Introduction
La tige antigène de cellule 1 (SCA1 ou Ly6A / E) a d' abord été identifié comme un marqueur de surface cellulaire exprimée par hématopoïétiques et les cellules souches mésenchymateuses 5,6. La fraction stroma vasculaire (FSV) du tissu adipeux obtenu à partir de dépôts de graisse de la souris est une population hétérogène de cellules comprenant des macrophages, des fibroblastes, des cellules endothéliales vasculaires, les cellules neuronales et les cellules progénitrices adipocytaires 7. Les cellules progénitrices d'adipocytes ou cellules souches dérivées de tissu adipeux (ASC) sont des cellules non-lipidiques chargées qui résident dans la matrice extracellulaire périvasculaire riche en collagène (ECM) 8. Environ 50% de la SVF se composent de ASCs, qui sont caractérisés comme lignée négative (Lin -) et CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La plupart de ces cellules sont Sca1 +: CD24 - progéniteurs adipocytaires, qui sont capables de différenciation des adipocytes in vitro; cependant, seule une fraction des cellules (0,08% de SVF) constitue Sca1
Dans le domaine de l' obésité et le diabète, la fibrose des tissus et de l' inflammation joue un rôle essentiel dans le développement et l' entretien du diabète de type 2 3. Récemment, Tokunaga et al. ont montré que SCA1 élevé des cellules isolées de inguinale (ou sous - cutanée, SQ) et perigonadal (ou viscérale, VIS) C57BL6 / J dépôts de graisse présentent différentes signatures génétiques et ECM remodelage in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un élément prototypique de la membrane tmatrice ype métalloprotéinase (MMP) famille médiatise le développement du tissu adipeux blanc (WAT) à travers son activité collagénolytique 1.
Des exemples d'expériences qui peuvent être effectués avec les cellules isolées et enrichies par le protocole suivant comprennent la culture en trois dimensions, des études de différenciation, des essais de dégradation du collagène, et le séquençage de l' ARN 10,11. Des essais de dégradation doivent être menées avec le collagène acide extrait pour assurer la préservation de télopeptide 11,12. Le protocole suivant démontrera les méthodes pour isoler les cellules stromales vasculaires primaires de différents dépôts de graisse et d'enrichir les cellules progénitrices d'adipocytes en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique. La validité du tri cellulaire sera évaluée avec cytométrie en flux et par l' utilisation de Sca1-GFP souris qui expriment la GFP dans Sca1 + cellules, entraînée par un promoteur Sca1 13.
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Protocol
Déclaration éthique: L'Université du Michigan Comité sur l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA) a approuvé toutes les méthodes et protocoles en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institute for Laboratory Animal Research, Conseil national de recherches). Les souris sont maintenues dans une Université du Michigan vivarium et bénéficient d'un accès libre à la nourriture et de l'eau et maintenus sur un cycle de 12 heures foncé / lumière.
1. Préparatifs
- Préparer les milieux de culture primaire avec DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G, et 1x antibiotiques / antifongiques. Il sera utilisé pour garder les tissus à la digestion avant. Placez stock et aliquote dans 37 ºC bain d'eau.
- Préparer cinq millilitres de solution de collagénase de type III à 5 mg / ml dissous dans du HBSS (+ Ca + Mg) pour chaque type de coussinet adipeux étant isolés jusqu'à cinq souris. Par exemple, lors de l'isolation SQ et le VIS à partir d'un seul génotype, faire 10 ml, si de type sauvage et mutant SQ et le VIS, faire 20 ml. Ajuster le pH à 7,4 et sterile filtre. Aliquoter en tubes de 50 ml. Mettez de côté de la lumière.
- En utilisant 70% d'éthanol pour la désinfection champ opératoire. Essuyez et couvrir avec un tampon bleu. Vaporisez un peu d'éthanol sur le pavé bleu.
- Utilisez les 22 G aiguilles à cerner un tampon absorbant à la planche de styromousse et de couper avec des ciseaux. Vaporiser le tampon avec de l'éthanol puis définissez le conseil sur le pavé bleu et couvrir avec un autre tampon bleu jusqu'au début de la dissection.
- Remplir deux tubes de 50 ml avec de l'éthanol et le placer dans une position adjacente au champ opératoire. Placez les ciseaux et des pinces dans l'éthanol.
- Remplir un autre tube de 50 ml avec du PBS 1x, plus anti-anti rinçage à l'éthanol hors des outils chirurgicaux.
- Dans la hotte, l'étiquette des boîtes de 60 mm pour chaque type de tissu et de remplir avec des milieux de culture chauffée à 37 ºC. Placez les plaques adjacentes à la zone chirurgicale.
2. Isolement des sous-cutanée (SQ) Fat Pads
- Euthanasier souris avec une surdose d'isoflurane et de pneumothorax.
- Doucementvaporisez souris avec 70% d'éthanol et de jeter supination. Epingler les pattes à la planche en mousse avec 22 G aiguilles.
- Faire une petite incision dans la peau de l'abdomen inférieur. En tenant le haut de la coupe avec la pince, prendre les ciseaux et séparer la peau du péritoine.
- Une fois que la peau est séparée du péritoine de l'abdomen au niveau du thorax, reflètent la peau loin du péritoine vers la tête en effectuant des coupes latérales dans la peau le long du côté du corps.
- Refléter la peau restante tenant la graisse inguinale loin du corps et de cerner à la carte avec 22 G aiguilles.
- Passer à des ciseaux fins et des pinces. Prenez le coussinet adipeux inguinal avec la pince à l'origine près du péritoine et snip loin entre la peau et la graisse inguinale progressant vers l'aine en évitant de contaminer la SQ avec la peau.
- Placez le coussin de graisse inguinale insolated dans le mm plat marqué 60.
3. Isolement de Visceral (VIS) Pads Fat
- De façon similaire à l'étape 2.5, couper le péritoine ouvert pour exposer la viscérale coussinets adipeux et de l'intestin.
- Déplacer l'intestin loin vers le thorax.
- Prenez le coussinet adipeux VIS à l'extrémité distale et tirez doucement vers le haut. Disséquer le coussinet adipeux VIS tout en veillant à exclure l'épididyme (ou de l'utérus, en cas d'utilisation des souris femelles) tissus.
- Placer dans un plat marqué et répétez l'étape 3.3 pour le pad restant VIS.
4. collagénase Digestion de Fat Pads
- Déplacer 60 mm plats à la culture de tissus capot et aspirer hors médias.
- Émincer les coussinets adipeux avec des ciseaux courbes, puis ajouter à la solution de collagénase. Assurez-vous de rincer les ciseaux et des pinces entre les types de tissus avec de l'éthanol et du PBS.
- Agiter à 300 tours par minute et 37 ° C pendant 10-20 min jusqu'à ce que les tissus sont digérés. Il est acceptable si certains morceaux de SQ sont encore visibles. Cette question sera abordée dans une étape ultérieure.
- Ajouter 25 ml de milieu de culture à la solution de collagénase pour arrêter le collagtraitement enase, et la pipette de haut en bas 10 fois avec 10 ml pipette sérologique pour disperser les tissus digérés.
- cellules souches en utilisant un tamis cellulaire 100 um. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g.
- Décanter avec soin hors médias de ne pas perturber le culot et ajouter 5 ml d'eau stérile au culot et doucement la pipette de suspendre les cellules. Attendre 2 min pour lyser les érythrocytes.
- Ajouter 25 ml de milieu avec des cellules de FBS et de déformation de 10% grâce à une nouvelle cellule crépine 100 um.
- Centrifuger pendant 10 min à 300 x g. Décanter les médias et remettre le culot dans 1 ml de milieu de culture.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre en utilisant 1: 1 bleu trypan.
- Plate 1 x 10 6 cellules dans un puits sur une plaque à 6 puits.
5. magnétique de séparation cellulaire
- Au bout d'environ 4 à 6, h d'adhérence cellulaire, rincer deux fois les cellules avec du HBSS (-Ca, Mg). Dissocier les cellules adhérentes en utilisant 0,05% de trypsine. Diluer la trypsine suspension cellulaire dans 1 ml de tampon de séparation et de spin pour5 min à 300 x g.
- surnageant Aspirer. Resuspendre les cellules dans 500 pi de tampon. Retirer une partie aliquote de 10 pl et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- les cellules d'essorage pendant 5 min à 300 x g.
- Aspirer le surnageant complètement. Resuspendre les cellules dans 90 ul de tampon. Ajouter 10 anticorps primaire anti-Sca1-FITC ul. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver les cellules avec 1 ml de tampon et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g. Retirer le surnageant complètement.
- Resuspendre les cellules dans 80 ul de tampon. Ajouter 20 microbilles anti-FITC ul. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver les cellules avec 1 ml de tampon et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g.
- Retirer le surnageant et remettre le culot dans 500 ul de tampon.
- Placer la colonne dans le support magnétique et rincer la colonne avec 500 pi de tampon.
- Ajouter la suspension cellulaire à la colonne. Éviter les bulles tout pipetage.
- Recueillir le Sca1 non marqué - </ Sup> cellules et laver la colonne 3 fois avec un tampon de 500 pi. Seulement ajouter un nouveau tampon lorsque le réservoir est vide. Éviter les bulles tout pipetage.
- Retirer la colonne du support magnétique et le placer dans un tube conique de 15 ml.
- Ajouter 1 ml de tampon à la colonne et éluer Sca1 + en poussant le piston fourni par le réservoir de la colonne.
- Isoler les fractions de cellules pendant 5 min à 300 x g. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture.
- Retirer une partie aliquote de 10 ul des fractions marquées et non marquées et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Plaquer chaque fraction cellulaire dans une cupule d'une plaque à 6 puits.
6. Vérification de la séparation immunomagnétique de Sca1 haute ACS avec cytométrie de flux
- Rincer les cellules deux fois avec HBSS (-Ca, -Mg) et dissocier les cellules en utilisant 0,05% de trypsine.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture et comptent au moyen d'un hémocytomètre.
- Obtenir> 10 6
- Retirer le surnageant et répétez l'étape 6.3 plus de deux fois.
- Resuspendre les cellules avec 1 ml de sérum de chèvre à 2% + 2% de BSA et de bloquer pendant 30 min à température ambiante.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min.
- Retirer la solution de blocage.
- Ajouter le rat IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 pg, 1: 400) ou anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 pg, 1: 400), dans 100 ul de PBS avec 2% de sérum de chèvre et 2% de BSA + PBS à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
- Ajouter 1 ml de PBS froid aux cellules. Centrifugeuse 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant et répétez l'étape 6.9 plus de deux fois.
- Resuspendre les cellules dans 1 ml de PBS. Passer des suspensions de cellules à travers un tamis cellulaire de 100 um pour préparer une analyse cytométrique de flux.
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Representative Results
Enrichissement de ASCs élevés SCA1 de différents Pads Fat.
Les cellules stromales vasculaires isolées à partir de l' affichage de la graisse SQ fibroblaste, étirées la forme des cellules , indépendamment du niveau d'expression Sca1 (figure 1A). D'autre part, le VIS (EWAT-dérivée) des cellules à faible SCA1 élevé et SCA1 démontrent nette différence dans la forme de leur cellule. Comme SQ (Iwat dérivés) SCA1 cellules élevées, VIS (EWAT-dérivé) cellules haute SCA1 affichent étirés, la forme des cellules fibroblaste, tandis que les cellules faibles VIS SCA1 démontrent la forme épithélioïde. SCA1 élevé des cellules isolées à partir de souris SCA1-GFP sont facilement identifiées comme des cellules GFP-positives dans une culture tissulaire (figure 1B). Lorsque ces cellules ont été évaluées par cytométrie de flux, la plupart des cellules positives à la GFP ont été confirmées pour exprimer des protéines de SCA1 sur la surface cellulaire, telle qu'elle est détectée avec unl' anticorps ti-Sca1 (figure 1C). Les cellules de haute SCA1 dérivés du coussinet adipeux inguinal maintenir la capacité de la différenciation adipocytaire ont augmenté tandis que les cellules haute SCA1 EWAT dérivés sont plus difficiles à différencier en adipocytes avec un mélange adipogénique 10 classique.
Dépôt de matières grasses Gene expression dépendante de SCA1 élevée ASCs (figure 2).
Transcriptome pangénomique analyses avec le séquençage de l' ARN démontré l'enrichissement de gènes liés à des protéines et des modificateurs de la matrice extracellulaire (GO: 0031012, GO: 0005578) dans ces ASCs SCA1 élevées 10. Couplé avec en temps réel des analyses PCR, nous avons été en mesure de démontrer l'expression différentielle des MMP collagénolytique (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) SCA1 entre iWAT- et EWAT dérivés élevés ASCs. Lorsque fluorescéine collagène de type I gels ont été utilisés t o évaluer l' activité de dégradation péricellulaire, nous avons observé l'activité nettement augmenté collagène de remodelage médié par VIS SCA1 haute ASCs 10.
Figure 1: Séparation immunomagnétique de Murine SCA1 élevés ASCs de différents dépôts de graisse (A) SCA1 haute et basse SCA1 ASCs isolées de SQ (Iwat) et VIS (EWAT).. Échelle = 100 um. (B) cellules Sca1-GFP isolées de Iwat de souris Sca-GFP. Échelle = 100 um. (C) Cell expression de surface de Sca1 dans les cellules Sca1-GFP-positives évaluées avec cytométrie en flux. (À gauche) IgG de rat de contrôle (à droite) anticorps anti-Sca1. L'axe X, l'intensité de la GFP. L' axe Y, Alexa-Fluor 647. Le panneau A montré précédemment dans Tokunaga, M. et al., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Expression Fat Depot dépendant de collagénolytique MMP, TIMP et collagènes (A) l' expression génique différentielle des ECM et des modificateurs d'ECM dans SCA1 hautes ASCs isolées à partir de différents dépôts de graisse. (B) Augmentation de collagène activité de dégradation du VIS (EWAT-dérivé) ASCs élevé SCA1. La dégradation du collagène est montré comme la disparition des signaux fluorescents (flèches et pointes de flèches). Encart est une image agrandie de concentré dégradation du collagène médiée par cellule individuelle de ASCs SQ. Les cellules ont été cultivées pendant 72 heures. Les données présentées précédemment dans Tokunaga, M. et al., (2014). S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici , nous démontrons l'isolement et la séparation cellulaire immunomagnétique de ASCs souris provenant de différents tampons de graisse et leur utilisation pour des expériences in vitro. La méthode présentée est efficace pour l'isolement rapide d' un grand nombre de ASCs de SCA1 positif, ce qui est avantageux par rapport à l'isolement techniquement complexe et coûteux FACS médiée par des ASCs 9,14. A la différence FACS, la séparation cellulaire immunomagnétique ne permet pas l'utilisation de multiples antigènes pour l'identification d'une population de cellules cibles. Néanmoins, si l'antigène de surface est bien caractérisée, l'utilisation de la séparation immunomagnétique augmente le nombre de cellules à analyser sans compter sur l'utilisation des équipements FACS 15, qui est toujours pas facilement accessible à de nombreux chercheurs biologiques à petite instituts sans installations de base .
Il y a certains aspects critiques de la procédure qui doit être respecté pour assurer un résultat positif. L'acquisition de ADIPOSE dérivées de cellules souches nécessite l'isolement chirurgical des dépôts de tissu adipeux de la souris. Par conséquent, la vitesse et la précision de la récupération de tissus est impératif d'obtenir un nombre élevé de cellules viables. En outre, l'entretien des champs et des instruments chirurgicaux propres sont essentiels à l'issue de la procédure en empêchant la contamination microbienne des échantillons de cellules et de tissus. les tissus adipeux disséqués doivent être dissociées par voie enzymatique dans une solution de collagénase de type II. Composition ECM diffère entre SQ et VIS coussinets adipeux 10,16, où VIS contiennent moins de collagènes que SQ. Par conséquent, la durée du VIS coussinet adipeux digestion nécessite environ la moitié de la quantité de temps que SQ. Il est acceptable d'arrêter la digestion des tissus après la période d'incubation indiquée, même si de petites particules de tissus sont encore présents dans la solution de collagénase. Ces pièces peuvent être dissociées mécaniquement par pipetage une fois que les milieux de culture a été ajouté à inhiber l'activité de la collagénase. Bien qu'il soit possible de procéderdirectement au tri immunomagnétique après isolement SVF, nos graines de groupe 1 x 10 6 cellules non triées sur des plaques en plastique pendant environ 4 à 6 heures avant de continuer avec le tri cellulaire. Malgré plusieurs étapes de filtration pendant l'isolement SVF, les débris sera toujours présent dans la suspension cellulaire. Placage les cellules avant de procéder à la séparation cellulaire immunomagnétique donne l'occasion de se laver les débris et les cellules non attachées à une distance, permettant ainsi le tri magnétique seulement être appliquée à des cellules adhérentes qui contiennent des cellules progénitrices adipogènes.
Alors que Sca1 ne se trouve pas dans le génome humain, l'identification et la validation des autres antigènes de surface cellulaire exprimés sur les cellules adipeuses de dépôt dépendant souches de tissu adipeux humain 17, lorsqu'il est associé avec cette technique de séparation cellulaire, peuvent nous aider à définir la biologie des cellules souches de tissu adipeux humain.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le NIH DK095137 (THC). Nous remercions les membres du laboratoire actuels et anciens qui ont contribué au développement et à la sophistication des méthodes décrites.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
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