव करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल ही में, Tokunaga एट अल। पता चला है कि Sca1 उच्च वंक्षण (या चमड़े के नीचे, वर्ग) और perigonadal (या आंत, तुलना) से अलग कक्षों C57BL6 / जम्मू वसा डिपो विट्रो 10 में विभिन्न जीन हस्ताक्षर और ईसीएम remodeling दिखा रहे हैं। MMP14 (MT1-एमएमपी), झिल्ली-टी के एक प्रोटोटाइप सदस्यype मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) परिवार अपने कोलेजनोलिटिक गतिविधि के माध्यम से 1 सफेद वसा ऊतकों (वाट) के विकास मध्यस्थता करता है।

प्रयोगों के उदाहरण है कि अलग-थलग और निम्नलिखित प्रोटोकॉल के माध्यम से समृद्ध कोशिकाओं के साथ आयोजित किया जा सकता तीन आयामी संस्कृति, भेदभाव अध्ययन, कोलेजन गिरावट assays, और आरएनए अनुक्रमण 10,11 शामिल हैं। गिरावट assays telopeptide 11,12 का संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए एसिड निकाले कोलेजन के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अलग वसा डिपो से प्राथमिक संवहनी stromal कोशिकाओं को अलग और immunomagnetic सेल जुदाई का उपयोग वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं को समृद्ध करने के तरीकों का प्रदर्शन करेंगे। सेल छँटाई की वैधता से फ्लो के साथ और Sca1-GFP चूहों कि Sca1 + कोशिकाओं में व्यक्त GFP, एक Sca1 प्रमोटर 13 के द्वारा संचालित का उपयोग कर के माध्यम से मूल्यांकन किया जाएगा।

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Protocol

आचार कथन: उपयोग और पशुओं की देखभाल पर मिशिगन समिति के विश्वविद्यालय (UCUCA) सभी तरीकों और देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड (प्रयोगशाला पशु अनुसंधान संस्थान, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद) के अनुसार प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी गई है। चूहे एक मिशिगन विश्वविद्यालय के मछली पालने का बाड़ा में रखा जाता है और भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच दी और एक 12 घंटा अंधेरे / प्रकाश चक्र पर रखा जाता है।

1. तैयारी

  1. DMEM, 10% FBS, 1x पी / एस / जी, और 1x एंटीबायोटिक दवाओं / एंटीफंगल के साथ प्राथमिक संस्कृति मीडिया तैयार करें। इस से पहले पाचन में ऊतकों को रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। शेयर और विभाज्य 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
  2. 5mg / मिलीलीटर HBSS में भंग (+ सीए, + मिलीग्राम) वसा पैड के प्रत्येक प्रकार के लिए पांच चूहों को अलग-थलग किया जा रहा है, ऊपर से प्रकार III collagenase समाधान के पांच मिलीलीटर तैयार करें। उदाहरण के लिए, जब एक ही जीनोटाइप से वर्ग और विज़ को अलग-थलग, 10 मिलीलीटर, अगर जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती वर्ग और विज़, 20 मिलीलीटर बना है। 7.4 और काएं पीएच को समायोजित करेंफिल्टर चिढ़ाना। 50 मिलीलीटर ट्यूबों में विभाज्य। एक तरफ प्रकाश से दूर सेट करें।
  3. शल्य चिकित्सा क्षेत्र कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल का प्रयोग करें। नीचे साफ कर लें और एक नीले रंग की पैड के साथ कवर किया। नीले पैड पर कुछ इथेनॉल स्प्रे।
  4. स्टायरोफोम बोर्ड के लिए एक शोषक पैड नीचे पिन और कैंची से ट्रिम करने के लिए 22 जी सुइयों का प्रयोग करें। इथेनॉल के साथ पैड स्प्रे फिर नीले पैड पर बोर्ड की स्थापना की और विच्छेदन शुरुआत तक एक और नीले रंग की पैड के साथ कवर किया।
  5. एक स्टैंड शल्य चिकित्सा क्षेत्र से सटे में इथेनॉल और जगह के साथ दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों भरें। कैंची और इथेनॉल में संदंश रखें।
  6. सर्जिकल उपकरण इथेनॉल बंद rinsing के लिए पीबीएस प्लस 1x विरोधी विरोधी के साथ एक और 50 मिलीलीटर ट्यूब भरें।
  7. हुड में, लेबल 60 मिमी प्रत्येक ऊतक प्रकार के व्यंजन और संस्कृति मीडिया के साथ भरने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम। प्लेटों शल्य चिकित्सा क्षेत्र से सटे रखें।

2. चमड़े के नीचे (वर्ग) वसा पैड का अलगाव

  1. isoflurane और वातिलवक्ष की अधिक मात्रा के साथ माउस euthanize।
  2. धीरे70% इथेनॉल के साथ स्प्रे माउस और लापरवाह लेट गई। 22 जी सुइयों के साथ फोम बोर्ड को पंजे पिन।
  3. पेट के निचले हिस्से की त्वचा में एक छोटे से कटौती करें। संदंश के साथ कटौती के शीर्ष होल्डिंग, कैंची ले और पेरिटोनियम से त्वचा को अलग।
  4. एक बार त्वचा छाती को पेट से पेरिटोनियम से अलग किया जाता है, शरीर के पक्ष के साथ त्वचा में पार्श्व में कटौती करने से सिर की ओर पेरिटोनियम से दूर त्वचा को प्रतिबिंबित।
  5. वंक्षण वसा पकड़े शेष त्वचा शरीर से दूर प्रतिबिंबित और 22 जी सुइयों के साथ बोर्ड के लिए नीचे पिन।
  6. ठीक कैंची और संदंश में स्विच करें। पेरिटोनियम के पास मूल में संदंश के साथ वंक्षण वसा पैड ले लो और त्वचा और वंक्षण वसा कमर त्वचा के साथ वर्ग contaminating से बचने की दिशा में प्रगति के बीच दूर धज्जी।
  7. लेबल 60 मिमी डिश में insolated वंक्षण वसा पैड रखें।

3. आंत (तुलना) वसा पैड का अलगाव

  1. इसी तरह फैशन में 2.5 कदम, पेरिटोनियम आंत वसा पैड और पेट को बेनकाब करने के लिए खुले में कटौती।
  2. आंत छाती की ओर दूर ले जाएँ।
  3. बाहर अंत में विज़ वसा पैड ले लो और धीरे से ऊपर खींच। काटना तुलना वसा पैड, जबकि (या गर्भाशय यदि मादा चूहों का उपयोग) अधिवृषणी बाहर करने के लिए सावधान किया जा रहा ऊतक।
  4. लेबल पकवान और शेष तुलना पैड के लिए दोहराने कदम 3.3 में रखें।

4. वसा पैड की collagenase पाचन

  1. टिशू कल्चर हुड के लिए 60 मिमी बर्तन ले जाएँ और मीडिया से दूर aspirate।
  2. वसा पैड कीमा के साथ घुमावदार कैंची तो collagenase समाधान करने के लिए जोड़ें। इथेनॉल और पीबीएस के साथ प्रकार के ऊतकों के बीच में कैंची और संदंश कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. 300 rpm और 10-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिला तक ऊतकों पचा रहे हैं। यह स्वीकार्य है अगर वर्ग के कुछ टुकड़े अभी भी दिखाई दे रहे हैं। यह बाद में एक चरण में संबोधित किया जाएगा।
  4. collagenase समाधान करने के लिए संस्कृति मीडिया के 25 मिलीलीटर जोड़ें collag को रोकने के लिएenase उपचार, और पिपेट और एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ नीचे 10 बार पच ऊतकों को तितर-बितर करने के लिए।
  5. तनाव कोशिकाओं को एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के प्रयोग से। 300 x जी 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. ध्यान से गोली परेशान और कोशिकाओं को निलंबित करने के पिपेट गोली बाँझ पानी की 5 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे को मीडिया से दूर छानना नहीं। एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए 2 मिनट रुको।
  7. एक नया 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से 10% FBS और तनाव कोशिकाओं के साथ मीडिया के 25 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. 300 x जी 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। छानना मीडिया और संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में resuspend गोली।
  9. 1 trypan नीले: एक hemocytometer 1 उपयोग करने के साथ कोशिकाओं की गणना।
  10. प्लेट 1 एक्स 10 6 6 अच्छी तरह से थाली पर एक कुएं में कोशिकाओं।

5. चुंबकीय सेल जुदाई

  1. कोशिका आसंजन के बारे में 4 से 6 घंटे के बाद, HBSS (-Ca, -Mg) के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला। 0.05% trypsin का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं को अलग कर देना। 1 मिलीलीटर जुदाई बफर और स्पिन में trypsin सेल निलंबन पतला300 x जी 5 मिनट।
  2. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। 500 μl बफर में Resuspend कोशिकाओं। एक 10 μl विभाज्य निकालें और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
  3. 300 x जी 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं।
  4. महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला। 90 μl बफर में Resuspend कोशिकाओं। 10 μl विरोधी Sca1-FITC प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. मिलीलीटर बफर और 300 x जी 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 1 के साथ कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें।
  6. 80 μl बफर में Resuspend कोशिकाओं। 20 μl विरोधी FITC microbeads जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. मिलीलीटर बफर और 300 x जी 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 1 के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  8. 500 μl बफर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें।
  9. चुंबकीय धारक में कॉलम की जगह और 500 μl बफर के साथ स्तंभ कुल्ला।
  10. स्तंभ के लिए सेल निलंबन जोड़ें। बुलबुले से बचने जबकि pipetting।
  11. लेबल हटाया गया Sca1 लीजिए - </ Sup> कोशिकाओं और 500 μl बफर के साथ स्तंभ 3 बार धोएं। केवल नए बफर जोड़ने जब जलाशय खाली है। बुलबुले से बचने जबकि pipetting।
  12. चुंबकीय धारक से स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह है।
  13. 1 मिलीलीटर जोड़े स्तंभ जलाशय के माध्यम से आपूर्ति सवार धक्का द्वारा स्तंभ के लिए बफर और Sca1 + elute।
  14. 300 x जी पर 5 मिनट के लिए सेल अंशों स्पिन। 1 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में Resuspend कोशिकाओं।
  15. लेबल और लेबल हटाया गया अंशों से एक 10 μl विभाज्य निकालें और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
  16. 6 अच्छी तरह से थाली के 1 कुएं में प्रत्येक कक्ष के अंश प्लेट।

6. से फ्लो के साथ Sca1 उच्च ACSS की immunomagnetic पृथक्करण का सत्यापन

  1. HBSS (-Ca, -Mg) के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला और 0.05% trypsin का उपयोग कोशिकाओं को अलग कर देना।
  2. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। 1 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में Resuspend कोशिकाओं और एक hemocytometer का उपयोग गिनती।
  3. प्राप्त> 10 6
  4. सतह पर तैरनेवाला और दोहराने कदम 6.3 दो बार निकालें।
  5. 2% बकरी सीरम के 1 मिलीलीटर + 2% बीएसए और आरटी पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक के साथ कोशिकाओं Resuspend।
  6. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  7. अवरुद्ध समाधान निकालें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2% बकरी सीरम और 2% बीएसए + पीबीएस के साथ पीबीएस के 100 μl में: या विरोधी Sca1 एलेक्सा स्त्राव 647 (400 0.25 माइक्रोग्राम, 1): चूहे IgG2a एलेक्सा स्त्राव 647 (400 0.25 माइक्रोग्राम, 1) जोड़े अंधेरे में 30 मिनट के लिए।
  9. कोशिकाओं को ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 300 XG।
  10. सतह पर तैरनेवाला और दोहराने कदम 6.9 दो बार निकालें।
  11. 1 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend। प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए तैयार करने में एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन गुजरती हैं।

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Representative Results

अलग वसा पैड से Sca1 उच्च ASCs के संवर्धन।

संवहनी stromal वर्ग वसा प्रदर्शन fibroblast तरह से अलग कक्षों, सेल आकार की परवाह किए बिना बढ़ाकर Sca1 अभिव्यक्ति के स्तर (चित्रा 1 ए) के। दूसरी ओर, विज़ पर (EWAT व्युत्पन्न) Sca1 उच्च और Sca1 कम कोशिकाओं को उनके सेल आकार में स्पष्ट अंतर प्रदर्शित करता है। वर्ग (iWAT व्युत्पन्न) Sca1 उच्च कोशिकाओं, विज़ की तरह (EWAT व्युत्पन्न) Sca1 उच्च कोशिकाओं को बढ़ाकर प्रदर्शन, fibroblast-तरह सेल आकार, विज़ Sca1 कम कोशिकाओं epithelioid आकार प्रदर्शित जबकि। Sca1 उच्च Sca1-GFP चूहों से अलग कोशिकाओं को आसानी से टिशू कल्चर (चित्रा 1 बी) में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं। इन कोशिकाओं प्रवाह cytometry के साथ मूल्यांकन कर रहे थे, GFP सकारात्मक कोशिकाओं के अधिकांश के रूप में एक साथ पाया कोशिका की सतह पर Sca1 प्रोटीन व्यक्त करने की पुष्टि की थीतिवारी Sca1 एंटीबॉडी (चित्रा 1 सी)। Sca1 उच्च वंक्षण वसा पैड से ली गई कोशिकाओं वसाकोशिका भेदभाव की क्षमता में वृद्धि को बनाए रखने, जबकि EWAT व्युत्पन्न Sca1 उच्च कोशिकाओं को और अधिक पारंपरिक adipogenic मिश्रण 10 के साथ वसाकोशिका में अंतर करना मुश्किल है।

फैट Sca1 उच्च ASCs के डिपो पर निर्भर जीन एक्सप्रेशन (चित्रा 2)।

बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और संशोधक से संबंधित जीन के संवर्धन का प्रदर्शन किया जीनोम चौड़ा transcriptome आरएनए अनुक्रमण के साथ विश्लेषण (GO: 0031012, जाओ: 0005578) उन Sca1 उच्च ASCs 10 में। वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के साथ युग्मित, हम कोलेजनोलिटिक एमएमपीएस (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) iWAT- और बीच EWAT व्युत्पन्न Sca1 उच्च ASCs के अंतर अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करने में सक्षम थे। जब fluorescein लेबल प्रकार मैं कोलेजन जैल टी का उपयोग किया गया ओ pericellular गिरावट गतिविधि का आकलन है, हम स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई कोलेजन remodeling गतिविधि तुलना Sca1 उच्च ASCs 10 द्वारा मध्यस्थता मनाया।

आकृति 1
चित्रा 1: विभिन्न वसा डिपो से Murine Sca1 उच्च ASCs के immunomagnetic पृथक्करण (ए) Sca1 उच्च और Sca1 कम ASCs वर्ग (iWAT) और विज़ (EWAT) से अलग किया।। स्केल = 100 माइक्रोन। (बी) Sca-GFP चूहों के iWAT से अलग Sca1-GFP कोशिकाओं। स्केल = 100 माइक्रोन। (सी) कोशिका की सतह प्रवाह cytometry के साथ मूल्यांकन Sca1-GFP पॉजिटिव कोशिकाओं में Sca1 की अभिव्यक्ति। (बाएं) नियंत्रण चूहा आईजीजी (दाएं) विरोधी Sca1 एंटीबॉडी। एक्स अक्ष, GFP तीव्रता। वाई अक्ष, एलेक्सा-स्त्राव 647 पैनल Tokunaga, एम एट अल में पहले से दिखाया गया है।, (2014)।ig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। कोलेजनोलिटिक एमएमपीएस, TIMPs, और कोलेजन की वसा डिपो पर निर्भर अभिव्यक्ति (ए) ईसीएम के अंतर जीन अभिव्यक्ति और Sca1 उच्च अलग वसा डिपो से अलग ASCs में ईसीएम संशोधक। (बी) तुलना की वृद्धि कोलेजन गिरावट गतिविधि (EWAT व्युत्पन्न) Sca1 उच्च ASCs। कोलेजन की गिरावट फ्लोरोसेंट संकेतों (तीर और तीर) के लापता होने के रूप में दिखाया गया है। इनसेट ध्यान केंद्रित कोलेजन गिरावट वर्ग ASCs के अलग-अलग सेल द्वारा मध्यस्थता के एक बढ़े हुए छवि है। प्रकोष्ठों 72 घंटा के लिए सुसंस्कृत थे। डेटा Tokunaga, एम एट अल में पहले से दिखाया गया है।, (2014)। वी करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

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Discussion

इस के साथ साथ हम अलगाव और विभिन्न वसा पैड से murine ASCs के immunomagnetic सेल जुदाई और इन विट्रो प्रयोगों के लिए उनके उपयोग प्रदर्शित करता है। प्रस्तुत विधि Sca1 पॉजिटिव ASCs की बड़ी संख्या है, जो ASCs 9,14 की तकनीकी रूप से जटिल और महंगी FACS की मध्यस्थता अलगाव खत्म फायदेमंद है की जल्दी अलगाव के लिए प्रभावी है। FACS के विपरीत, immunomagnetic सेल जुदाई लक्ष्य सेल की आबादी की पहचान के लिए कई प्रतिजन के उपयोग की अनुमति नहीं है। बहरहाल, अगर सतह प्रतिजन अच्छी तरह से विशेषता है, immunomagnetic जुदाई का उपयोग कोशिकाओं की संख्या FACS उपकरण 15, जो अभी भी आसानी से छोटे संस्थानों में कई जैविक शोधकर्ताओं के लिए सुलभ कोर सुविधाओं के बिना नहीं है के उपयोग पर निर्भर बिना विश्लेषण किया जा बढ़ जाती है ।

वहाँ प्रक्रिया है कि एक सफल परिणाम सुनिश्चित करने के लिए मनाया जाना चाहिए के कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं। ए डी आई पी की खरीदOSE व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं माउस वसा ऊतकों डिपो की शल्य अलगाव की आवश्यकता है। इसलिए, गति और ऊतकों को पुनः प्राप्ति की सटीकता व्यवहार्य कोशिकाओं के एक उच्च संख्या उपज के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, स्वच्छ शल्य क्षेत्रों और उपकरणों के रखरखाव सेल और ऊतकों के नमूनों की सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण को रोकने के द्वारा प्रक्रिया के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं। विच्छेदित वसा ऊतकों enzymatically एक प्रकार द्वितीय collagenase समाधान में अलग किया जाना चाहिए। ईसीएम रचना वर्ग और विज़ वसा पैड 10,16, जहां तुलना वर्ग की तुलना में कम कोलेजन शामिल बीच अलग है। इसलिए, विज़ वसा पैड पाचन की अवधि वर्ग के रूप में समय की लगभग आधी राशि की आवश्यकता है। यह कहा ऊष्मायन अवधि के बाद ऊतक पाचन को रोकने के लिए भले ही ऊतक के छोटे कणों अभी भी collagenase समाधान में मौजूद हैं स्वीकार्य है। इन टुकड़ों को यंत्रवत् pipetting के साथ अलग हो सकता है एक बार संस्कृति मीडिया collagenase गतिविधि को बाधित करने के लिए जोड़ा गया है। हालांकि यह संभव है कि आगे बढ़ने के लिएimmunomagnetic छँटाई करने के लिए सीधे बारे में 4 से 6 घंटे के लिए SVF अलगाव प्लास्टिक की प्लेटें पर 1 एक्स 10 6 अवर्गीकृत कोशिकाओं के बाद, हमारे समूह के बीज सेल छँटाई के साथ जारी रखने से पहले। SVF अलगाव के दौरान कई निस्पंदन कदम के बावजूद, अभी भी मलबे सेल निलंबन के भीतर उपस्थित रहेंगे। immunomagnetic सेल जुदाई के लिए आगे बढ़ने से पहले चढ़ाना कोशिकाओं इस प्रकार की अनुमति चुंबकीय छँटाई केवल पक्षपाती कोशिकाओं है कि adipogenic पूर्वज कोशिकाओं को रोकने के लिए लागू किया जाना है, मलबे और स्वाधीन कोशिकाओं को धोने के लिए दूर एक अवसर प्रदान करता है।

जबकि Sca1 मानव जीनोम में नहीं पाया जाता है, पहचान और वैकल्पिक कोशिका की सतह एंटीजन वसा डिपो पर निर्भर मानव वसा स्टेम कोशिकाओं को 17, जब इस सेल जुदाई तकनीक के साथ युग्मित पर व्यक्त की मान्यता, हमें मानव वसा स्टेम कोशिकाओं के जीव विज्ञान को परिभाषित करने में मदद कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम (THC के लिए) एनआईएच DK095137 द्वारा समर्थित है। हम वर्तमान और पूर्व प्रयोगशाला सदस्यों को जो विकास और वर्णित विधि का परिष्कार करने के लिए योगदान धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004182 Tissue digestion
DMEM Gibco 11965-092 High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x) Gibco 10378-016 Media antibiotic
Anti-anti (100x) Gibco 15240-062 Media antifungal
FBS Gibco 16000-044
PBS (1x, pH 7.4) Gibco 10010-023
Trypsin (0.05%) Gibco 25300-054
Cell strainer BD Bioscience 352360 100-μm cell strainer
60 mm plates BD Falcon 353004
Scissors FST 14001-12 Large
Scissors FST 14091-11 Fine, curved tip
Large Forceps FST 11000-12
Fine Forceps Any vendor
25G 5/8” needles BD 305122
22G 1.5” needles BD 305159
15 ml conical tubes BD Falcon 352097
50 ml conical tubes BD Falcon 352098
MACS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC) Miltenyi Biotec 130-092-529 FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Blue chux pads Fisher 276-12424
Absorbent pads Fisher 19-165-621
Styrofoam board Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647 Invitrogen R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 Invitrogen MSCA21
Rat IgG2a R-PE Invitrogen R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE Invitrogen MF48004
Round-bottom tube BD Falcon 352058
HBSS (–Ca, –Mg) Gibco 14175-095
HBSS (+Ca, +Mg) Gibco 14025-092 For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid Prepare in house12
10x MEM Gibco 11430-030
1 M HEPES Gibco 15630-080
0.34 N NaOH Prepare in house
Cover slips Corning 2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers Invitrogen A-20004
0.89 M NaHCO3  Gibco 25080-094

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 114 वसाजनन वसा स्टेम सेल ए एस सी ईसीएम मज्जा चुंबकीय सेल जुदाई एमएमपी preadipocyte Sca1 SVF
वसा डिपो विशेष Sca1 की immunomagnetic पृथक्करण<sup&gt; उच्च</sup&gt; वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs)
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Barnes II, R. H., Chun, T. H.… More

Barnes II, R. H., Chun, T. H. Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs). J. Vis. Exp. (114), e53890, doi:10.3791/53890 (2016).

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