Introduction
Stamcel antigeen 1 (SCA1 of Ly6A / E) werd voor het eerst geïdentificeerd als een celoppervlak marker door hematopoietische en mesenchymale stamcellen 5,6 uitgedrukt. De stromale vasculaire fractie (SVF) van vetweefsel verkregen uit muizen vetdepots een heterogene populatie van cellen omvattende fibroblasten, macrofagen, vasculaire endotheelcellen, neuronale cellen, adipocyten en progenitorcellen 7. Adipocyten voorlopercellen of adipeus afgeleide stamcellen (ASC) zijn niet lipide beladen cellen die in het collageen-rijke perivasculaire extracellulaire matrix (ECM) 8 bevinden. Ongeveer 50% van de SVF uit ASC, die worden gekenmerkt als lineage-negatieve (Lin -) en CD29 +: CD34 +: SCA1 + 9. De meeste van deze cellen SCA1 +: CD24 - adipocyten stamcellen die in staat adipocytdifferentiatie in vitro; echter slechts een fractie van cellen (0,08% van SVF) vormt SCA1
Op het gebied van obesitas en diabetes, weefsel fibrose en ontsteking spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en instandhouding van type 2 diabetes 3. Recentelijk Tokunaga et al. toonde aan dat SCA1 hoge cellen geïsoleerd uit de lies (of subcutane, SQ) en perigonadal (of viscerale, VIS) C57BL6 / J vet depots vertonen ander gen handtekeningen en ECM remodeling in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), een prototypisch lid van de membraan-tYpe matrix metalloproteinase (MMP) familie bemiddelt de ontwikkeling van wit vetweefsel (WAT) via haar collagenolytische activiteit 1.
Voorbeelden van experimenten die kan worden uitgevoerd met de cellen geïsoleerd en verrijkt door de volgende protocol omvatten drie-dimensionale cultuur, differentiatie studies, collageen degradatie assays, en RNA-sequencing 10,11. Degradatie assays worden uitgevoerd met zuur geëxtraheerd collageen dienen om de telopeptide 11,12 waarborgen. Het volgende protocol zal de methoden aantonen primaire vasculaire stromale cellen te isoleren uit verschillende vetdepots en verrijken adipocyten progenitorcellen via immunomagnetische celscheiding. De geldigheid van de cel sortering zal worden beoordeeld met flowcytometrie en door het gebruik van SCA1-GFP muizen die GFP in SCA1 + cellen uit te drukken, aangedreven door een SCA1 promotor 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: De Universiteit van Michigan Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) heeft alle methoden en protocollen in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council) goedgekeurd. Muizen worden gehandhaafd in een universiteit van Michigan terrarium en krijgen gratis toegang tot voedsel en water en gehouden op een 12 uur donker / licht cyclus.
1. Voorbereidingen
- Bereid primaire kweek medium met DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G en 1x antibiotica / antimycotica. Dit wordt gebruikt om weefsels vóór vertering houden. Plaats voorraad en hoeveelheid in 37 ° C waterbad.
- Bereid vijf milliliter Type III collagenase oplossing bij 5 mg / ml opgelost in HBSS (+ Ca, Mg +) voor elk van vetkussentje afgezonderd, tot vijf muizen. Wanneer bijvoorbeeld het isoleren en SQ VIS uit één genotype, maakt 10 ml, wanneer wild-type en mutant SQ en VIS, maken 20 ml. De pH instellen op 7,4 en steRILE filter. Aliquot in 50 ml buizen. Zet opzij de buurt van licht.
- Gebruik 70% ethanol om chirurgische veld te desinfecteren. Veeg naar beneden en dek af met een blauwe pad. Spuit wat ethanol op de blauwe pad.
- Gebruik de 22 G naalden vast te pinnen een absorberende pad om de piepschuim bord en trim met een schaar. Spuit de pad met ethanol en stel het bord op de blauwe pad en dek af met een ander blauwe pad tot aan het begin van dissectie.
- Vul twee 50 ml buisjes met ethanol en in een stand nabij het operatiegebied. Leg de schaar en pincet in de ethanol.
- Vul een 50 ml buis met PBS plus 1 x anti-anti te spoelen ethanol uit chirurgische instrumenten.
- In de kap, etiket 60 mm schalen voor elk weefseltype en vul met cultuurmedia verwarmd tot 37 ° C. Plaats de platen naast het operatiegebied.
2. Isolatie van subcutane (SQ) vetkussentjes
- Euthanaseren muis met een overdosis van isofluraan en pneumothorax.
- Voorzichtigspuiten muis met 70% ethanol en leg liggende. Speld de poten om het schuim bord met 22 G naalden.
- Maak een kleine snede in de huid van de onderbuik. Die de top van de snede met de tang, neem de schaar en scheiden de huid van peritoneum.
- Nadat de huid is gescheiden van het peritoneum van de buik om de thorax, weerspiegelen de huid van het peritoneum naar het hoofd door zijdelingse sneden in de huid aan de zijkant van het lichaam.
- Afspiegeling van de resterende huid die de lies vet weg van het lichaam en het vastpinnen op het bord met 22 G naalden.
- Overschakelen naar fijne schaar en pincet. Pak de lies vet pad met de tang aan de oorsprong in de buurt van het buikvlies en knip weg tussen de huid en lies vet op weg zijn naar de lies te vermijden besmetting van de SQ met de huid.
- Plaats de insolated lies vet pad in de gelabelde 60 mm gerecht.
3. Isolatie van Visceral (VIS) vetkussentjes
- Op soortgelijke wijze als stap 2,5, snijd het peritoneum open naar de viscerale vetkussentjes en darm bloot.
- Beweeg de darm weg in de richting van de thorax.
- Pak de VIS vet pad aan het uiteinde en voorzichtig omhoog te trekken. Ontleden de VIS vet pad terwijl ze voorzichtig om epididymis uit te sluiten (of de baarmoeder, bij gebruik van vrouwelijke muizen) weefsel.
- Plaats in geëtiketteerde schaal en herhaal stap 3.3 voor de resterende VIS pad.
4. Collagenase vetvertering Pads
- Verplaats 60 mm schalen in de weefselkweek kap en zuig af media.
- Hak de vetkussentjes met gebogen schaar vervolgens toe te voegen aan collagenase oplossing. Zorg ervoor dat de schaar en pincet in spoel tussen weefseltypes met ethanol en PBS.
- Schudden bij 300 rpm en 37 ° C gedurende 10-20 min tot weefsel verteerd. Het is aanvaardbaar als sommige stukken van SQ zijn nog steeds zichtbaar. Dit zal in een latere stap worden aangepakt.
- Voeg 25 ml kweekmedia de collagenase oplossing voor het stoppen collagENase behandeling en pipet op en neer 10 keer met een 10 ml serologische pipet om de verteerde weefsels verspreiden.
- Stam cellen onder toepassing van een 100 um zeef cel. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- decanteer voorzichtig van media niet de pellet te verstoren en voeg 5 ml steriel water om de pellet voorzichtig pipet cellen opschorten. Wacht 2 min aan erytrocyten te lyseren.
- Voeg 25 ml medium met 10% FBS en stam cellen door een nieuw 100 um zeef cel.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Giet media en resuspendeer pellet in 1 ml van de cultuur media.
- Aantal cellen met een hemocytometer gebruikt 1: 1 trypan blue.
- Plaat 1 x 10 6 cellen in één putje op 6-wells plaat.
5. magnetische celscheiding
- Na ongeveer 4-6 uur van celadhesie Spoel de cellen tweemaal met HBSS (-Ca, Mg). Distantiëren hechtende cellen met behulp 0,05% trypsine. Verdun trypsine cel suspensie in 1 ml scheiding buffer en draaien voor5 min bij 300 x g.
- Zuig supernatant. Resuspendeer cellen in 500 pi buffer. Verwijderen van een 10 pi aliquot en cellen te tellen met een hemocytometer.
- Spin cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Zuig supernatant volledig. Resuspendeer cellen in 90 ul buffer. Voeg 10 ul anti-SCA1-FITC primair antilichaam. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen met 1 ml buffer en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder supernatant volledig.
- Resuspendeer cellen in 80 ul buffer. Voeg 20 ul anti-FITC microbolletjes. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen met 1 ml buffer en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 500 ui buffer.
- Plaats de kolom in de magnetische houder en spoel de kolom met 500 pi buffer.
- Voeg celsuspensie naar kolom. Vermijd het bellen tijdens het pipetteren.
- Verzamel de ongelabelde SCA1 - </ Sup> cellen en waskolom 3 maal met 500 pi buffer. Alleen het toevoegen van nieuwe buffer als het reservoir leeg is. Vermijd het bellen tijdens het pipetteren.
- Kolom verwijderen uit de magneethouder en plaats in een 15 ml conische buis.
- Voeg 1 ml buffer kolom en elueer SCA1 + door op geleverde plunjer de kolom reservoir.
- Spin down cel fracties gedurende 5 min bij 300 x g. Resuspendeer cellen in 1 ml kweekmedium.
- Verwijderen 10 pi aliquot van het gemerkte en ongemerkte fracties en cellen te tellen met een hemocytometer.
- Plate elke fractie cel in 1 put van een 6-wells plaat.
6. Keuring van Immunomagnetische Scheiding van SCA1 hoge ACSS met flowcytometrie
- Spoel de cellen tweemaal met HBSS (-Ca, Mg) en dissociëren cellen onder toepassing 0,05% trypsine.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min. Resuspendeer cellen in 1 ml kweekmedium en te tellen met een hemocytometer.
- Verkrijgen van> 10 6
- Verwijder supernatant en herhaal stap 6.3 twee keer.
- Resuspendeer cellen met 1 ml 2% geitenserum + 2% BSA en blokkeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min.
- Verwijderen blokkeeroplossing.
- of anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400): rat IgG2a Alexa Fluor 647 (400 0,25 g, 1) voeg, in 100 gl PBS met 2% geitenserum en 2% BSA + PBS bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
- Voeg 1 ml koude PBS aan cellen. Centrifuge 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant en herhaal stap 6.9 twee keer.
- Resuspendeer cellen in 1 ml PBS. Celsuspensies passeren door een 100 um zeef cel ter voorbereiding van flowcytometrische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verrijking van SCA1 hoge ASC uit verschillende vetkussentjes.
De vasculaire stromale cellen geïsoleerd van SQ vet weergave fibroblast-achtige, uitgerekte cel vorm ongeacht SCA1 expressie (Figuur 1A). Aan de andere kant, VIS (eWAT-afgeleide) SCA1 hoog en SCA1 laag cellen aan te tonen duidelijk verschil in hun cel vorm. Net als SQ (iWAT-afgeleide) SCA1 hoge cellen, VIS (eWAT-afgeleide) SCA1 hoge cellen weer te geven uitgerekt, fibroblast-achtige cel vorm, terwijl VIS SCA1 laag cellen aan te tonen epithelioid vorm. SCA1 hoog cellen geïsoleerd uit SCA1-GFP muizen gemakkelijk geïdentificeerd als GFP-positieve cellen in weefselkweek (Figuur 1B). Wanneer deze cellen cytometrie werden beoordeeld met stroom meeste GFP positieve cellen werden bevestigd SCA1 eiwitten op het celoppervlak tot expressie zoals gedetecteerd met Anti-SCA1 antilichaam (Figuur 1C). SCA1 hoog cellen afkomstig van inguinale vetkussentjes handhaven verhoogde capaciteit van adipocytdifferentiatie dat eWAT-afgeleide cellen SCA1 hoog zijn moeilijker te differentiëren tot adipocyten conventionele adipogene mix 10.
Vet Depot-afhankelijke genexpressie van SCA1 hoge ASC (figuur 2).
Genoom-brede transcriptoom analyses met RNA sequencing toonde de verrijking van genen betrokken bij extracellulaire matrix eiwitten en modifiers (GO: 0.031.012, GO: 0.005.578) in die SCA1 hoge ASC 10. In combinatie met real-time PCR-analyses, waren we in staat om de differentiële expressie van de collagenolytisch MMP's (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) tussen iWAT- en eWAT-afgeleide SCA1 hoge ASC's aan te tonen. Wanneer fluoresceïne gelabeld type I collageen gels werden t o beoordelen pericellulaire degradatie activiteit, zagen we het sterk verhoogde collageen remodeling activiteit gemedieerd door VIS SCA1 hoge ASC 10.
Figuur 1: Immunomagnetische Scheiding van muizen SCA1 hoge ASC's uit verschillende Fat Depots (A) SCA1 hoog en SCA1 lage ASC geïsoleerd van SQ (iWAT) en VIS (eWAT).. Schaal = 100 urn. (B) SCA1-GFP cellen geïsoleerd uit iWAT van Sca-GFP muizen. Schaal = 100 urn. (C) Celoppervlakexpressie van SCA1 in SCA1-GFP-positieve cellen onderzocht met flowcytometrie. (Links) controle rat IgG (rechts) anti-SCA1 antilichaam. X-as, GFP intensiteit. Y-as-Alexa Fluor 647. Kader A eerder Tokunaga, M. et al getoond., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Vet Depot-afhankelijke expressie van Collagenolytische MMPs, TIMP's, en collagenen (A) Differentiële genexpressie van ECM's en ECM modifiers in SCA1 hoge ASC geïsoleerd van verschillende vet depots. (B) verhoogde collageen afbraak activiteit van VIS (eWAT-afgeleide) SCA1 hoge ASC. Afbraak van collageen wordt getoond als het verdwijnen van fluorescentiesignalen (pijlen en pijlpunten). Inzet is een vergroot beeld van gerichte collageen degradatie gemedieerd door afzonderlijke cel van SQ ASC. Cellen werden gedurende 72 uur. Gegevens die eerder in Tokunaga, M. et al getoond., (2014). Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin tonen we de isolatie en immunomagnetische celscheiding van murine ASC's uit verschillende vetkussentjes en hun gebruik voor in vitro experimenten. De onderhavige methode is effectief voor de snelle isolatie van talrijke SCA1-positieve ASC, hetgeen voordelig via technisch complexe en dure FACS gemedieerde isolatie van ASC 9,14. Unlike FACS gaat immunomagnetische celscheiding niet het gebruik van meerdere antigeen voor de identificatie van een doelwit celpopulatie toelaten. Niettemin, als het oppervlak antigeen is goed gekarakteriseerd, het gebruik van immunomagnetische scheiding verhoogt het aantal cellen te analyseren zonder te vertrouwen op het gebruik van FACS-apparatuur 15, die nog steeds moeilijk toegankelijk voor vele biologische onderzoekers van kleine instellingen zonder kernfaciliteiten .
Er zijn een aantal kritische aspecten van de procedure die moet worden nageleefd om een succesvol resultaat te garanderen. De aanschaf van ADIPOSE-afgeleide stamcellen vereist de chirurgische isolatie van de muis vetweefsel depots. Daarom is de snelheid en nauwkeurigheid van weefsel retrieval is noodzakelijk om een groot aantal levensvatbare cellen werd verkregen. Bovendien, het behoud van schone chirurgische instrumenten velden en zijn essentieel voor de uitkomst van de procedure door het voorkomen van microbiële besmetting van cel- en weefselmonsters. Ontleed vetweefsel moet enzymatisch los worden gezien in een type II collagenase oplossing. ECM samenstelling verschilt tussen de SQ en VIS vetkussentjes 10,16, waar de VIS minder collageen dan SQ bevatten. Daarmee is de duur van VIS vetkussentje vertering is ongeveer de helft van de tijd als SQ. Het is aanvaardbaar om weefsel digestie stoppen na de aangegeven incubatieperiode zelfs als kleine deeltjes weefsel nog in de collagenase oplossing. Deze stukken kunnen mechanisch worden gescheiden in pipetteren zodra kweekmedium is toegevoegd aan collagenase activiteit te remmen. Hoewel het mogelijk is om door te gaandirect naar immunomagnetische sortering SVF na isolatie, onze fractie zaden 1 x 10 6 cellen ongesorteerde op plastic platen gedurende 4 tot 6 uur alvorens verder met celsortering. Ondanks meerdere filtratie stappen tijdens SVF isolement, zal puin nog steeds aanwezig in de cel opschorting. Plating de cellen alvorens tot immunomagnetische celscheiding biedt een mogelijkheid om te wassen puin en losse cellen weg, waardoor magnetische sortering alleen worden toegepast op hechtende cellen die adipogenic stamcellen bevatten.
Terwijl SCA1 niet wordt gevonden in het menselijk genoom, de identificatie en validatie van alternatieve cel oppervlakte-antigenen uitgedrukt per kg vet depot-afhankelijke humane adipose stamcellen 17, wanneer gekoppeld aan deze cel scheiding techniek kan ons helpen de biologie van vetweefsel menselijke stamcellen te definiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH DK095137 (THC). Wij danken de huidige en voormalige lab-leden die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling en verfijning van de beschreven methoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
