Introduction
Stem antigénio da célula 1 (Sca1 ou Ly6A / E) foi pela primeira vez identificado como um marcador de superfície celular expressa por hematopoiéticos e células estaminais mesenquimais 5,6. A fracção do estroma vascular (SVF) de tecido adiposo obtidas a partir de depósitos de gordura do rato é uma população heterogénea de células compreendendo de fibroblastos, macrófagos, células endoteliais vasculares, células neuronais, adipócitos e células progenitoras 7. Células progenitoras de adipócitos, ou células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) são células não-lípidos carregados que residem na matriz extracelular rica em colagénio perivascular (ECM) 8. Aproximadamente 50% de SVF consistem de ASC, os quais são caracterizados como linhagem negativa (Lin -) e CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. A maior parte destas células são Sca1 +: CD24 - progenitores de adipócitos, que são capazes de diferenciação de adipócitos in vitro; no entanto, apenas uma fracção das células (0,08% de SVF) constitui Sca1
No campo da obesidade e da diabetes, fibrose tecidual e a inflamação desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na manutenção de diabetes Tipo 3-2. Recentemente, Tokunaga et al. mostraram que células de alta SCA1 isoladas de inguinal (ou subcutânea, SQ) e perigonadal (ou visceral, VIS) C57BL6 / J depósitos de gordura apresentam diferentes assinaturas genéticas e ECM remodelação in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), um membro prototípico da membrana-tipo metaloproteinase de matriz (MMP) da família medeia o desenvolvimento de tecido adiposo branco (WAT) através da sua actividade colagenolítica 1.
Exemplos de ensaios que podem ser realizados com as células isoladas e enriquecidas por meio do seguinte protocolo incluem cultura tridimensional, os estudos de diferenciação, os ensaios de degradação de colagénio, e a sequenciação de ARN 10,11. Ensaios de degradação deve ser conduzida com colágeno extraído-ácido para garantir a preservação da telop�tido 11,12. O protocolo a seguir irá demonstrar os métodos para isolar células estromais vasculares primárias de diferentes depósitos de gordura e enriquecer as células progenitoras adipócitos usando separação de células imunomagn�ica. A validade da separação de células será avaliada com citometria de fluxo e através da utilização de ratinhos Sca1-GFP que expressam GFP em células Sca1 +, conduzido por um promotor Sca1 13.
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Protocol
Declaração de Ética: A Universidade de Michigan Comitê de Uso e tratamento dos animais (UCUCA) aprovou todos os métodos e protocolos, de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto de Pesquisa Animal Laboratory, Conselho Nacional de Pesquisa). Os ratinhos são mantidos no biotério da Universidade de Michigan e é dado livre acesso a comida e água e mantidos numa / ciclo de luz escuro de 12 h.
1. Preparações
- Preparar meios de cultura primária com DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G e 1x antibióticos / antifúngicos. Isto irá ser utilizado para manter tecidos na digestão antes. Coloque estoque e da alíquota em 37 banho de água ºC.
- Prepare cinco mililitros de solução de colagenase Tipo III em 5 mg / ml dissolvida em HBSS (+ Ca, Mg +) para cada tipo de almofada de gordura a ser isolado, até cinco ratos. Por exemplo, quando se isola SQ e VIS de um único genótipo, fazer 10 ml, se do tipo selvagem e mutante SQ e VIS, fazer 20 ml. Ajustar o pH para 7,4 e steirritar filtro. Aliquota em tubos de 50 ml. Separe longe da luz.
- Use 70% de etanol para desinfectar campo cirúrgico. Limpe e cubra com uma almofada azul. Borrife um pouco de etanol no bloco azul.
- Use os 22 g de agulhas de definir uma almofada absorvente para a placa de isopor e cortar com uma tesoura. Pulverizar o pad com etanol, em seguida, definir a bordo na plataforma azul e cubra com outra almofada azul até começando dissecção.
- Encha dois tubos de 50 ml com etanol e coloque em uma posição adjacente ao campo cirúrgico. Coloque as tesouras e pinças do etanol.
- Encher outro tubo de 50 ml com PBS acrescido 1x anti-anti para enxaguar etanol off instrumentos cirúrgicos.
- Na capa, etiqueta 60 mm pratos para cada tipo de tecido e encher com meios de cultura aquecido a 37 ºC. Colocar as placas adjacentes à área cirúrgica.
2. Isolamento de subcutânea (SQ) Fat Pads
- Euthanize rato com uma overdose de isoflurano e pneumotórax.
- Suavementespray de rato com 70% de etanol e leigos supina. Pin as patas para a placa de espuma com 22 agulhas G.
- Faça um pequeno corte na pele do abdômen inferior. Segurando a parte superior do corte com a pinça, pegue a tesoura e separar a pele do peritônio.
- Uma vez que a pele é separada do peritoneu do abdómen ao tórax, reflectir a pele para longe do peritoneu para a cabeça, fazendo cortes laterais na pele ao longo do lado do corpo.
- Refletir o restante da pele segurando a gordura inguinal longe do corpo e fixar para baixo à placa com 22 agulhas G.
- Mudar para uma tesoura fina e fórceps. Agarre a almofada de gordura inguinal com a pinça na origem perto do peritônio e snip de distância entre a pele e gordura inguinal progredindo em direção a virilha evitando a contaminação do SQ com a pele.
- Coloque a almofada de gordura inguinal insolated no prato mm marcado 60.
3. Isolamento da Visceral (VIS) bolsas de gordura
- De uma maneira semelhante ao passo 2.5, cortar o peritoneu aberto para expor o almofadas de gordura visceral e intestino.
- Mova o intestino em direção ao tórax.
- Agarre a almofada de gordura VIS na extremidade distal e puxe para cima. Dissecar a almofada de gordura VIS, tendo o cuidado de excluir do epidídimo (ou uterina, se utilizando do sexo feminino camundongos) do tecido.
- Coloque no prato rotulados e repita o passo 3.3 para o bloco restante VIS.
4. A colagenase digestão da gordura Pads
- Mova 60 mm pratos para a capa de cultura de tecidos e aspirar off mídia.
- Picar as bolsas de gordura com tesoura curva, em seguida, adicionar a solução de colagenase. Certifique-se de lavar as tesouras e pinças entre tipos de tecido com etanol e PBS.
- Agitar a 300 rpm e 37 ° C durante 10-20 minutos, até que os tecidos são digeridos. É aceitável se algumas peças de SQ ainda são visíveis. Esta questão será abordada em uma etapa posterior.
- Adicionar 25 ml de meio de cultura para a solução de colagenase para parar o collagtratamento Enase e pipeta cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta 10 ml sorológico para dispersar os tecidos digeridos.
- As células da estirpe utilizando um filtro de células 100 mm. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g.
- Cuidadosamente decantar media para não perturbar o sedimento e adicionar 5 ml de água estéril para o sedimento e gentilmente pipeta de suspender as células. Espera 2 minutos para lisar os eritrócitos.
- Adicionar 25 ml de meio com células FBS e deformação de 10% através de um novo filtro de células 100 mm.
- Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Decantar e meios sedimento ressuspender em 1 ml de meio de cultura.
- Contar as células com um hemocitómetro utilizando 1: 1 de azul de tripano.
- Placa 1 X 10 6 células num poço de uma placa de 6 poços.
5. Separação celular Magnetic
- Depois de cerca de 4 a 6 horas de adesão celular, lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg). Separar as células aderentes utilizando 0,05% de tripsina. Diluir suspensão de células de tripsina em 1 ml de tampão de separação e rotação para5 min a 300 x g.
- Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul de tampão. Remove-se uma alíquota de 10 ul e contar as células utilizando um hemocitómetro.
- células de centrifugação durante 5 min a 300 x g.
- Aspirar o sobrenadante completamente. Ressuspender as células em 90 ul de tampão. Adiciona-se 10 de anticorpo primário anti-Sca1-FITC ul. Misture bem e incubar por 10 minutos a 4 ºC no escuro.
- Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g. Remover o sobrenadante completamente.
- Ressuspender as células em 80 ul de tampão. Adicionar 20 pi microesferas anti-FITC. Misture bem e incubar durante 15 min a 4 ºC no escuro.
- Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão.
- Coloque coluna no suporte magnético e lave coluna com 500 ul de tampão.
- Adicionar a suspensão de células em coluna. Evitar bolhas enquanto pipetagem.
- Recolher o Sca1 não marcado - </ Sup> células e lavagem da coluna 3 vezes com 500 ul de tampão. Apenas adicionar novo buffer quando o reservatório está vazio. Evitar bolhas enquanto pipetagem.
- Remover a coluna do suporte magnético e coloque em um tubo de 15 ml.
- Adicionar 1 ml de tampão de coluna e eluir Sca1 + empurrando o êmbolo fornecido através do reservatório coluna.
- Girar as fracções de células durante 5 min a 300 x g. Ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura.
- Remove-se uma alíquota de 10 ul das fracções marcadas e não marcadas e contar as células utilizando um hemocitómetro.
- Placa cada fracção de células em um poço de uma placa de 6 poços.
6. Verificação de Separação Immunomagnetic de Sca1 alta ACSs com Citometria de Fluxo
- Lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg) e dissociar as células usando tripsina a 0,05%.
- células centrifugar a 300 xg por 5 min. Ressuspender as células em meios de cultura 1 ml e contar com um hemocitômetro.
- Obter> 10 6
- Remover o sobrenadante e repita o passo 6.3 mais duas vezes.
- Ressuspender as células com 1 ml de soro de cabra 2% + BSA a 2% e de bloco, durante 30 min à TA.
- células centrifugar a 300 xg por 5 min.
- Remover solução de bloqueio.
- Adicionar ratazana IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400) ou anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400), em 100 ul de PBS com soro de cabra 2% e 2% de BSA + PBS a 4 ° C durante 30 min no escuro.
- Adicionar 1 ml de PBS frio a células. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e repita o passo 6.9 mais duas vezes.
- Ressuspender as células em 1 ml de PBS. Passa suspensões de células através de um coador de células de 100 um em preparação para a análise por citometria de fluxo.
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Representative Results
Enriquecimento de altas ASC SCA1 de diferentes bolsas de gordura.
As células estromais vasculares isoladas a partir de SQ visor de gordura do tipo fibroblastos, esticado a forma da célula, independentemente do nível de expressão Sca1 (Figura 1A). Por outro lado, VIS (eWAT derivados) células de baixa SCA1 alta e SCA1 demonstrar diferença distinta na sua forma celular. Como quadrados (IWAT derivados) de células de alta SCA1, VIS (eWAT-derivada) de células de alta SCA1 exibir esticado, a forma de células de fibroblastos-like, enquanto que as células de baixa VIS SCA1 demonstrar forma epithelioid. Células de alta SCA1 isoladas a partir de ratinhos SCA1-GFP são facilmente identificadas como células GFP positivas em cultura de tecidos (Figura 1B). Quando estas células foram avaliadas com citometria de fluxo, a maior parte das células positivas para GFP foram confirmados para expressar proteínas SCA1 na superfície da célula como detectado com umanticorpo ti-Sca1 (Figura 1C). Células de alta SCA1 derivados de almofada de gordura inguinal mantêm o aumento da capacidade de diferenciação dos adipócitos enquanto que as células altas SCA1 eWAT derivado são mais difíceis de se diferenciar em adipócitos com mistura adipogênica convencional 10.
Gordura Gene Expression Depot-dependente de elevadas ASC SCA1 (Figura 2).
Transcriptoma do genoma análises com o seqüenciamento RNA demonstrou o enriquecimento de genes relacionados com proteínas da matriz extracelular e modificadores (GO: 0.031.012, GO: 0.005.578) nas ASC altas SCA1 10. Juntamente com análises em tempo real PCR, fomos capazes de demonstrar a expressão diferencial das MMPs colagenolíticas (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) SCA1 entre iWAT- e eWAT derivado altas ASC. Quando marcado com fluoresceína colagénio tipo I géis foram usadas t Para avaliar a atividade de degradação pericelular, observamos a acentuadamente aumento da atividade colágeno remodelação mediada pelo VIS SCA1 altas ASC 10.
Figura 1: Separação Immunomagnetic de Murino SCA1 altas ASC de diferentes depósitos de gordura (A) SCA1 altos e baixos SCA1 ASC isoladas de SQ (IWAT) e VIS (eWAT).. Escala = 100 um. (B) As células Sca1-GFP isolado a partir de murganhos Sca IWAT-GFP. Escala = 100 um. Expressão na superfície (C) celular em células de Sca1-Sca1-GFP positivo apurado com citometria de fluxo. IgG de rato de controlo (esquerda) (à direita) anticorpo anti-Sca1. Eixo dos X, a intensidade de GFP. Eixo Y, Alexa Fluor 647. Painel A, mostrado anteriormente em Tokunaga, M. et ai., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Expression Fat Depot Dependente de colagenolítica MMPs, TIMPs e colágenos (A) a expressão gênica diferencial de ECMs e modificadores de ECM na ASC altas SCA1 isoladas de diferentes depósitos de gordura. (B) O aumento da atividade de degradação de colágeno do VIS (eWAT derivado) ASC altas SCA1. A degradação do colagénio é mostrado como o desaparecimento dos sinais fluorescentes (setas) e pontas de seta. Inset é uma imagem ampliada de degradação do colágeno focado mediada por célula individual da ASC SQ. As células foram cultivadas durante 72 h. Os dados apresentados anteriormente em Tokunaga, M. et al., (2014). Por favor clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui demonstramos o isolamento e separação de células imunomagnética de ASC de murino a partir de diferentes camadas de gordura e o seu uso em experiências in vitro. O método apresentado é eficaz para o isolamento rápido de um grande número de ASC SCA1-positivo, o que é vantajoso sobre o isolamento tecnicamente complexo e caro mediada por FACS de ASC 9,14. Ao contrário de FACS, a separação imunomagnética célula não permite a utilização de antigénio múltiplos para a identificação de uma população de células alvo. No entanto, se o antigénio de superfície está bem caracterizada, a utilização de separação imunomagnética aumenta o número de células a ser analisado sem depender do uso de equipamento de FACS 15, que ainda não é facilmente acessível para muitos investigadores biológicos em pequena institutos sem instalações centrais .
Há alguns aspectos críticos do procedimento que deve ser observado para assegurar um resultado bem-sucedido. A aquisição de ADIPcélulas estaminais ose-derivado requer o isolamento cirúrgico de depósitos de tecido adiposo de rato. Por conseguinte, a velocidade e a precisão de recuperação de tecido é imperativo, para se obter um elevado número de células viáveis. Além disso, a manutenção de campos cirúrgicos e de instrumentos limpos são vitais para o resultado do processo, evitando a contaminação microbiana de amostras de células e tecidos. tecidos adiposos dissecados deve ser enzimaticamente dissociada em uma solução de colagenase tipo II. Composição ECM difere entre SQ e VIS bolsas de gordura 10,16, onde VIS contêm menos colágeno do que SQ. Portanto, a duração da almofada de gordura VIS digestão requer aproximadamente metade da quantidade de tempo que SQ. É aceitável para parar a digestão do tecido após o período de incubação, considerando ainda que pequenas partículas de tecido ainda estão presentes na solução de colagenase. Estas peças podem ser mecanicamente dissociadas com pipetagem uma vez o meio de cultura foi adicionado para inibir a actividade da colagenase. Embora seja possível procederdiretamente para triagem imunomagn�ica após isolamento SVF, nossas sementes do grupo 1 x 10 6 células não ordenados em placas de plástico de cerca de 4 a 6 horas antes de continuar com separação de células. Apesar de vários passos de filtração durante o isolamento SVF, detritos irá ainda estar presente na suspensão de células. Plaqueamento das células antes de se proceder à separação imunomagnética célula fornece uma oportunidade para lavar restos de células não ligadas e de distância, permitindo, assim, triagem magnética para ser aplicado apenas às células aderentes que contêm células progenitoras adipog�icas.
Enquanto Sca1 não for encontrado no genoma humano, a identificação e a validação de antigénios de superfície celular alternativos expressos em células dependentes de depósito de gordura estaminais adiposo humano 17, quando acoplado com esta técnica de separação de células, podem ajudar a definir a biologia das células estaminais adiposo humano.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo NIH DK095137 (de THC). Agradecemos aos membros do laboratório atuais e antigos que contribuíram para o desenvolvimento e sofisticação dos métodos descritos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
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