Introduction
세포 항원 1 (SCA1 또는 Ly6A / E)를 줄기 제 조혈 및 중간 엽 줄기 세포, 6으로 표시되는 세포 표면 마커로 확인되었다. 마우스 지방 저장소에서 얻은 지방 조직의 기질 혈관 분획 (SVF)는 섬유 아 세포, 대 식세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포 및 지방 세포의 전구 세포 (7)의 포함하는 세포의 이종 인구입니다. 지방 세포 전구 세포 또는 지방 - 유래 줄기 세포 (ASC를)는 풍부한 혈관 주위 콜라겐이 세포 외 기질 (ECM) (8)에있는 비 지질 함유 세포이다. CD34 + : SCA1 + 9 CD29 + - 약 SVF의 50 %는 혈통 음 (린)와 같은 특징의 ASC,로 구성되어 있습니다. 시험관에서의 지방 세포 분화 할 수있는 지방 세포 전구 세포 - CD24 : 이들 세포의 대부분은 SCA1 + 아르 그러나, 세포의 일부만 (SVF 0.08 %)의 구성을 SCA1
비만과 당뇨병, 조직의 섬유화와 염증의 분야에서 2 형 당뇨병 3의 개발과 유지에 중요한 역할을한다. 최근, 토쿠 나가 등. (VIS, 또는 내장) 서혜부 (또는 피하, SQ)과 perigonadal에서 분리 SCA1 높은 세포 C57BL6 / J 지방 저장소가 시험관 (10)의 서로 다른 유전자 서명과 ECM의 리모델링을 나타내는 것으로 나타났다. MMP14 (MT1-MMP), 막-t의 원형 회원YPE 매트릭스 메탈은 (MMP) 패밀리는 collagenolytic 활성 (1)을 백색 지방 조직 (WAT)의 개발을 매개한다.
다음 프로토콜을 통해 분리되고 농축 된 세포로 수행 될 수있다 실험 예는 삼차원 배양, 분화 연구, 콜라겐 분해 분석 및 RNA 서열 10, 11을 포함한다. 분해 분석은 텔로 펩타이드 (11, 12)의 보존을 보장하기 위해, 산 추출 콜라겐으로 수행되어야한다. 다음 프로토콜은 서로 다른 지방 저장소에서 주요 혈관 간질 세포를 분리 및 면역 자기 세포 분리를 이용하여 지방 세포의 전구 세포를 풍부하게하는 방법을 설명 할 것이다. 셀 정렬의 유효성은 유동 세포 계측법으로하고 SCA1 프로모터 (13)에 의해 구동 SCA1 + 세포에서 GFP를 표현 SCA1-GFP 마우스를 사용을 통해 평가한다.
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Protocol
윤리 정책 : 동물의 사용 및 관리에 미시간위원회의 대학 (UCUCA)은 (실험 동물 연구를위한 연구소, 국립 연구위원회)가 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 따라 모든 방법과 프로토콜을 승인했다. 마우스는 미시간 대학의 동식물 사육장 유지하고, 음식과 물을 무료로 액세스 권한을 부여하고, 12 시간 어두운 / 라이트 사이클에 보관됩니다.
1. 준비
- DMEM, 10 % FBS, 1 배 P / S / G 및 1X 항생제 / 항진균제와 차 문화 미디어를 준비합니다. 이것은 이전 소화 조직을 유지하는 데 사용된다. 37 ºC 물을 욕조에 주식과 나누어 놓습니다.
- 5 ㎎ / ㎖ (+ 칼슘 + 마그네슘) 지방 패드의 각 유형에 대한 다섯 마우스에 최대, 고립 된 HBSS에 용해에서 유형 III 콜라겐 솔루션의 다섯 밀리리터를 준비합니다. 하나의 유전자형에서 SQ와 VIS를 분리 할 때 야생형과 돌연변이 SQ와 VIS는, 20 ㎖을 예를 들어, 10 mL로합니다. 7.4 인트하여 pH를 조정필터를 화나게. 50 ㎖ 튜브로 나누어지는. 따로 떨어져 빛에서 설정합니다.
- 수술 부위를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. 닦아와 푸른 패드 커버. 블루 패드에 약간의 에탄올을 스프레이.
- 스티로폼 보드에 흡수 패드를 고정하고 가위로 잘라하기 위해 22 G 바늘을 사용합니다. 다음 블루 패드에 보드를 설정하고 해부를 시작하기까지 또 다른 블루 패드 커버 에탄올 패드 스프레이.
- 수술 부위에 인접한 스탠드에서 에탄올과 장소이 50 ㎖ 튜브를 입력합니다. 에탄올에 가위와 집게를 놓습니다.
- 수술 도구를 에탄올을 세척을 위해 PBS 플러스 1 배 안티 - 안티 또 다른 50 ML 튜브를 입력합니다.
- 후드에서 각 조직 유형에 대한 라벨 60mm 요리와 37 ºC로 가온 문화 미디어로 채우십시오. 외과 영역에 인접한 플레이트를 놓습니다.
피하 (SQ) 지방 패드 2. 분리
- 이소 플루 란과 기흉의 과다 복용으로 마우스를 안락사.
- 부드럽게70 % 에탄올로 마우스 스프레이와 부정사 누워. 22 G 바늘 폼 보드에 발을 고정.
- 하복부의 피부에 작은 상처를 확인합니다. 포셉과 컷의 상단을 잡고 가위를 가지고 복막에서 피부를 분리합니다.
- 피부가 흉부의 복부 복막로부터 분리되면, 상기 몸체의 측면을 따라 피부 측 방향으로 절개함으로써 얻어 헤드쪽으로 복막으로부터 피부를 반영한다.
- 떨어져 몸에서 사타구니 지방을 잡고 나머지 피부를 반영, 22 G 바늘 보드 아래로 핀.
- 미세 가위와 집게로 전환합니다. 복막 근처 원점에서 집게로 사타구니 지방 패드를 잡고 피부와 SQ 오염 방지 사타구니쪽으로 진행 피부와 사타구니 지방 사이의 거리 싹둑.
- 표지 60mm 접시에 단리 된 사타구니 지방 패드를 놓습니다.
내 장기 (VIS) 지방 패드 3. 분리
- 유사한 방식으로, 2.5 단계 지방 패드와 장 본능적 노출 열려 복막을 잘라.
- 멀리 가슴을 향해 창자를 이동합니다.
- 말단부에서 VIS 지방 패드를 잡고 부드럽게 잡아 당깁니다. 조직 (암컷 마우스를 사용하는 경우, 또는 자궁) 부고환을 제외 할 조심하면서 VIS 지방 패드를 해부하다.
- 라벨 요리와 나머지 VIS 패드 단계를 반복 3.3의 장소.
지방 패드의 4 콜라게나 소화
- 조직 문화 후드에 60mm 요리를 이동하고 미디어를 대기음.
- 곡선 가위는 다음 콜라겐 솔루션에 추가로 지방 패드를 말하다. 에탄올과 PBS와 조직 유형 사이에 가위와 집게를 씻어해야합니다.
- 조직이 소화 될 때까지 300 rpm으로 10 ~ 20 분 동안 37 ºC에서 흔들어. SQ의 일부 조각 여전히 볼 수 있습니다 경우는 허용됩니다. 이것은 이후 단계에서 해결 될 것입니다.
- collag을 중지 콜라게나 제 용액에 배양액 25 ㎖를 추가10 ㎖의 혈청 학적 피펫 enase 처리 및 피펫 위아래로 10 배는 소화 조직을 분산합니다.
- 100 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 변형 세포. 300 × g으로 10 분 동안 원심 분리기.
- 조심스럽게 펠렛을 방해하고 부드럽게 세포를 일시 중단 피펫을 펠렛에 멸균 물 5ml를 추가하지 미디어를 가만히 따르다. 적혈구를 용균 2 분을 기다립니다.
- 새로운 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 10 % FBS와 변형 세포와 미디어의 25 ML을 추가합니다.
- 300 × g으로 10 분 동안 원심 분리기. 캔트 미디어 및 배양 배지 1 ㎖에 재현 탁 펠렛.
- 1 트리 판 블루 : 1을 사용하여 혈구와 세포를 계산합니다.
- 6 잘 접시에 하나 잘 플레이트 1 × 10 6 세포.
5. 자기 세포 분리
- 세포 부착의 약 4 내지 6 시간 후, HBSS (-CA, -mg)로 두 번 세포를 씻어. 0.05 % 트립신을 사용하여 접착 세포를 해리. 1 ml의 분리 버퍼와 스핀에서 트립신 세포 현탁액을 희석300 X g에서 5 분.
- 기음 뜨는. 500 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 10 μL 나누어지는을 제거하고 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 300 X g에서 5 분 스핀 세포.
- 대기음이 완전히 뜨는. 90 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 10 μl를 방지 SCA1-FITC 차 항체를 추가합니다. 잘 믹스와 어둠 속에서 4 ºC에서 10 분 동안 배양한다.
- ml의 버퍼와 원심 분리기 세포 300 X g에서 5 분 1 세포를 씻으십시오. 완전히 뜨는을 제거합니다.
- 80 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 20 μl를 방지 FITC 마이크로 비드를 추가합니다. 잘 믹스와 어둠 속에서 4 ºC에서 15 분 동안 품어.
- ml의 버퍼와 원심 분리기 세포 300 X g에서 5 분 1 세포를 씻으십시오.
- 500 ㎕의 버퍼에 뜨는 및에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
- 자기 홀더에 열을 배치하고 500 μL 버퍼 열을 씻어.
- 칼럼에 세포 현탁액을 추가합니다. 피펫 팅하는 동안 거품을 피하십시오.
- 레이블이없는 SCA1를 수집 - </ SUP> 세포와 500 μL 버퍼로 열 세 번 씻는다. 저수지가 비어있는 경우에만 새로운 버퍼를 추가합니다. 피펫 팅하는 동안 거품을 피하십시오.
- 자기 홀더에서 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다.
- 열 저수지를 통해 공급 플런저를 밀어 SCA1의 +를 컬럼에 버퍼 및 용출 ㎖로 1을 추가합니다.
- 300 X g에서 5 분 동안 세포 분수를 스핀 다운. 1 ml의 배양 배지에 재현 탁 세포.
- 레이블과 레이블이없는 분수에서 10 μL 나누어지는을 제거하고 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 6 웰 플레이트의 1도 각 세포 분획 플레이트.
유동 세포 계측법와 SCA1 높은 ACSS의 면역 자기 분리 6. 확인
- HBSS (-ca, -mg)로 두 번 세포를 씻어 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 떼어 놓다.
- 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. 1 ml의 배양 배지에 재현 탁 된 세포는 혈구를 사용하여 계산.
- 구하는> 10 (6)
- 뜨는 단계를 반복 6.3 두 번 더 제거합니다.
- 2 % 염소 혈청 1 ㎖ + 2 % BSA 및 RT에서 30 분 동안 재현 탁 블록 셀.
- 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포.
- 솔루션을 차단 제거합니다.
- 4 ° C에서 2 % 염소 혈청과 2 % BSA + PBS와 PBS 100 ㎕에, : 또는 항 SCA1 알렉사 플 루어 647 (400 0.25 μg의 1) : 쥐 IgG2a의 알렉사 플 루어 647 (400 0.25 μg의 1) 추가 어둠 속에서 30 분 동안.
- 세포에 차가운 PBS 1 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 300 XG.
- 뜨는 단계를 반복에게 6.9 두 번 더 제거합니다.
- 1 ml의 PBS에 재현 탁 세포. 유세포 분석을위한 준비 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
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Representative Results
다른 지방 패드에서 SCA1 고의 ASC의 농축.
SQ 지방 디스플레이와 같은 섬유 아세포로부터 단리 혈관 간질 세포 SCA1 발현 수준 (도 1a)에 관계없이 셀 형상 뻗어있다. VIS 한편, (EWAT이 유래) 높은 SCA1 및 SCA1 낮은 세포는 세포 형태에 뚜렷한 차이를 보여줍니다. VIS SQ (iWAT 유래) SCA1 높은 세포처럼 VIS SCA1 낮은 세포가 상피 모양을 보여 반면 SCA1 높은 세포, 섬유 아세포와 같은 세포 모양을 뻗어 디스플레이 (EWAT는 유래). SCA1-GFP 마우스에서 분리 SCA1 높은 세포는 쉽게 조직 배양 (그림 1B)에서 GFP 양성 세포로 식별됩니다. 이들 세포는 유동 세포 계측법으로 측정 하였다 때 검출 같이, GFP 양성 세포의 대부분은 세포 표면 SCA1 단백질을 발현하는 것이 확인되었다TI-SCA1 항체 (도 1C). EWAT 파생 SCA1 높은 세포는 기존의 지방 세포 믹스 10 지방 세포로 분화하기 어려운 반면 사타구니 지방 패드에서 파생 된 SCA1 높은 세포는 지방 세포 분화의 용량을 증가 유지한다.
SCA1 고의 ASC의 지방 창고에 의존하는 유전자 발현 (그림 2).
세포 외 기질 단백질과 수정과 관련된 유전자의 농축 입증 게놈 전체의 사체는 RNA 시퀀싱과 분석 (GO : 0031012을, GO : 0005578)를 그 SCA1 고의 ASC 10. PCR 분석을 실시간으로 결합, 우리는 collagenolytic MMPs에 (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) iWAT- 사이 EWAT 파생 SCA1 고의 ASC의 차동 식을 입증 할 수 있었다. 시는 형광 표지 유형 내가 젤은 t를 사용 하였다 콜라겐 오 pericellular 저하의 활동을 평가, 우리는 VIS SCA1 고의 ASC (10)에 의해 매개 현저하게 증가 콜라겐 리모델링 활동을 관찰했다.
그림 1 : 다른 지방 종점에서 쥐 SCA1 고의 ASC의 면역 자기 분리 SQ (iWAT)와 VIS (EWAT)에서 분리 (A) SCA1 높고 SCA1 낮은의 ASC.. 규모 = 100 μm의. (B) 무서-GFP 마우스의 iWAT 분리 SCA1-GFP 세포. 규모 = 100 μm의. 유세포 분류법으로 평가 SCA1-GFP 양성 세포 SCA1의 (C) 세포 표면 발현. (왼쪽) 제어 쥐의 IgG (오른쪽) 항 SCA1 항체. X 축, GFP 강도. Y 축, 토쿠 나가, M. 등 이전에 표시 알렉사 - 플 루어 647 패널 A., (2014).ig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 다른 지방 저장소에서 분리 SCA1 고의 ASC에서 ECM들의 Collagenolytic MMPs에, TIMPs가, 그리고 콜라겐의 지방 창고 의존 식 (A) 차동 유전자 발현 및 ECM 수정. (B) VIS의 증가 콜라겐 분해 활동을 SCA1 고의 ASC를 (EWAT는 유래). 콜라겐의 분해 형광 신호 (화살표와 화살촉)의 실종으로 표시됩니다. 삽입은 SQ의의 ASC의 개별 셀에 의해 매개 초점을 맞춘 콜라겐 분해의 확대 이미지입니다. 세포는 72 시간 동안 배양 하였다. 토쿠 나가, M. 등 이전에 표시된 데이터., (2014). V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.
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Discussion
여기에서 우리는 고립과 다른 지방 패드에서 쥐의 ASC의 면역 자기 세포 분리 및 체외 실험에 사용을 보여줍니다. 제시된 방법의 ASC 9,14의 기술적으로 복잡하고 비싼 FACS 매개 분리를 통해 유리하다 SCA1 양성의 ASC의 많은 수의 빠른 분리에 효과적이다. FACS 달리 면역 자기 세포 분리는 표적 세포 모집단의 확인을위한 여러 항원의 사용을 허용하지 않는다. 표면 항원은 잘 특성화되면 그럼에도, 면역 자기 분리의 이용은 주요 설비없이 여전히 작은 기관에서 많은 생물학적 연구에 쉽게 액세스 할 수없는 FACS 장치 (15)의 사용에 의존하지 않고 분석 될 세포의 수는 증가 .
성공적인 결과를 보장하기 위해 준수해야하는 절차의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. ADIP의 조달마우스 지방 조직 저장소의 분리 수술은 줄기 세포를 필요 OSE 유래. 따라서, 조직 복구의 속도와 정확도가 생세포의 높은 번호를 수득하는 것이 필수적이다. 또한, 깨끗한 수술 분야 및 기기의 유지는 세포와 조직 샘플의 미생물 오염을 방지하여 절차의 결과에 매우 중요합니다. 해부 지방 조직은 효소 타입 II 콜라겐 용액에 해리해야합니다. ECM 조성물은 SQ보다 콜라겐을 함유 VIS SQ와 VIS 지방 패드 10,16 사이에 다릅니다. 따라서, VIS 지방 패드 소화 기간은 SQ 같이 시간의 약 반 정도를 필요로한다. 이 조직의 작은 입자가 여전히 콜라게나 제 용액 내에 존재하더라도 정해진 배양 기간 후, 조직 분해를 중지 좋다. 배양액을 콜라게나 제 활성을 억제하는 추가되면 이들 정보 기계적 피펫으로 분해 될 수있다. 그것이 가능하지만 진행하는직접 면역 자기 정렬에 셀 정렬을 계속하기 전에 약 4 ~ 6 시간 동안 우리 그룹 씨앗, 플라스틱 접시에 1 × 10 6 정렬되지 않은 세포를 SVF 격리를 다음과 같습니다. SVF 분리하는 동안 여러 여과 단계에도 불구하고, 파편은 여전히 세포 현탁액 내에서 존재한다. 면역 자기 세포 분리를 진행하기 전에 세포를 도금하는 것은 따라서 자기 정렬은 단지 지방 세포 전구 세포를 포함하는 세포 부착에 적용 할 수 있도록 거리에 파편과 비 부착 세포를 세척 할 수있는 기회를 제공한다.
SCA1는 인간 게놈에서 발견되지 않지만, 상기 식별이 세포 분리 기술과 함께 지방 저장소 의존성 인간 지방 줄기 세포를 17 일에 발현 다른 세포 표면 항원의 확인은 우리 인간 지방 줄기 세포 생물학을 정의하는 데있다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 (THC에) NIH DK095137에 의해 지원됩니다. 우리는 기술 된 방법의 개발 및 고도화에 기여 현재 전 실험실 구성원 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
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