Introduction
細胞抗原1（のSca1、またはLy6A / E）の幹第造血および間葉系幹細胞5,6によって発現される細胞表面マーカーとして同定されました。マウス脂肪デポから得られた脂肪組織の間質の血管画分（SVF）は、線維芽細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、神経細胞、および脂肪細胞前駆細胞の7を含む細胞の異種集団です。脂肪細胞の前駆細胞、または脂肪由来幹細胞（ASCには）、コラーゲンが豊富な血管周囲の細胞外マトリックス（ECM）8内に存在する非脂質を含んだ細胞です。 CD34 +：のSca1 + 9とCD29 + -約SVFの50％は、系統陰性（林）として特徴付けられるのASC、から構成されています。 ; in vitroでの脂肪細胞分化が可能である脂肪細胞前駆細胞、 - CD24：これらの細胞のほとんどはのSca1 +ですしかし、細胞の一部のみ（SVFの0.08％）がのSca1を構成します
肥満および糖尿病の分野では、組織線維症及び炎症が2型糖尿病3の発達および維持において重要な役割を果たしています。最近、徳永ら 。 （VIS、または内臓）鼠径部（または皮下、SQ）およびperigonadal C57BL6 / J脂肪デポから分離されたのSca1 high細胞は、in vitro 10 で異なる遺伝子署名およびECMリモデリングを示すことが示されました。 MMP14（MT1-MMP）、膜 - トンの原型メンバーYPEマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）ファミリーは、コラーゲン分解活性の1を介して、白色脂肪組織（WAT）の開発を仲介します。
以下のプロトコルを使用して単離され、濃縮された細胞を用いて行ってもよいの実験例は、三次元培養、分化研究、コラーゲン分解アッセイ、およびRNA配列10,11を含みます。分解アッセイは、テロペプチド11,12の保全を確実にするために、酸抽出コラーゲンで行われるべきです。次のプロトコルが異なる脂肪デポからの一次血管間質細胞を分離し、免疫磁気細胞分離を用いて、脂肪細胞の前駆細胞を豊かにする方法を紹介します。細胞選別の有効性は、フローサイトメトリーを用いてとのSca1プロモーター 13によって駆動されるのSca1 +細胞においてGFPを発現するのSca1-GFPマウスを用いによって評価されます。
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Protocol
倫理声明：動物の使用およびケアに関するミシガン大学委員会（UCUCA）は、実験動物の管理と使用に関する指針（実験動物研究所、国家研究評議会）に従い、すべての方法およびプロトコルを承認しました。マウスは、ミシガン大学の飼育に維持され、食料と水を自由に与え、12時間の明/暗サイクルで維持されています。
1.準備
- DMEM、10％FBS、1×P / S / G、および1×抗生物質/抗真菌剤で初代培養培地を準備します。これは、消化の前に組織を維持するために使用されます。 37ºCの水浴中にストックし、アリコートを置きます。
- 5匹までの、単離される脂肪パッドの種類ごとにHBSS（+カルシウム、+ Mg）を中に溶解させミリリットルの5mg /でタイプIIIコラゲナーゼ溶液の5ミリリットルを準備します。 10ミリリットルを作る、単一の遺伝子型からSQとVISを分離する際に、例えば、野生型および変異体SQとVIS場合、20ミリリットルを作ります。 7.4およびSTEにpHを調整しますフィルタを波立たせます。 50ミリリットルチューブに小分けし。光を避けて脇に置きます。
- 手術野を消毒するために70％エタノールを使用してください。拭うと青のパッドでカバーしています。青いパッドの上にいくつかのエタノールをスプレーしてください。
- 発泡スチロールの板に吸収パッドを突き止めるし、はさみでトリミングするために22 G針を使用してください。青いパッドの上にボードを設定し、解剖を開始するまで、別の青色のパッドでカバーした後、エタノールでパッドをスプレーします。
- 手術野に隣接するスタンドにエタノールと場所を持つ2つの50mlチューブを埋めます。エタノールにハサミやピンセットを置きます。
- 手術器具をエタノールを洗い流すためにPBSプラス1×抗抗持つ別の50ミリリットルチューブを埋めます。
- フードでは、各組織型のラベル60ミリメートルの料理とは、37ºCに温めた培養培地で満たします。手術領域に隣接するプレートを置きます。
皮下（SQ）脂肪パッドの2の単離
- イソフルランおよび気胸の過剰投与によりマウスを安楽死させます。
- 優しく70％エタノールでマウスをスプレーし、仰臥位横たわっていました。 22 G針で発泡ボードに足をピン。
- 下腹部の皮膚の小さなカットを行います。鉗子でカットの上部を持ち、はさみを取り、腹膜から皮膚を分離します。
- 皮膚が胸部に腹部から腹膜から分離された後、本体の側面に沿って皮膚の横カットを行うことで、離れて頭に向かって腹膜から肌を反映しています。
- 体から離れ鼠径部脂肪を保持し、残りの皮膚を反映し、22 G針でボードに突き止めます。
- 細かいハサミやピンセットに切り替えます。腹膜の近くに原点にピンセットで鼠径部脂肪パッドをつかみ、皮膚とのSQを汚染回避鼠径部に向かって進行し、皮膚や鼠径部脂肪の間離れてスニップ。
- ラベルされた60ミリメートル皿にばらばら鼠径部脂肪パッドを配置します。
内臓（VIS）脂肪パッドの3分離
- 2.5ステップと同様に、内臓脂肪パッドおよび腸を露出させる開放腹膜を切りました。
- 胸部に向かって腸を離れて移動します。
- 遠位端にVIS脂肪パッドをつかみ、ゆっくりと引き上げます。組織（雌マウスを使用している場合、または子宮）精巣上体を除外するように注意しながらVIS脂肪パッドを解剖。
- ラベルされた皿、残りVISパッドの繰り返しステップ3.3で配置します。
脂肪パッドの4コラゲナーゼ消化
- 組織培養フードに60ミリメートルの皿を移動し、メディアを吸引します。
- 湾曲したハサミで脂肪パッドをミンチ後、コラゲナーゼ溶液に追加します。エタノールおよびPBSで組織タイプの間にはさみとピンセットを洗浄してください。
- 組織が消化されるまで、300 rpmで10〜20分間、37ºCで振ります。 SQのいくつかの作品がまだ表示されている場合は、許容可能です。これは、後の手順で対処します。
- collagを停止するためにコラゲナーゼ溶液を培地25 mlを加え消化された組織を分散させるために10ミリリットルの血清学的ピペットを用いenase処理、ピペットを上下に10回。
- 100μmの細胞ストレーナーを用いて株細胞。 300×gで10分間遠心分離します。
- 慎重にペレットを乱さし、細胞を懸濁するペレットと静かにピペットに滅菌水5ミリリットルを追加していないメディアをオフにデカント。赤血球を溶解するために2分を待ちます。
- 新しい100μmのセルストレーナーを介して、10％FBSおよび株細胞と培地25ミリリットルを追加します。
- 300×gで10分間遠心分離します。デカントメディアと培養培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し。
- 1トリパンブルー：1を用いて、血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 6ウェルプレートに1ウェル内のプレート1×10 6個の細胞。
5.磁気細胞分離
- 細胞接着の約4~6時間後、HBSS（-Ca、-Mg）で細胞を2回洗浄します。 0.05％トリプシンを用いて接着細胞を解離します。 1mLの分離緩衝液中でトリプシン細胞懸濁液を希釈し、は回転300×gで5分間。
- 上清を吸引。 500μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し。 10μlのアリコートを削除し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。
- 300×gで5分間スピン細胞。
- 完全に上清を吸引。 90μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し。 10μlの抗のSca1-FITC一次抗体を追加します。よく混ぜ、暗所で4ºCで10分間インキュベートします。
- mlのバッファーと遠心セル300×gで5分間1で細胞を洗浄。完全に上清を取り除きます。
- 80μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し。 20μlの抗FITCマイクロビーズを追加します。よく混ぜ、暗所で4ºCで15分間インキュベートします。
- mlのバッファーと遠心セル300×gで5分間1で細胞を洗浄。
- 上清を除去し、500μlの緩衝液中にペレットを再懸濁。
- 磁気ホルダーに列を配置し、500μlの緩衝液でカラムをすすぎます。
- カラムに細胞懸濁液を追加します。ピペッティングしながら気泡を避けてください。
- 非標識のSca1を収集- </ SUP>細胞および500μlの緩衝液でカラム3回洗浄します。リザーバが空である場合にのみ、新しいバッファを追加します。ピペッティングしながら気泡を避けてください。
- 磁気ホルダーから列を削除し、15ミリリットルコニカルチューブに配置します。
- 列にバッファリングし、カラムリザーバーを介して供給されるプランジャーを押してのSca1の+を溶出1ミリリットルを追加します。
- 300×gで5分間、細胞画分をスピンダウン。 1mLの培地中に再懸濁した細胞。
- 標識し、非標識画分から10μlのアリコートを削除し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。
- プレート6ウェルプレートの1ウェル中の各細胞画分。
フローサイトメトリーでのSca1 高のACSの免疫磁気分離の6.検証
- HBSS（-Ca、-Mg）で2回細胞を洗浄し、0.05％トリプシンを用いて細胞を解離します。
- 5分間、300×gで遠心分離した細胞。 1ミリリットル培養培地中で細胞を再懸濁し、血球計数器を用いてカウントします。
- 入手> 10 6
- さらに2回上清を除去し、ステップ6.3を繰り返します。
- 2％ヤギ血清+ RTで30分間、2％BSA及びブロック1mlで再懸濁細胞。
- 5分間、300×gで遠心分離した細胞。
- ブロッキング溶液を除去します。
- 4℃で2％ヤギ血清および2％BSA + PBSで100μlのPBS中で、：または抗のSca1アレクサフルオロ647（4000.25μgの、1）：ラットIgG2aのアレクサフルオロ647（4000.25μgの、1）を追加します。暗所で30分間。
- 細胞に冷PBSの1ミリリットルを追加します。 4°Cで5分間遠心分離300×gで。
- さらに2回上清を除去し、ステップ6.9を繰り返します。
- 1mlのPBSで細胞を再懸濁し。フローサイトメトリー分析の準備のために100μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡します。
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Representative Results
別の脂肪パッドからのSca1 高のASCの濃縮。
SQ脂肪表示線維芽細胞などから単離された血管間質細胞は、関係なくのSca1の発現レベル（ 図1A）のセル形状を伸ばしました。一方、VIS（eWAT由来）のSca1 高いとのSca1 低細胞は、その細胞形状の明確な違いを示しています。 SQのように（IWAT由来）のSca1 high細胞、VIS（eWAT由来）のSca1 high細胞は、VISのSca1 低い細胞に対し、延伸し、線維芽細胞様細胞形状を表示する類上皮形状を示しています。 SCA1-GFPマウスから単離したSCA1 高い細胞は容易に組織培養（ 図1B）におけるGFP陽性細胞として同定されます。これらの細胞をフローサイトメトリーで評価した場合、ANと検出され、GFP陽性細胞の大部分は、細胞表面上のSca1タンパク質を発現することが確認されましたTI-のSca1抗体（ 図1C）。 eWAT由来のSca1 high細胞は、従来の脂肪生成ミックス10で脂肪細胞に分化することがより困難であるのに対し、鼠径部脂肪パッド由来のSca1 high細胞は、脂肪細胞分化の増加能力を維持します。
Sca1 高のASCの脂肪デポ依存性遺伝子発現（ 図2）。
10それらのSca1 高のASCでRNAの塩基配列決定は、（0005578：0031012を、GO GO）は、細胞外マトリックスタンパク質と修飾に関連する遺伝子の濃縮を実証してゲノムワイドなトランスクリプトーム解析します。 PCR分析リアルタイムと相まって、我々は、コラーゲンのMMP（MMP2、MMP8、MMP13、MMP14）iWAT-との間eWAT由来のSca1 高のASCの示差的な発現を実証することができました。フルオレセイン標識されたI型コラーゲンゲルは、Tを用いた場合 O細胞周囲の分解活性を評価し、我々はVISのSca1 高い ASCは10によって媒介される顕著に増加したコラーゲンリモデリングの活動を観察しました。
図1： 異なる脂肪デポから ネズミのSca1 高 のASC の免疫磁気分離 SQ（IWAT）とVIS（eWAT）から単離された（A）のSca1 高いとのSca1 ローのASC。スケール=100μmです。 （B）SCA-GFPマウスのIWATから単離したのSca1-GFP細胞。スケール=100μmです。 （C）フローサイトメトリーで評価のSca1-GFP陽性細胞中のSca1の細胞表面発現。 （左）コントロールラットIgG（右）抗のSca1抗体。 X軸、GFP強度。 Y軸、アレクサ・フルーア647パネルA徳永、M. らに先に示した。、（2014）。ig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：異なる脂肪デポから分離されたのSca1 高のASCでのECMのコラーゲン分解のMMP、TIMPの、およびコラーゲンの脂肪デポ依存的発現 （A）差動遺伝子発現とECM修飾子。 （B）VIS（eWAT由来）のSca1 高のASCのコラーゲン分解活性を増加しました。コラーゲンの分解は、蛍光シグナル（矢印および矢じり）の消失として示されています。挿入図は、SQのASCでの個々の細胞によって媒介される焦点を当てたコラーゲン分解の拡大画像です。細胞を72時間培養しました。徳永、M. らに以前に示されたデータ。、（2014）。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。
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Discussion
ここで我々は分離と異なる脂肪パッドからマウスのASCの免疫細胞分離およびin vitro実験のためのそれらの使用を実証します。提示された方法は、ASCを9,14の技術的に複雑で高価なFACS媒介分離よりも有利で あるのSca1陽性のASCの多数の迅速な隔離のために有効です。 FACSは異なり、免疫細胞の分離は、標的細胞集団を同定するための多数の抗原の使用を許可しません。表面抗原は、十分に特徴づけされている場合はそれにもかかわらず、免疫磁気分離の使用は中核施設なしまだ小さい機関で多くの生物学的研究者に容易にアクセスすることはできませんFACS機器15の使用に頼ることなく、分析される細胞の数が増加します。
成功した結果を確実にするために観察しなければならない手順のいくつかの重要な側面があります。 ADIPの調達オース由来幹細胞、マウスの脂肪組織デポの外科的分離を必要とします。したがって、組織の検索の速度と精度は、生存細胞の高い数を得るために不可欠です。また、きれいな手術用のフィールドや楽器のメンテナンスは、細胞や組織サンプルの微生物汚染を防止することによって、手続きの結果に不可欠です。解剖脂肪組織を酵素II型コラゲナーゼ溶液中で解離する必要があります。 ECM組成物は、SQ未満のコラーゲンを含んVIS SQとVIS脂肪パッド10,16との間で異なっています。したがって、VIS脂肪パッド消化の期間は、SQのような時間の約半分の量を必要とします。組織の小さな粒子は、依然としてコラゲナーゼ溶液中に存在する場合でも、規定のインキュベーション期間後に組織消化を停止するために許容可能です。培地は、コラゲナーゼ活性を阻害するために添加された後、これらの部分を機械的にピペッティングして分離することができます。続行することが可能であるが直接免疫ソートに細胞選別を続行する前に、約4〜6時間、当社グループの種子、プラスチックプレート上に1×10 6ソートされていない細胞をSVFの分離を以下に示します。 SVF単離の間、複数の濾過工程にもかかわらず、破片がまだ細胞懸濁液中に存在することになります。免疫磁気細胞分離に進む前に細胞をプレーティングすることは、磁気選別のみ脂肪細胞前駆細胞を含む接着細胞に適用されることを可能にする、離れて破片とアタッチされていない細胞を洗浄するための機会を提供します。
Sca1は、ヒトゲノム中に見出されていないが、識別およびこの細胞分離技術と結合された貯蔵脂肪依存性ヒト脂肪幹細胞17上で発現代替の細胞表面抗原の検証は、我々は、ヒト脂肪幹細胞の生物学の定義に役立つことができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、カンナビノール（THC）はNIH DK095137によってサポートされています。私たちは、記載された方法の開発と高度化に貢献して現在および過去の研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
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