Introduction
Stem cell antigen 1 (Sca1 eller Ly6A / E) blev først identificeret som en celle overflade markør udtrykt af hæmatopoietiske og mesenkymale stamceller 5,6. Den stromale vaskulære fraktion (SVF) af fedtvæv opnået fra mus fedtdepoter er en heterogen population af celler omfattende af fibroblaster, makrofager, vaskulære endotelceller, neuronale celler og adipocyt progenitorceller 7. Adipocyt progenitorceller eller adipøst afledte stamceller (ASC) er ikke-lipid-laden celler, der bor i kollagen-rige perivaskulær ekstracellulær matrix (ECM) 8. Ca. 50% af SVF bestå af ASC'er, som er karakteriseret som slægt-negative (Lin -) og CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. De fleste af disse celler er Sca1 +: CD24 - adipocyt progenitorer, som er i stand adipocytdifferentiering in vitro; dog kun en brøkdel af celler (0,08% af SVF) udgør Sca1
Inden for fedme og diabetes, væv fibrose og inflammation spiller en kritisk rolle i udviklingen og vedligeholdelsen af type-2 diabetes 3. For nylig, Tokunaga et al. viste, at Sca1 høje celler isoleret fra lyskebrok (eller subkutan, SQ) og perigonadal (eller visceral, VIS) C57BL6 / J fedtdepoter udviser forskellige gen signaturer og ECM remodellering in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), en prototypisk medlem af membranen-type matrixmetalloproteinase (MMP) familien medierer udviklingen af hvide fedtvæv (WAT) gennem sin kollagenolytisk aktivitet 1.
Eksempler på eksperimenter, der kan udføres med celler isoleret og beriget gennem følgende protokol omfatter tre-dimensionelle kultur, differentiering undersøgelser, collagen nedbrydning analyser, og RNA-sekventering 10,11. Nedbrydning analyser bør foretages med syre ekstraheret kollagen for at sikre bevarelsen af telopeptidet 11,12. Følgende protokol vil vise de metoder til isolering primære vaskulære stromaceller fra forskellige fedtdepoter og berige adipocyt progenitorceller ved anvendelse af immunmagnetisk celleseparation. Gyldigheden af cellen sortering vil blive vurderet med flowcytometri og ved at bruge Sca1-GFP mus, der udtrykker GFP i Sca1 + celler, drevet af en Sca1 promotor 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: The University of Michigan Udvalg for Anvendelse og pleje af dyr (UCUCA) har godkendt alle metoder og protokoller i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr (Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council). Mus holdes i en University of Michigan vivarium og får fri adgang til mad og vand og holdt på en 12 timers mørke / lys-cyklus.
1. Forberedelser
- Forbered primær dyrkningsmedier med DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, og 1x antibiotika / antimykotika. Den bruges til at holde væv i før fordøjelse. Placer lager og alikvot i 37 ºC vandbad.
- Forbered fem milliliter Type III collagenase opløsning ved 5 mg / ml opløst i HBSS (+ Ca, Mg +) for hver type fedt pad isoleres, op til fem mus. For eksempel, når man isolerer SQ og VIS fra en enkelt genotype, gør 10 ml, hvis vildtype og mutant SQ og VIS, gør 20 ml. Indstil pH til 7,4 og steærgre filter. Alikvot i 50 ml rør. Braklægning væk fra lys.
- Bruge 70% ethanol for at desinficere kirurgiske område. Tør og tildækkes med en blå pude. Spray nogle ethanol på den blå pad.
- Brug de 22 G nåle til at pin ned en absorberende pude til styrofoam bord og trim med en saks. Spray puden med ethanol derefter indstille bord på den blå pad og dække med en anden blå pad indtil begyndelsen dissektion.
- Fyld to 50 ml rør med ethanol og anbringes i et stativ ved siden af det kirurgiske område. Placer saks og pincet i ethanol.
- Fyld en anden 50 ml rør med PBS plus 1x anti-anti til skylning ethanol off kirurgiske værktøjer.
- I hætten, label 60 mm skåle for hver vævstype og fyld med dyrkningsmedier opvarmet til 37 ºC. Placer pladerne støder op til det kirurgiske område.
2. Isolering af Subkutan (SQ) fedtpuder
- Afliv mus med en overdosis af isofluran og pneumothorax.
- forsigtigtspray mus med 70% ethanol og lå på ryggen. Pin poterne til skum bord med 22 G kanyler.
- Lav et lille snit i huden på maven. Hold toppen af snittet med pincet, tage saksen og adskille huden fra bughinden.
- Når huden er adskilt fra bughinden fra maven til thorax, afspejler huden væk fra peritoneum fremad mod ved at gøre laterale snit i huden langs siden af kroppen.
- Afspejler den resterende hud holder lyskelymfeknuder fedt væk fra kroppen og pin ned til bestyrelsen med 22 G kanyler.
- Skift til fine saks og pincet. Grab lyskelymfeknuder fedt pad med pincet på oprindelsen nær bughinden og klippe væk mellem huden og lyske fedt fremskridt i retning lysken undgå at forurene SQ med huden.
- Placer direkte sol lyskelymfeknuder fedt pad i den mærkede 60 mm skål.
3. Isolering af Visceral (VIS) Fat Pads
- På lignende måde til trin 2.5, skære peritoneum åben for at blotlægge visceral fedtpuder og tarm.
- Flyt tarmen væk mod brystkassen.
- Grab VIS fedt puden ved den distale ende og træk forsigtigt op. Dissekere ud VIS fedt pad samtidig være omhyggelig med at udelukke epididymis (eller livmoderen, hvis du bruger hunmus) væv.
- Anbring i mærket fad og gentag trin 3.3 for de resterende VIS-pad.
4. Collagenase Fordøjelse af fedtpuder
- Flyt 60 mm retter til vævskultur hætte og aspireres fra medierne.
- Hakke fedt puder med krum saks derefter tilføje til collagenase løsning. Vær sikker på at skylle saks og pincet i mellem vævstyper med ethanol og PBS.
- Ryst ved 300 rpm og 37 ºC i 10-20 min, indtil væv er fordøjet. Det er acceptabelt, hvis nogle stykker af SQ er stadig synlige. Dette vil blive behandlet i et senere trin.
- Tilsættes 25 ml dyrkningsmedier til collagenaseopløsningen at stoppe collagenase behandling, og pipette op og ned 10 gange med en 10 ml serologisk pipette til at dispergere de fordøjede væv.
- Strain-celler under anvendelse af en 100 um cellefilter. Centrifuger i 10 minutter ved 300 x g.
- Forsigtigt dekanteres off medier ikke at forstyrre pellet og tilsættes 5 ml sterilt vand til pellet og forsigtigt pipette til at suspendere celler. Vente 2 minutter for at lysere erythrocytter.
- Tilsættes 25 ml medium med 10% FBS og stamme celler gennem en ny 100 um cellefilter.
- Centrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Dekanteres medier og resuspender pellet i 1 ml kulturmedier.
- Tæl cellerne med et hæmocytometer under anvendelse af 1: 1 trypanblåt.
- Plade 1 x 10 6 celler i en brønd på en plade med 6 brønde.
5. Magnetisk Cell Separation
- Efter omkring 4 til 6 timer af celleadhæsion, skylles cellerne to gange med HBSS (-CA, -Mg). Dissociere adhærente celler under anvendelse 0,05% trypsin. Fortynd trypsin cellesuspension i 1 ml adskillelse buffer og spin for5 minutter ved 300 x g.
- Aspirer supernatanten. Resuspender celler i 500 pi buffer. Fjern en 10 pi alikvot og tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Spin celler i 5 minutter ved 300 x g.
- Aspirer supernatanten fuldstændigt. Resuspender celler i 90 pi buffer. Tilsæt 10 pi anti-Sca1-FITC primære antistof. Bland godt og inkuberes i 10 minutter ved 4 ºC i mørke.
- Vask cellerne med 1 ml buffer og centrifuger cellerne i 5 minutter ved 300 x g. Fjern supernatanten fuldstændigt.
- Resuspender celler i 80 pi buffer. Tilsæt 20 pi anti-FITC mikroperler. Bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 4 ºC i mørke.
- Vask cellerne med 1 ml buffer og centrifuger cellerne i 5 minutter ved 300 x g.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet i 500 pi puffer.
- Placer kolonne i magnetholder og skyl kolonne med 500 pi buffer.
- Tilføj cellesuspension til kolonne. Undgå bobler mens pipettering.
- Saml den umærkede Sca1 - </ Sup> celler og vaske søjle 3 gange med 500 pi buffer. Tilføj kun ny buffer, når reservoiret er tom. Undgå bobler mens pipettering.
- Fjern kolonne fra den magnetiske holder og anbringes i et 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 1 ml buffer til søjle og eluere Sca1 + ved at skubbe leveres stemplet gennem søjlen reservoir.
- Spin ned cellefraktioner i 5 minutter ved 300 x g. Resuspender celler i 1 ml kulturmedier.
- Fjern en 10 pi alikvot fra de mærkede og umærkede fraktioner og tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Plate hver celle fraktion i 1 brønd i en 6-brønds plade.
6. Verifikation af Immunomagnetisk Adskillelse af Sca1 høj ACSS med flowcytometri
- Skyl celler to gange med HBSS (-CA, -Mg) og dissociere celler under anvendelse 0,05% trypsin.
- Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter. Resuspender cellerne i 1 ml dyrkningsmedier og tælle anvendelse af et hæmocytometer.
- Opnå> 10 6
- Fjern supernatanten og gentag trin 6.3 to gange mere.
- Resuspender cellerne med 1 ml 2% gedeserum + 2% BSA og blokere i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter.
- Fjern blokeringsopløsning.
- Tilføj rotte IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 ug, 1: 400) eller anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 ug, 1: 400), i 100 pi PBS med 2% gedeserum og 2% BSA + PBS ved 4 ° C i 30 minutter i mørke.
- Der tilsættes 1 ml kold PBS til cellerne. Centrifuger 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og gentag trin 6.9 to gange mere.
- Resuspender cellerne i 1 ml PBS. Pass cellesuspensioner gennem en 100 um cellefilter i forberedelse til flowcytometrisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Berigelse af Sca1 høje ASC'er fra forskellige Fat Pads.
De vaskulære stromale celler isoleret fra SQ fedt display fibroblastlignende, strakte celleform uanset Sca1 ekspressionsniveau (figur 1A). På den anden side, VIS (eWAT-afledt) Sca1 høj og Sca1 lave celler demonstrerer tydelig forskel i deres celleform. Ligesom SQ (iWAT-afledte) Sca1 høje celler, VIS (eWAT-afledt) Sca1 høje celler display strakt, fibroblast-lignende celle form, mens VIS Sca1 lave celler demonstrerer epithelioid form. Sca1 høje celler isoleret fra Sca1-GFP mus identificeres let som GFP-positive celler i vævskultur (figur 1B). Når disse celler blev vurderet med flowcytometri, blev de fleste af de GFP-positive celler bekræftet at udtrykke Sca1 proteiner på celleoverfladen som påvises med etTI-Sca1 antistof (figur 1C). Sca1 høje celler afledt fra lyske- fedtpude opretholde øget kapacitet af adipocytdifferentiering henviser eWAT-afledte Sca1 høje celler er vanskeligere at differentiere til adipocyt med konventionel adipogeniske mix 10.
Fat Depot-afhængig genekspression af Sca1 høje ASC'er (figur 2).
Genom-dækkende transkriptom analyser med RNA-sekventering viste berigelse af gener relateret til ekstracellulære matrix proteiner og modifikatorer (GO: 0.031.012, GO: 0.005.578) i disse Sca1 høje ASC'er 10. Kombineret med real-time PCR-analyser, var vi i stand til at vise forskellen udtryk for collagenolytiske MMP (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) mellem iWAT- og eWAT-afledt Sca1 høje ASC'er. Når fluoresceinmærket type I collagen geler blev anvendt t o vurdere pericellulært nedbrydning aktivitet, vi observerede den markant øgede kollagen remodeling aktivitet medieret af VIS Sca1 høje ASC'er 10.
Figur 1: Immunomagnetisk Adskillelse af murine Sca1 høje ASC'er fra forskellige fedtdepoter (A) Sca1 høje og Sca1 lave ASC'er isoleret fra SQ (iWAT) og VIS (eWAT).. Scale = 100 um. (B) Sca1-GFP celler isoleret fra iWAT af Sca-GFP-mus. Scale = 100 um. (C) celleoverfladeekspression af Sca1 i Sca1-GFP-positive celler vurderet med flowcytometri. (Venstre) kontrol rotte IgG (højre) anti-Sca1 antistof. X-aksen, GFP intensitet. Y-aksen, Alexa-Fluor 647. Panel A tidligere vist i Tokunaga, M. et al., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Fat Depot-afhængig ekspression af kollagenolytisk MMP'er, TIMP'er, og Collagener (A) Differentiel genekspression af ECM'er og ECM modifikatorer i Sca1 høje ASC'er isoleret fra forskellige fedtdepoter. (B) Øget kollagen nedbrydning aktivitet af VIS (eWAT-afledt) Sca1 høje ASC'er. Nedbrydning af collagen er vist som forsvinden af fluorescerende signaler (pile og pilespidser). Indsat er et forstørret billede af fokuseret collagen nedbrydning medieret af individuel celle i SQ ASC'er. Celler blev dyrket i 72 timer. Data, der tidligere er vist i Tokunaga, M. et al., (2014). Klik her for at view en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri vi demonstrere isolation og immunomagnetisk celle adskillelse af murine ASC'er fra forskellige fedtpuder og deres anvendelse til in vitro-forsøg. I denne procedure er effektiv til hurtig isolering af store antal Sca1-positive ASC'er, hvilket er fordelagtigt over teknisk komplicerede og dyre FACS-medieret isolering af ASC'er 9,14. I modsætning FACS, er immunomagnetisk celleseparation ikke tillade anvendelse af multiple antigen til identifikation af en målcellepopulation. Men hvis overfladeantigenet er velkarakteriseret, brug af immunomagnetisk separation forøger antallet af celler, der skal analyseres uden henvisning til brugen af FACS udstyr 15, som stadig ikke er let tilgængelig for mange biologiske forskere på små institutter uden core faciliteter .
Der er nogle kritiske aspekter af proceduren, der skal overholdes for at sikre et vellykket resultat. Indkøb af ADIPose-afledte stamceller kræver kirurgisk isolering af muse fedtvæv depoter. Derfor er hastigheden og nøjagtigheden af væv hentning er bydende nødvendigt at give et højt antal levedygtige celler. Derudover vedligeholdelse af rene kirurgiske områder og instrumenter er afgørende for udfaldet af proceduren ved at forhindre mikrobiel kontaminering af celle- og vævsprøver. Dissekerede fedtvæv skal enzymatisk dissocieret i et type II collagenase opløsning. ECM sammensætning varierer mellem SQ og VIS fedtpuder 10,16, hvor VIS indeholder færre kollagener end SQ. Følgelig varigheden af VIS fedtpude fordøjelse kræver omtrent halvdelen af mængden af tid som SQ. Det er acceptabelt at stoppe vævsfordøjelse efter den angivne inkubationsperiode selvom små partikler af væv er stadig til stede i collagenaseopløsningen. Disse stykker kan være mekanisk dissocieret med pipettering når dyrkningsmedier er blevet tilføjet for at inhibere collagenase aktivitet. Mens det er muligt at fortsættedirekte til immunomagnetisk sortering efter SVF isolation, vores gruppe frø 1 x 10 6 usorterede celler på plastplader for omkring 4 til 6 timer, før du fortsætter med celle sortering. På trods af flere filtreringstrin under SVF vil isoleret snavs stadig være til stede i den celle suspension. Udpladning af cellerne før der fortsættes med immunomagnetisk celleseparation giver mulighed for at vaske snavs og ubundne celler væk, således at magnetisk sortering til kun anvendes på adhærente celler, der indeholder adipogeniske progenitorceller.
Mens Sca1 ikke findes i humane genom, identifikation og validering af alternative celleoverfladeantigener udtrykt på fedt depot-afhængige humane fedtvæv stamceller 17, når kombineret med denne celle adskillelse teknik, kan hjælpe os til at definere biologi menneskelige fedt stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH DK095137 (til THC). Vi takker de nuværende og tidligere lab medlemmer der har bidraget til udviklingen og kvaliteten af de beskrevne metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
