Introduction
Stamcells antigen en (Sca1 eller Ly6A / E) först identifierades som en cellyta markör som uttrycks av hematopoetiska och mesenkymala stamceller 5,6. Den stromala kärlfraktionen (SVF) av fettvävnad erhållen från mus fettdepåer är en heterogen population av celler som består av fibroblaster, makrofager, vaskulära endotelceller, nervceller och fettceller progenitorceller 7. Adipocyt progenitorceller, eller adipösa-härledda stamceller (ASC: er) är icke-lipid-laden celler som uppehåller sig i det kollagenrika perivaskulära extracellulär matrix (ECM) 8. Cirka 50% av den SVF bestå av ASC: er, som karaktäriseras som lineage-negativ (Lin -) och CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. De flesta av dessa celler är Sca1 +: CD24 - adipocyt stamceller, vilka har förmåga att adipocytdifferentiering in vitro; dock endast en bråkdel av celler (0,08% av SVF) utgör Sca1
När det gäller fetma och diabetes, vävnadsfibros och inflammation spelar en avgörande roll i utvecklingen och underhållet av typ-2-diabetes tre. Nyligen Tokunaga et al. visade att Sca1 höga celler isolerade från ljumsk (eller subkutan, SQ) och perigonadal (eller visceral, VIS) C57BL6 / J fettdepåer uppvisar olika gen signaturer och ECM remodeling in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), en proto medlem av membran typ matrismetalloproteinas (MMP) familjen förmedlar utvecklingen av vit fettvävnad (WAT) genom dess kollagenolytisk aktivitet 1.
Exempel på experiment som kan utföras med celler som isolerats och berikas genom följande protokoll inkluderar tredimensionella kultur, differentieringsstudier, kollagen nedbrytningsanalyser, och RNA-sekvensering 10,11. Nedbrytnings analyser bör utföras med syraextraherat kollagen för att säkerställa bevarandet av telopeptiden 11,12. Följande protokoll kommer att visa metoder för att isolera primära vaskulära stromaceller från olika fettdepåer och berika fettceller progenitorceller med hjälp av immunmagnetisk cellseparation. Giltigheten av cellsortering kommer att bedömas med flödescytometri och genom att använda Sca1-GFP möss som uttrycker GFP i Sca1 + celler, som drivs av en Sca1 promotor 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: The University of Michigan utskottet för användning och skötsel av djur (UCUCA) godkänner samtliga metoder och protokoll i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur (Institutet för försöksdjurs Research, National Research Council). Möss hålls i en University of Michigan vivarium och ges fri tillgång till mat och vatten och hölls på en 12 h mörker / ljuscykel.
1. Förberedelser
- Förbereda primära odlingsmedier med DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G, och 1x antibiotika / antimykotika. Detta kommer att användas för att hålla vävnader innan matsmältning. Placera lager och delprov i 37 ° C vattenbad.
- Bered fem milliliter av typ III kollagenaslösning vid 5 mg / ml upplöst i HBSS (+ Ca, + Mg) för varje typ av fett pad att isoleras, upp till fem möss. Till exempel, vid isolering SQ och VIS från en enda genotyp, göra 10 ml, om vildtyp och mutant SQ och VIS, göra 20 ml. Justera pH till 7,4 och sterile filter. Alikvotera i 50 ml rör. Avsätt borta från ljus.
- Använd 70% etanol för att desinficera kirurgiska området. Torka och täck med en blå rondell. Spraya lite etanol på den blå pad.
- Använd de 22 G nålar för att sätta fingret på en absorberande dyna till frigolit ombord och trimma med sax. Spraya plattan med etanol sedan in kortet på den blå pad och täck med en annan blå pad tills början dissektion.
- Fyll två 50 ml rör med etanol och plats i en monter i anslutning till det kirurgiska området. Placera sax och pincett i etanolen.
- Fyll ytterligare 50 ml rör med PBS plus 1x anti-anti för att skölja etanol av kirurgiska instrument.
- I huven, etikett 60 mm rätter för varje vävnadstyp och fyll med odlingsmedia värmas till 37 ° C. Placera plattorna intill det kirurgiska området.
2. Isolering av subkutan (SQ) fettkuddar
- Euthanize musen med en överdos av isofluran och pneumothorax.
- FörsiktigtSpraya mus med 70% etanol och låg på rygg. Nåla tassarna till skum ombord med 22 G nålar.
- Göra ett litet snitt i huden på nedre delen av magen. Håll toppen av snittet med pincett, ta saxen och separera huden från bukhinnan.
- När huden är separerat från bukhinnan från buken på bröstkorgen, reflektera huden bort från peritoneum mot huvudet genom att göra laterala snitt i huden längs sidan av kroppen.
- Reflektera den återstående huden håller inguinal fett från kroppen och hålla fast i styrelsen med 22 G nålar.
- Växla till fina sax och pincett. Ta inguinal fettkudden med pincetten i origo nära bukhinnan och klipp bort mellan huden och inguinal fett framsteg mot ljumsken undvika att förorena SQ med huden.
- Placera för solljus inguinal fettkudden i den märkta 60 mm skål.
3. Isolering av Visceral (VIS) fettkuddar
- På ett liknande sätt till steg 2,5, skär bukhinnan öppen för att exponera den viscerala fettkuddar och tarmen.
- Flytta tarmen bort mot bröstkorgen.
- Greppa VIS fettkudden vid den distala änden och dra upp försiktigt. Dissekera ut VIS fettkudden samtidigt som noga med att utesluta epididymal (eller livmoder, om du använder honmöss) vävnad.
- Placera i märkta skålen och upprepar steg 3,3 för den återstående VIS pad.
4. kollagenasdigestion av fettkuddar
- Flytta 60 mm rätter till vävnadsodling huven och aspirera bort media.
- Finhacka fettkuddar med böjd sax sedan lägga till kollagenas lösning. Var noga med att skölja sax och pincett i mellan vävnadstyper med etanol och PBS.
- Skaka vid 300 rpm och 37 ° C i 10-20 min tills vävnaderna smälts. Det är acceptabelt om vissa delar av SQ är fortfarande synliga. Detta kommer att behandlas i ett senare steg.
- Tillsätt 25 ml av odlingsmedia till den kollagenaslösning för att stoppa collagenase behandling, och pipettera upp och ner 10 gånger med en 10 ml serologisk pipett för att dispergera de spjälkade vävnader.
- Stam-celler med användning av en 100 | j, m cellfilter. Centrifugera i 10 min vid 300 x g.
- Dekantera försiktigt bort media att inte störa pelleten och tillsätt 5 ml sterilt vatten till pelleten och försiktigt pipett att avbryta celler. Vänta 2 min för att lysera erytrocyter.
- Tillsätt 25 ml av media med 10% FBS och stam celler genom en ny 100 ìm cell sil.
- Centrifugera i 10 min vid 300 x g. Dekantera media och återsuspendera pelleten i 1 ml odlingsmedia.
- Räkna celler med en hemocytometer med användning av 1: 1 trypanblått.
- Plate 1 x 10 6 celler i en brunn på en 6-brunnsplatta.
5. Magnet Cell Separation
- Efter omkring 4 till 6 h av cellvidhäftning, skölj cellerna två gånger med HBSS (-Ca, -Mg). Dissociera adherenta celler med användning av 0,05% trypsin. Späd trypsin cellsuspensionen i en ml separationsbuffert och snurra för5 min vid 300 x g.
- Aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i 500 ^ il buffert. Ta en 10 pl alikvot och räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Spin celler för 5 min vid 300 x g.
- Aspirera supernatanten fullständigt. Resuspendera cellerna i 90 ^ il buffert. Tillsätt 10 | il anti-Sca1-FITC primära antikroppen. Blanda väl och inkubera under 10 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna med 1 ml buffert och centrifugera celler för 5 min vid 300 x g. Avlägsna supernatanten fullständigt.
- Resuspendera cellerna i 80 ^ il buffert. Tillsätt 20 pl anti-FITC mikropärlor. Blanda väl och inkubera under 15 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna med 1 ml buffert och centrifugera celler för 5 min vid 300 x g.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 l buffert.
- Placera kolumn i den magnetiska hållaren och skölj kolonnen med 500 pl buffert.
- Lägg cellsuspensionen till kolumn. Undvika bubblor medan pipettering.
- Samla omärkta Sca1 - </ Sup> celler och tvätta kolumn 3 gånger med 500 ul buffert. Bara lägga till nya buffert när behållaren är tom. Undvika bubblor medan pipettering.
- Ta kolumn från den magnetiska hållaren och placera i en 15 ml koniska rör.
- Tillsätt 1 ml buffert till kolonnen och eluera Sca1 + genom att trycka levereras kolven genom kolonnen reservoaren.
- Centrifugera ner cellfraktioner under 5 minuter vid 300 x g. Resuspendera cellerna i 1 ml odlingsmedia.
- Ta en 10 pl alikvot från de märkta och omärkta fraktioner och räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Tallrik varje cellfraktion i en brunn i en 6-brunnsplatta.
6. Kontroll av immunomagnetiska Separation av Sca1 hög ACS med flödescytometri
- Skölj cellerna två gånger med HBSS (-Ca, Mg) och separera celler med hjälp av 0,05% trypsin.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min. Resuspendera celler i en ml odlingsmedia och räkna med en hemocytometer.
- Erhålla> 10 6
- Avlägsna supernatanten och upprepa steg 6,3 två gånger.
- Återsuspendera cellerna med 1 ml av 2% getserum + 2% BSA och blockera under 30 min vid RT.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min.
- Avlägsna blockeringslösning.
- Lägg råtta IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 mikrogram, 1: 400) eller anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 mikrogram, 1: 400), i 100 pl PBS med 2% getserum och 2% BSA + PBS vid 4 ° C under 30 min i mörker.
- Tillsätt 1 ml kall PBS till cellerna. Centrifugera 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och upprepa steg 6,9 två gånger.
- Resuspendera cellerna i 1 ml PBS. Pass cellsuspensioner genom en 100 ìm cell sil i förberedelse för flödescytometrisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anrikning av Sca1 höga DSK: er från olika fettkuddarna.
De vaskulära stromala celler som isolerats från SQ fett display fibroblast-liknande, sträcks cellform oavsett Sca1 expressionsnivån (Figur 1A). Å andra sidan, VIS (eWAT-härledda) Sca1 hög och Sca1 låga celler demonstrerar distinkt skillnad i deras cellform. Liksom SQ (iWAT-härledda) Sca1 höga celler, VIS (eWAT-härledda) Sca1 höga celler visa sträckt, fibroblastliknande cellform, medan VIS Sca1 låga celler visar epithelioid form. Sca1 hög celler isolerade från Sca1-GFP möss lätt identifieras som GFP-positiva celler i vävnadskultur (Figur 1B). När dessa celler bedömdes med flödescytometri, de flesta av de GFP-positiva celler bekräftades att uttrycka Sca1 proteiner på cellytan såsom detekteras med Anti-Sca1 antikropp (Figur 1C). Sca1 höga celler härledda från inguinal fettkudden upprätthåller ökad kapacitet av adipocytdifferentiering medan eWAT härledda Sca1 höga celler är svårare att differentiera till adipocyt med konventionell adipogena mix 10.
Fett Depot-beroende genuttryck av Sca1 höga ASC: er (Figur 2).
Genomvid transkriptom analyser med RNA-sekvensering visade anrikning av gener relaterade till extracellulära matrixproteiner och modifierings (GO: 0.031.012, GO: 0.005.578) i de Sca1 höga DSK: er 10. Tillsammans med realtids-PCR-analyser, kunde vi visa det differentiella uttrycket av kollagenolytiska MMP (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) mellan iWAT- och eWAT härrörande Sca1 höga DSK: er. När fluoresceinmärkt typ I kollagen geler användes t o bedöma pericellulär aktivitet nedbrytning, observerade vi markant ökad kollagen ombyggnad aktivitet förmedlas av VIS Sca1 höga DSK: er 10.
Figur 1: immunomagnetiska Separation av Murine Sca1 höga DSK från olika fettdepåerna (A) Sca1 höga och Sca1 låga DSK: er isolerade från SQ (iWAT) och VIS (eWAT).. Skala = 100 nm. (B) Sca1-GFP celler som isolerats från iWAT av Sca-GFP möss. Skala = 100 nm. (C) Cellyteexpression av Sca1 i Sca1-GFP-positiva celler bedöms med flödescytometri. (Vänster) kontrollråtta IgG (höger) anti-Sca1 antikropp. X-axeln, GFP intensitet. Y-axeln, Alexa-Fluor 647. Panel A som visas tidigare i Tokunaga, M. et al., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Fat Depot-beroende uttryck av kollagenolytisk MMP, TIMP, och Kollagener (A) Diff genuttrycket av ECM och ECM modifierings i Sca1 höga DSK: er isolerade från olika fettdepåer. (B) Ökad kollagen aktivitet VIS nedbrytning (eWAT-härledda) Sca1 höga DSK: er. Nedbrytning av kollagen visas som försvinnandet av fluorescenssignaler (pilar och pilspetsar). Infälld är en förstorad bild av fokuserade kollagennedbrytning förmedlad genom individuell cell i SQ ASC: er. Cellerna odlades under 72 timmar. Data visade tidigare i Tokunaga, M. et al., (2014). Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri visar vi isolering och immunmagnetisk cellseparation av murina DSK: er från olika fettkuddar och deras användning för in vitro-experiment. Denna metod är effektiv för snabb isolering av stora antalet Sca1 positiva DSKer, vilket är fördelaktigt över den tekniskt komplicerade och dyra FACS-medierad isolering av ASC: er 9,14. Till skillnad från FACS, betyder immunomagnetisk cellseparation inte tillåta användning av multipel antigen för identifieringen av en målcellpopulation. Men om ytantigen är väl kännetecknas ökar antalet celler som skall analyseras utan att förlita sig på användningen av FACS utrustning 15, som fortfarande inte är lätt åtkomlig för många biologiska forskare vid små institut utan kärnanläggningar användning av immunmagnetisk separation .
Det finns vissa kritiska aspekter av förfarandet som måste följas för att säkerställa ett framgångsrikt resultat. Upphandlingen av ADIPose-härledda stamceller kräver den kirurgiska isolering av mus-fettvävnads depåer. Därför är den hastighet och precision av vävnad hämtning absolut nödvändigt för att ge ett högt antal livsdugliga celler. Dessutom, upprätthållandet av rena kirurgiska områden och instrument är avgörande för resultatet av förfarandet genom att förhindra mikrobiell kontaminering av cell- och vävnadsprover. Dissekerade fettvävnad måste enzymatiskt dissocierade i en typ II kollagenas lösning. ECM sammansättning skiljer sig mellan SQ och VIS fettkuddar 10,16, där VIS innehåller mindre gener än SQ. Därför varaktigheten av VIS fettkudden matsmältningen kräver ungefär hälften av tiden som SQ. Det är acceptabelt att sluta vävnad matsmältningen efter den angivna inkubationstiden även om små partiklar av vävnad som fortfarande finns kvar i kollagenas lösning. Dessa bitar kan dissocierades mekaniskt med pipettera när odlingsmedium har lagts för att hämma kollagenas-aktivitet. Även om det är möjligt att gå vidaredirekt till immunmagnetisk sortering efter SVF isolering vår grupp frön 1 x 10 6 osorterade celler på plastplattor för ca 4-6 timmar innan du fortsätter med cellsortering. Trots flera filtreringssteg under SVF isolering, kommer skräp finnas kvar inom cellsuspensionen. Plätering cellerna innan man immunmagnetisk cellseparation ger en möjlighet att tvätta skräp och obundna celler bort, vilket gör magnetisk sortering endast tillämpas på vidhäftande celler som innehåller adipogena progenitorceller.
Medan Sca1 inte finns i människans arvsmassa, identifiering och validering av alternativa cellyteantigener som uttrycks på fettdepåberoende human adipose stamceller 17, när den kombineras med denna cellseparationsteknik, kan hjälpa oss att definiera biologi mänskliga adipose stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH DK095137 (THC). Vi tackar nuvarande och tidigare lab medlemmar som bidragit till utvecklingen och förfining av de beskrivna metoderna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
