Introduction
Stammzell - Antigen 1 (Sca1 oder Ly6A / E) wurde zuerst als ein Zelloberflächenmarker von hämatopoetischen Stammzellen und mesenchymalen 5,6 ausgedrückt identifiziert. Die stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von Fettgewebe aus Maus - Fettdepots erhalten ist eine heterogene Population von Zellen von Fibroblasten umfasst, Makrophagen, vaskulären Endothelzellen, Nervenzellen und Adipozyten Progenitorzellen 7. Adipocyte Vorläuferzellen oder Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCS) sind nicht-lipidbeladenen Zellen , die in das Kollagen-reiche perivaskulärem extrazellulären Matrix (ECM) 8 befinden. Etwa 50% des SVF von ASCS bestehen, die als linien negativ charakterisiert sind (Lin -) und CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. Die meisten dieser Zellen sind Sca1 +: CD24 - Adipozyten - Progenitoren, die von Adipozyten - Differenzierung in vitro geeignet sind; jedoch nur ein Bruchteil der Zellen (0,08% SVF) bildet Sca1
Auf dem Gebiet der Adipositas und Diabetes, Gewebefibrose und Entzündungen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Wartung von Typ-2 - Diabetes 3 spielen. Vor kurzem Tokunaga et al. zeigten , dass von Leisten- isolierten High - Zellen Sca1 (oder subkutan, SQ) und perigonadal (oder viszerale, VIS) 10 verschiedene Gen - Signaturen und ECM - Umbau in vitro C57BL6 / J Fettdepots aufweisen. MMP14 (MT1-MMP), ein prototypisches Mitglied der membran typ Matrix - Metalloproteinase (MMP) Familie vermittelt die Entwicklung von weißen Fettgewebe (WAT) durch seine kollagenolytischer Aktivität 1.
Beispiele für Experimente , die mit den Zellen kann durch das folgende Protokoll sind die dreidimensionale Kultur, Differenzierung Studien, Kollagenabbau - Assays und RNA - Sequenzierung 10,11 isoliert und angereichert durchgeführt werden. Der Abbau Assays sollten mit Säure extrahierten Kollagen durchgeführt werden , um die Erhaltung der Telopeptid 11,12 zu gewährleisten. Das folgende Protokoll wird die Methoden nachweisen primären Zellen vaskuläre Stroma aus verschiedenen Fettdepots zu isolieren und zu Adipozyten-Vorläuferzellen unter Verwendung von immunomagnetischer Zelltrennung zu bereichern. Die Gültigkeit der Zellsortierung mit Fluss bewertet werden Zytometrie und durch den Einsatz von Sca1-GFP - Mäuse , die GFP in Sca1 + Zellen exprimieren, angetrieben durch einen Sca1 Promotor 13.
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Protocol
Ethik-Statement: Die University of Michigan Ausschuss für Benutzung und Pflege der Tiere (UCUCA) hat sich für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortierforschung, National Research Council) alle Methoden und Protokolle gemäß dem Leitfaden genehmigt. Die Mäuse werden in einer von der Universität Michigan Vivarium gehalten und haben freien Zugang zu Nahrung und Wasser und hielt auf einem 12 Stunden Hell / Dunkel-Zyklus gegeben.
1. Vorbereitungen
- Bereiten Primärkulturmedien DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G und 1x Antibiotika / Antimykotika. Dies wird verwendet, um Gewebe zu halten, bevor die Verdauung. Legen Sie Lager und aliquoten in 37 ºC Wasserbad.
- Bereiten fünf Milliliter Typ III Kollagenase-Lösung auf 5 mg / ml in HBSS gelöst (+ Ca + Mg) für jede Art von Fettpolsters isoliert ist, bis zu fünf Mäusen. Wenn zum Beispiel SQ und VIS aus einem einzigen Genotyp zu isolieren, machen 10 ml, wenn Wildtyp und Mutante SQ und VIS, 20 ml zu machen. Der pH-Wert auf 7,4 und sterile Filter. Aliquote in 50-ml-Röhrchen. Nehmen Sie sich weg vom Licht.
- Verwenden Sie 70% Ethanol Operationsfeld zu desinfizieren. Wischen Sie und Deckel mit einem blauen Pad. Sprühen Sie etwas Ethanol auf dem blauen Kissen.
- Verwenden Sie die 22 G Nadeln ein absorbierendes Kissen auf der Styroporplatte festzunageln und schneiden mit einer Schere. Sprühen Sie das Pad mit Ethanol dann das Brett auf dem blauen Kissen gesetzt und mit einem anderen blauen Kissen abdecken, bis Dissektion beginnt.
- Füllen Sie zwei 50-ml-Röhrchen mit Ethanol und in einem Stand neben dem OP-Feld. Legen Sie die Schere und Pinzette in Ethanol.
- Füllen Sie ein weiteres 50-ml-Röhrchen mit PBS plus 1x anti-anti für Ethanol aus chirurgischen Werkzeugen zu spülen.
- In der Haube, Etikett 60-mm-Schalen für jeden Gewebetyp und füllen mit Kulturmedien auf 37 ° C erwärmt. Legen Sie die Platten neben dem OP-Bereich.
2. Isolierung von subkutanem (SQ) Fettpolster
- Euthanize Maus mit einer Überdosis von Isofluran und Pneumothorax.
- SanftSpray-Maus mit 70% Ethanol und lag dem Rücken. Pin die Pfoten auf die Schaumplatte mit 22 G Nadeln.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut des Unterleibs. die Spitze der Schnitt mit der Zange halten, nehmen Sie die Schere und die Haut vor dem Peritoneum trennen.
- Sobald die Haut aus dem Peritoneum vom Abdomen auf den Thorax getrennt ist, spiegeln die Haut vom Peritoneum in Richtung des Kopfes durch entlang der Seite des Körpers seitliche Schnitte in der Haut.
- Spiegeln die verbleibende Haut in den Leisten Fett vom Körper weg halten und Stift mit 22 G Nadeln an der Platte nach unten.
- Wechseln Sie zu einer feinen Schere und Pinzette. Besorgen Sie sich die Leistenfettpolster mit der Zange am Ursprung in der Nähe des Peritoneum und schnippeln entfernt zwischen der Haut und Leisten- Fett in Richtung der Leiste voran Vermeidung der SQ mit der Haut zu kontaminieren.
- Legen Sie die insolated Leistenfettpolster in der 60-mm-Schale bezeichnet.
3. Isolierung von Visceral (VIS) Fettpolster
- In ähnlicher Weise zu Schritt 2.5, schneiden Sie das Peritoneum geöffnet, um die viszerale Fettpolster und gut aus.
- Bewegen Sie den Darm weg in Richtung des Thorax.
- Besorgen Sie sich die VIS Fettpolster am distalen Ende und sanft nach oben ziehen. Präparieren Sie das VIS Fettpolster, während vorsichtig epididymal auszuschließen (oder des Uterus, wenn weibliche Mäuse verwendet wird) Gewebe.
- Platz in der Bezeichnung Schale und wiederholen Sie den Schritt 3.3 für den verbleibenden VIS-Pad.
4. Collagenaseverdau von Fettpolstern
- Verschieben 60 mm-Schalen auf die Gewebekultur Kapuze und absaugen Medien.
- Mince die Fettpolster mit einer gebogenen Schere fügen Sie dann zu Kollagenase-Lösung. Achten Sie darauf, die Schere und Zange zwischen Gewebetypen mit Ethanol und PBS zu spülen.
- Schütteln bei 300 rpm und 37 ° C für 10-20 min, bis Gewebe verdaut werden. Es ist akzeptabel, wenn einige Stücke von SQ noch sichtbar sind. Dies wird in einem späteren Schritt zu richten.
- 25 ml Kulturmedien auf die Kollagenase-Lösung die collag zu stoppenenase Behandlung und Pipette nach oben und unten 10-mal mit einer 10 ml serologische Pipette die verdaute Gewebe zu verteilen.
- Der Stamm-Zellen eine 100 & mgr; m Zelle Sieb verwendet wird. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g.
- Sorgfältig Medien abdekantieren nicht das Pellet zu stören und zu 5 ml sterilem Wasser zu dem Pellet hinzu und sanft Pipetten Zellen zu suspendieren. Warten Sie 2 min Erythrozyten zu lysieren.
- 25 ml Medium mit 10% FBS und Dehnungs Zellen durch ein 100 & mgr; m Zellsieb.
- Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Dekantieren Medien und Pellet in 1 ml Kulturmedium.
- Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung von 1: 1 Trypanblau.
- Platte 1 x 10 6 Zellen in einer Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen.
5. Magnetzellseparation
- Nach etwa 4 bis 6 Stunden der Zelladhäsion, spülen die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg). Distanzieren anhaftenden Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin. Verdünnen Trypsin Zellsuspension in 1 ml Trennpuffer und Spin5 min bei 300 x g.
- Überstand entfernen. Die Zellen in 500 & mgr; l Puffer. Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot und zählen Zellen eine Zählkammer.
- Spin-Zellen für 5 min bei 300 x g.
- Überstand entfernen vollständig. Die Zellen in 90 & mgr; l Puffer. In 10 ul anti-Sca1-FITC primären Antikörper. Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g. Vollständig entfernen Überstand.
- Die Zellen in 80 ul Puffer. In 20 ul anti-FITC-Mikrokügelchen. Gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g.
- Überstand entfernen und Pellet in 500 & mgr; l Puffer.
- Legen Sie Spalte in der Magnethalterung und spülen Säule mit 500 & mgr; l Puffer.
- Hinzufügen Zellsuspension zu Spalte. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren.
- Sammeln Sie die unbeschriftete Sca1 - </ Sup> Zellen und Säule 3-mal mit 500 & mgr; l Puffer waschen. Nur neue Puffer hinzuzufügen, wenn der Behälter leer ist. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren.
- Entfernen Sie Spalte aus dem Magnethalter und in einen 15 ml konischen Röhrchen.
- 1 ml Säulenpuffer und Sca1 + eluieren durch geliefert Kolben durch die Säule Reservoir drückt.
- Spin down Zellfraktionen für 5 Minuten bei 300 x g. Die Zellen in 1 ml Kulturmedium.
- Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot aus den markierten und unmarkierten Fraktionen und zählen Zellen eine Zählkammer.
- Platte jede Zellfraktion in 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte.
6. Überprüfung der Immunomagnetische Trennung von Sca1 hohe ACSs mit Durchflusszytometrie
- Spülen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg) und distanzieren Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin.
- Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min. Die Zellen in 1 ml Kulturmedien und zählen eine Zählkammer.
- Erhalten> 10 6
- Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.3 zwei weitere Male.
- Die Zellen mit 1 ml 2% Ziegenserum + 2% BSA und Block 30 min bei RT.
- Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min.
- Entfernen Lösung blockiert.
- Hinzufügen Ratte IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 & mgr; g, 1: 400) oder anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 & mgr; g, 1: 400), in 100 & mgr; l PBS mit 2% Ziegenserum und 2% BSA + PBS bei 4 ° C für 30 min im Dunkeln.
- 1 ml kaltem PBS zu den Zellen. Zentrifuge 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.9 zwei weitere Male.
- Die Zellen in 1 ml PBS. Pass Zellsuspensionen durch ein 100 & mgr; m Zellsieb in der Vorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse.
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Representative Results
Anreicherung von Sca1 hohe ASCS aus verschiedenen Fettpolster.
Die vaskuläre Stromazellen aus SQ Fett Anzeige Fibroblasten-ähnliche isoliert, gestreckt Zellform unabhängig von Sca1 Expressionsniveau (Abbildung 1A). Auf der anderen Seite, VIS (EWAT-derived) Sca1 hoch und Sca1 niedrigen Zellen zeigen deutliche Unterschiede in ihren Zellform. Wie SQ (iWAT abgeleitete) Sca1 hohe Zellen, VIS (EWAT-derived) Sca1 hohe Zellen gestreckt Display, Fibroblasten-ähnliche Zellform, während VIS Sca1 niedrigen Zellen epithelioid Form zeigen. SCA1 hoch von SCA1-GFP - Mäusen isolierte Zellen werden leicht als GFP-positive Zellen in Gewebekultur (1B) identifiziert. Wenn diese Zellen mit Cytometrie Strömungs bewertet wurden, wurden die meisten der GFP positive Zellen bestätigt Sca1 Proteine auf der Zelloberfläche zu exprimieren, wie mit einem detektiertenti-Sca1 Antikörper (1C). Sca1 hohe Zellen von Leisten- Fettpolster abgeleitet maintain Kapazität von Adipozyten - Differenzierung erhöht , während EWAT abgeleitete Sca1 hohe Zellen schwieriger sind mit herkömmlichen 10 adipogenetische Mischung in Adipozyten zu unterscheiden.
Fat Depot-abhängige Gene Expression von Sca1 hohe ASCS (Abbildung 2).
Genomweite Transkriptom - Analysen mit RNA - Sequenzierung zeigten die Anreicherung von Genen im Zusammenhang mit extrazellulären Matrixproteinen und Modifikatoren (GO: 0.031.012, GO: 0005578) in diesen Sca1 hohe ASCS 10. In Verbindung mit Echtzeit-PCR - Analysen konnten wir die unterschiedliche Expression der kollagenolytischer MMPs (MMP - 2, MMP8, MMP13, MMP14) zwischen iWAT- und EWAT abgeleitete Sca1 hohe ASCS zu demonstrieren. Bei fluoreszenzmarkierte Typ-I-Kollagen-Gele t verwendet wurden o perizellulärer Abbauaktivität beurteilen zu können , haben wir beobachtet , die deutlich erhöhte Kollagen Remodeling - Aktivität vermittelt durch VIS Sca1 hohe ASCS 10.
Abbildung 1: Immunomagnetische Trennung von Murine Sca1 hohe ASCS aus verschiedenen Fettdepots (A) Sca1 hoch und Sca1 niedrigen ASCS isoliert von SQ (iWAT) und VIS (EWAT).. Maßstab = 100 & mgr; m. (B) Sca1-GFP - Zellen isoliert von iWAT von Sca-GFP - Mäusen. Maßstab = 100 & mgr; m. (C) Zelloberflächenexpression von Sca1 in Sca1-GFP-positive mit Durchflusszytometrie beurteilt Zellen. (Links) Kontrolle Ratten-IgG (rechts) anti-Sca1 Antikörper. X-Achse, GFP Intensität. Y-Achse, Alexa-Fluor 647. Panel A zuvor in Tokunaga gezeigt, M. et al., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Fat Depot-abhängige Expression von kollagenolytischer MMPs, TIMPs und Kollagene (A) Differentielle Genexpression von ECMs und ECM - Modifikatoren in Sca1 hohe ASCS aus verschiedenen Fettdepots isoliert. (B) erhöhte Kollagenabbauaktivität von VIS (EWAT-derived) Sca1 hohe ASCS. Abbau von Kollagen wird als das Verschwinden von Fluoreszenzsignalen (Pfeile und Pfeilspitzen) gezeigt. Inset ist ein vergrößertes Bild fokussiert Kollagenabbau durch einzelne Zelle von SQ ASCS vermittelt. Die Zellen wurden für 72 Stunden kultiviert. Die gezeigten Daten zuvor in Tokunaga, M. et al., (2014). Bitte klicken Sie hier , um die vIEW eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier zeigen wir die Isolierung und immunomagnetischer Zellseparation von murinen ASCS aus verschiedenen Fettpolster und deren Verwendung für die in - vitro - Experimenten. Die vorgestellte Methode ist wirksam für die schnelle Isolierung von großen Anzahl von Sca1-positive ASCS, die über die technisch aufwendige und teure FACS-vermittelte Isolierung von ASCS 9,14 vorteilhaft ist. Anders als FACS, ist immunomagnetischen Zelltrennung erlauben nicht die Verwendung von mehreren Antigen zur Identifizierung einer Zielzellpopulation. Dennoch ist , wenn das Oberflächenantigen gut charakterisierten, die Verwendung von immunomagnetischen Separation erhöht sich die Anzahl der Zellen , ohne sich auf die Verwendung von FACS Geräten 15, die immer noch nicht leicht zugänglich ist bei kleinen Institute ohne Kerneinrichtungen viele biologische Forscher zu analysierende .
Es gibt einige kritische Aspekte des Verfahrens, die beachtet werden müssen, um ein erfolgreiches Ergebnis zu gewährleisten. Die Beschaffung von ADIPose abgeleitete erfordert Stammzellen die chirurgische Trennung von Fettgewebe Depots Maus. Deshalb ist die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Gewebeentnahme zwingend notwendig, eine hohe Anzahl an lebensfähigen Zellen zu erhalten. Darüber hinaus sind die Aufrechterhaltung der sauberen chirurgischen Felder und Instrumente entscheidend für den Ausgang des Verfahrens durch mikrobielle Kontamination von Zell- und Gewebeproben zu verhindern. Dissected Fettgewebe muss enzymatisch in einer Typ-II-Kollagenase-Lösung voneinander zu trennen sind. ECM Zusammensetzung unterscheidet zwischen SQ und VIS Fettpolster 10,16, wo VIS enthalten weniger Kollagene als SQ. Daher erfordert die Dauer des VIS Fettpolsters Verdauung etwa die Hälfte der Menge an Zeit als SQ. Es ist akzeptabel, Gewebe Verdauung nach der angegebenen Inkubationszeit selbst wenn kleine Teilchen von Gewebe sind noch in der Kollagenase-Lösung zu stoppen. Diese Stücke können mechanisch mit Pipettieren getrennt werden, sobald Kulturmedien hinzugefügt wurde Kollagenase-Aktivität zu hemmen. Während es möglich ist fortzufahrendirekt an immunomagnetische Sortieranlage folgenden SVF Isolierung unserer Gruppe Samen 1 x 10 6 Zellen auf unsortierte Kunststoffplatten für etwa 4 bis 6 Stunden vor der Zellsortierung mit fortsetzt. Trotz mehrerer Filtrationsschritte während SVF Isolierung, Schutt wird noch innerhalb der Zellsuspension vorliegen. Plattierung der Zellen vor zu immunomagnetischer Zelltrennung Vorgehen bietet die Möglichkeit, Schutt und ungebunden Zellen abzuwaschen, damit magnetische Sortierung ermöglicht nur anhaftenden Zellen angewendet werden, die adipogenetische Vorläuferzellen enthalten.
Während Sca1 nicht im menschlichen Genom gefunden wird, äußerte sich der Identifizierung und Validierung von alternativen Zelloberflächenantigene auf den Fettdepots abhängige menschliche Fettgewebestammzellen zu 17, wenn sie mit dieser Zelle Trenntechnik gekoppelt sind , kann uns helfen , die Biologie des menschlichen Fettgewebestammzellen zu definieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von NIH DK095137 (THC) unterstützt. Wir danken den aktuellen und ehemaligen Labor-Mitglieder, die an der Entwicklung und Verfeinerung der beschriebenen Verfahren beigetragen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
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