Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma Published: August 11, 2016 doi: 10.3791/53890

Introduction

Hücre antijeni 1 (SCA1 veya LY6A / e) kök ilk hematopoietik ve mezenkimal kök hücreleri 5,6 ile ifade edilen bir hücre yüzey markerı olarak tespit edilmiştir. Fare yağ depolarından elde edilen yağ dokusu stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fibroblastlar, makrofajlar, vasküler endotelyal hücreler, nöronal hücrelerin ve adiposit progenitör hücrelerin 7 hücrelerinden oluşan heterojen bir popülasyonu. Adiposit progenitör hücreleri veya adipoz kaynaklı kök hücreler (TSK) kollajen zengin perivasküler hücre dışı matriks (ECM) 8 ikamet dışı lipid yüklü hücrelerdir. CD34 +: SCA1 + 9 ve CD29 + - yaklaşık SVF% 50 soy-negatif (Lin) olarak karakterize edilmiştir TSK oluşmaktadır. In vitro adiposit farklılaşması edebilen adiposit ataları, - CD24: bu hücrelerin çoğu Sca1 + 'dır Bununla birlikte, hücrelerin sadece küçük bir kısmı (SVF 0.08%) SCA1 teşkil in vivo koşullarda 9 adipositlere farklılaşma tamamen yetenekli CD24 + hücreler. CD24 gelen CD24 + hücreler demeden Sca1 + SVF kullanarak potansiyel ihtar rağmen - immunomagnetic hücre ayırma kullanarak yağ depolarından SCA1 + TSK, hücreler izole birincil adiposit progenitör hücrelerin hücre özerk fenotip belirlemek için etkili ve pratik bir yaklaşımdır.

Obezite ve diyabet, doku fibrozu ve enflamasyon alanına tip-2 diyabet 3 gelişimi ve korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Son zamanlarda, Tokunaga ve ark. (VIS veya visseral) inguinal (ya da deri altı, SQ) ve perigonadal izole Sca1 yüksek hücreler C57BL6 / J yağ depoları vitro 10 farklı gen imzalar ve ECM biçimlenme sergilerler gösterdi. MMP14 (MT1-MMP), membran-t prototip üyesiYPE matriks metalloproteinaz (MMP) ailesi kolajenolitik aktiviteye 1 ile beyaz adipoz dokuda (WAT) gelişimini aracılık eder.

Aşağıdaki protokol ile izole edilmiş ve zenginleştirilmiş hücreleri ile gerçekleştirilebilir deney örnekleri arasında, üç boyutlu bir kültür, farklılaşma çalışmaları, kolajen alçalmasının tahlilleri ve RNA sıralaması 10,11 bulunmaktadır. Parçalanma deneyleri telopeptit 11,12 korunmasını sağlamak için asit ekstre kollajen ile yapılmalıdır. Aşağıdaki protokol farklı yağ depolarından birincil vasküler stroma hücreleri izole ve immunomagnetic hücre ayırma yöntemi adiposit progenitör hücreler zenginleştirmek için yöntemler gösterecektir. Hücre sıralama geçerliliği akım sitometri ile ve bir Sca1 promotör 13 tarafından tahrik SCA1 + hücrelerde GFP ifade Sca1-GFP fareler kullanılarak yoluyla değerlendirilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Beyanı: Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) (Laboratuar Hayvan Araştırma Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca tüm yöntemleri ve protokolleri onayladı. Fareler bir Michigan Üniversitesi vivari tutulur ve gıda ve suya ücretsiz erişim verildi ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü üzerinde tutulur.

1. hazırlıklar

  1. DMEM,% 10 FBS, 1x P / S / G, ve 1x antibiyotikler / antifungal ile primer kültür ortamı hazırlayın. Bu daha önce sindirime dokuları tutmak için kullanılır. 37 ºC su banyosunda stok ve kısım yerleştirin.
  2. 5 mg / ml (+ Ca, Mg), yağ yastığı her bir tipi için beş fare kadar yalıtıldıktan HBSS içinde çözülmüş tip III kolajenaz çözeltisi, beş mililitre hazırlayın. Tek bir genotipten SQ ve VIS izole edilirken, vahşi tip ve mutant kare olduğu ve VIS, 20 ml yapmak, örneğin, 10 ml yapmak. 7.4 Ste pH ayarlamaFiltreyi rile. 50 ml tüpler içine kısım. kenara ışıktan uzakta ayarlayın.
  3. Cerrahi alan dezenfekte% 70 etanol kullanın. aşağı silin ve mavi ped ile kaplayın. Mavi pad üzerinde bazı etanol püskürtün.
  4. strafor kurulu bir emici ped aşağı pin ve makasla kesme 22 G iğne kullanın. sonra mavi pad üzerinde kurulu ayarlayabilir ve diseksiyon başlamadan kadar başka bir mavi ped ile kaplayın etanol ile pedi püskürtün.
  5. cerrahi alan bitişik bir stand etanol ve yer ile iki 50 ml tüpler doldurun. Etanol makas ve forseps yerleştirin.
  6. cerrahi aletleri etanol kapalı durulama için PBS artı 1x anti-anti başka 50 ml tüp doldurun.
  7. kaputu, her bir doku tipi etiket 60 mm yemekleri ve 37 ºC ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Cerrahi alana bitişik tabak yerleştirin.

Subkütan (SQ) Yağ Pads 2. izolasyonu

  1. izofluran ve pnömotoraks aşırı dozda fare Euthanize.
  2. Nazikçe% 70 etanol ile fare sprey ve sırtüstü yatıyordu. 22 G iğne ile köpük kuruluna pençeleri sabitleyin.
  3. Alt karın derisinde küçük bir kesim yapın. forseps ile kesilen üst Holding, makas almak ve periton cilt ayırmak.
  4. Cilt karından göğüse periton ayrılır sonra, vücudun yan tarafında deride yan keser yaparak uzak kafasına doğru periton cilt yansıtır.
  5. vücuttan uzak kasık yağ tutma kalan cilt yansıtır ve 22 G iğne ile kuruluna aşağı pin.
  6. ince makas ve forseps geçin. periton yakın kökeni forseps ile kasık yağ yastığı tut ve deri ile SQ kirletici kaçınarak kasık doğru ilerleyen deri ve kasık yağ arasında uzak snip.
  7. etiketli 60 mm çanak güneşe maruz kasık yağ yastığı yerleştirin.

Visseral (VIS) Yağ Pads 3. İzolasyon

  1. Benzer bir şekilde, 2.5 adım yağ yastıkları ve bağırsak visseral maruz açık periton kesmek için.
  2. uzakta toraks doğru gut hareket ettirin.
  3. uzak ucunda VIS yağ yastığı tut ve yavaşça yukarı doğru çekin. doku (dişi fareler kullanıyorsanız, ya da rahim) epididimal dışlamak için dikkat ederek VIS yağ yastığı parçalara ayır.
  4. etiketli çanak ve kalan VIS pad adımı yineleyin 3.3 yerleştirin.

Yağ Pads 4. kollajenaz sindirimi

  1. doku kültürü kaputu 60 mm yemekleri taşımak ve medya aspire.
  2. kavisli makas sonra kollajenaz çözüm eklemek ile yağ yastıkları kıyma. etanol ve PBS ile doku tipleri arasındaki makas ve forseps durulama emin olun.
  3. dokular dijeste kadar 300 rpm'de 10-20 dakika boyunca 37 ° C'de çalkalanır. SQ bazı parçaları hala görünür eğer kabul edilebilir. Bu bir sonraki adımda ele alınacaktır.
  4. collag durdurmak için kollajenaz çözeltisine kültür ortamı 25 ml ilave edilir10 ml'lik serolojik pipet ile enase tedavi ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez sindirilmiş dokuları dağıtmak için.
  5. 100 mikron hücre süzgeç kullanarak Gerilme hücreleri. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj.
  6. Dikkatle pelet rahatsız ve yavaşça hücrelerin askıya pipet pelet steril su 5 ml ekleyin ve için medyayı kapalı süzün. eritrositleri lizise uğratmak üzere 2 dakika bekleyin.
  7. yeni bir 100 mikron hücre süzgecinden% 10 FBS ve şekil hücreleri ile ortam 25 ml ilave edilir.
  8. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj. Durusu medya ve kültür ortamı 1 ml tekrar süspansiyon pelet.
  9. 1 tripan mavi: 1 kullanarak bir hemasitometre ile hücre sayımı.
  10. 6 oyuklu bir plaka üzerinde, bir oyuk Levha 1 x 10 6 hücre.

5. Manyetik Hücre Ayırma

  1. Hücre yapışması, yaklaşık 4 ila 6 saat sonra, HBSS (-Ca, -mg) ile iki kez hücreleri yıkayın. % 0.05 tripsin kullanılarak yapışkan hücreleri ayırmak. 1 ml ayırma tamponu ve spin tripsin hücre süspansiyonu seyreltilir300 x g 5 dak.
  2. Süpernatant aspire. 500 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  3. 300 x g, 5 dakika boyunca Spin hücreleri.
  4. Aspire tamamen süpernatanlarına. 90 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul anti-Sca1-FITC ile primer antikor ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
  5. mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın. tamamen süpernatantı.
  6. 80 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
  7. mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın.
  8. 500 ul tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
  9. Manyetik tutucu sütun yerleştirin ve 500 ul tamponu ile sütun yıkayın.
  10. kolonuna hücre süspansiyonu ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının.
  11. Etiketsiz SCA1 toplayın - </ Sup> hücreler ve 500 ul tampon ile kolon 3 kere yıkayın. rezervuar boşken sadece yeni tampon ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının.
  12. manyetik tutucu sütunu çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin.
  13. Kolon rezervuar üzerinden sağlanan pistonu iterek Sca1 + kolona tampon ve Zehir ml 1 ekleyin.
  14. 300 x g'de 5 dakika boyunca hücre kesirler aşağı doğru döndürün. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse hücreleri.
  15. etiketli ve etiketsiz kesirler 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  16. 6 plaka 1 kuyuda her bir hücre fraksiyonu Plate.

Akım Sitometrisi ile Sca1 yüksek ACSS ve İmmunomanyetik Ayrılık 6. Doğrulama

  1. HBSS (-Ca, -MG) ile iki kez hücreleri durulayın ve% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak.
  2. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse edin hücreleri ve hemasitometre kullanarak saymak.
  3. Elde> 10 6
  4. süpernatant ve tekrar adım 6.3 iki kez daha çıkarın.
  5. % 2 keçi serumu, 1 ml +% 2 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir blok ile yeniden süspanse hücreleri.
  6. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri.
  7. çözümü engelleme çıkarın.
  8. 4 ° C'de% 2 keçi serumu ve% 2 BSA + PBS ile 100 ul PBS içinde: ya da anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1): sıçan IgG2a Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1) ekleme karanlıkta 30 dakika karıştırıldı.
  9. hücreler soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje 300 x g.
  10. süpernatant ve tekrar adım 6.9 iki kez daha çıkarın.
  11. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse hücreleri. akım sitometri analizi için hazırlık 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonları iletin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farklı Yağ Pads gelen Sca1 yüksek TSK zenginleştirilmesi.

SQ yağ görüntüleme fibroblast benzeri izole vasküler stromal hücreler SCA1 sentezleme seviyesi (Şekil 1A) bağımsız hücre şekli uzanıyordu. VIS Öte yandan, (eWAT türevi), yüksek Sca1 ve Sca1 düşük hücreleri, hücre şekli belirgin farkı göstermektedir. VIS SQ (IWAT türevi) Sca1 yüksek hücreler gibi VIS Sca1 düşük hücreler epiteloid şekil göstermek ise Sca1 yüksek hücreler, fibroblast benzeri hücre şekli gergin göstermezse (eWAT türevi). Sca1-GFP farelerden izole Sca1 yüksek hücreleri kolayca doku kültürü (Şekil 1B) GFP-pozitif hücreler olarak tanımlanır. Bu hücreler, akış sitometrisi ile değerlendirildiğinde An ile saptanan, GFP pozitif hücrelerinin çoğu hücre yüzeyi üzerinde Sca1 proteinleri ifade etmek için doğrulanmıştırTi-Sca1 antikoru (Şekil 1C). EWAT türetilmiş Sca1 yüksek hücreler, geleneksel adipojenik karışımı 10 adiposit farklılaşması için daha zor ise inguinal yağ yastığı türetilen Sca1 yüksek hücre adiposit farklılaşmasının kapasitesi artmıştır saklamalıdır.

Sca1 yüksek TSK Yağ Deposu bağımlı Gen İfadesi (Şekil 2).

Hücre dışı matriks proteinlerine ve modifiye ile ilişkili genlerin zenginleştirme gösterdi genom çapında transcriptome RNA sıralanması ile analizleri (GO: 0031012, GO: 0005578) bu Sca1 yüksek TSK 10. PCR analizleri gerçek zamanlı ile birleştiğinde, biz kolajenolitik MMP (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) iWAT- arasında eWAT türetilmiş Sca1 yüksek TSK diferansiyel ifadesini göstermek başardık. Tüm floresan işaretli tip jeller t kullanılmıştır kollajen o perisellüler bozulma aktivitesini değerlendirmek, biz VIS Sca1 yüksek TSK 10 aracılığı ile belirgin artmış kollajen remodeling aktivitesini gözlendi.

Şekil 1
Şekil 1: Farklı Yağ Depolarında gelen Fare Sca1 yüksek TSK İmmunomanyetik Ayırma SQ (IWAT) ve VIS (eWAT) izole (A) Sca1 yüksek ve Sca1 düşük TSK.. Ölçek = 100 um. (B) Sca-GFP farelerin IWAT izole Sca1-GFP hücreleri. Ölçek = 100 um. Akış sitometrisi ile değerlendirildi Sca1-GFP pozitif hücrelerde SCA1 (C) hücre yüzeyi ekspresyonu. (Solda), kontrol sıçan IgG (sağda), anti-Sca1 antikor. X ekseni, GFP yoğunluğu. Y-ekseni, Tokunaga, M. ve arkadaşları, daha önce gösterilen Alexa Fluor 647 Panel A., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Farklı yağ depolarından izole Sca1 yüksek TSK içinde ECM'lerin kolajenolitik MMP, TIMP'lerin ve kollagen Yağ Deposu Bağımlı Anlatım (A) Diferansiyel gen ekspresyonu ve ECM düzenleyiciler. (B) VIS Artan kolajen yıkımı aktivitesini Sca1 yüksek TSK (eWAT türevi). kollajen bozulması floresan sinyalleri (oklar ve ok uçları) kaybolması olarak gösterilir. Ankastre SQ TSK bireysel bir hücrenin aracılık ettiği odaklı kolajen degradasyonu büyütülmüş bir görüntüdür. Hücreler, 72 saat boyunca kültürlenmiştir. Tokunaga, M. ve ark önceden gösterilen veriler., (2014). V için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda izolasyon ve farklı yağ pedleri gelen fare TSK immunomagnetic hücre ayırma ve in vitro deneyler için onların kullanımını göstermektedir. Sunulan yöntem TSK 9,14 arasında, teknik olarak karmaşık ve pahalı FACS aracılı izolasyon avantajlıdır Sca1 pozitif TSK sayıda hızlı izolasyonu için etkilidir. FACS aksine immünomanyetik hücre ayırma, bir hedef hücre popülasyonunun belirlenmesine ilişkin birden fazla antijenin kullanılmasına izin vermez. Yüzey antijeni iyi karakterize eğer Bununla birlikte, immunomagnetic ayrılık kullanımı çekirdek tesisleri olmadan hala küçük enstitülerde birçok biyolojik araştırmacılara kolayca erişilebilir değil FACS ekipman 15, kullanımı dayanmadan analiz edilecek hücrelerin sayısı artar .

başarılı bir sonuç sağlamak için uyulması gereken prosedür bazı kritik yönleri vardır. ADIP tedarikFare adipoz doku depoları cerrahi izolasyon kök hücreleri gerektirir ose türetilmiş. Bu yüzden, doku alma hızı ve doğruluğu canlı hücre sayısının yüksek verim şarttır. Buna ek olarak, temiz cerrahi alanları ve araçların bakım, hücre ve doku örneklerinin mikrobiyal kontaminasyonu engelleyerek prosedürün sonucu için çok önemlidir. Dissected adipoz doku, enzimatik olarak bir tip II kolajenaz çözeltisi içinde ayrılmış olmalıdır. ECM, kompozisyon SQ daha az kollagenler içerirler VIS SQ ve VIS yağ pedleri 10,16 arasında değişmektedir. Bu nedenle, VIS yağ yastığı sindirim süresi SQ olarak zaman yaklaşık yarısı gerektirir. Doku küçük parçacıklar de kolajenaz çözeltisi içinde mevcut olsa bile belirtilen bir enkübasyon süresinden sonra, doku sindirim durdurmak için kabul edilebilir. Kültür ortamı kolajenaz aktivitesini inhibe eklendikten sonra bu parçalar mekanik pipetleme ile ayrılabilir. Bu mümkün olsa da devam etmek içindoğrudan immunomagnetic sıralamaya hücre sıralama ile devam etmeden önce yaklaşık 4 ila 6 saat boyunca bizim grup tohumları, plastik plakalar üzerinde 1 x 10 6 sıralanmamış hücreleri SVF izolasyon aşağıdaki. SVF izolasyonu sırasında birden filtrasyon adımlara rağmen, enkaz hala hücre süspansiyonu içinde mevcut olacaktır. immunomagnetic hücre ayırma geçmeden önce kaplama hücreleri böylece manyetik sıralama sadece adipogenic progenitör hücreleri içeren yapışık hücrelere uygulanacak sağlayan, uzak enkaz ve serbest hücreleri yıkamak için bir fırsat sağlar.

Sca1 insan genomunda bulunan olmasa da, kimlik ve bu hücre ayırma tekniği ile birleştiğinde yağ depo bağımlı insan adipoz kök hücreleri 17, ifade alternatif hücre yüzey antijenleri doğrulama, bize insan adipoz kök hücre biyolojisi tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu eser (THC) NIH DK095137 tarafından desteklenmektedir. Biz anlatılan yöntemlerin geliştirilmesine ve gelişmişliği katkıda mevcut ve eski laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004182 Tissue digestion
DMEM Gibco 11965-092 High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x) Gibco 10378-016 Media antibiotic
Anti-anti (100x) Gibco 15240-062 Media antifungal
FBS Gibco 16000-044
PBS (1x, pH 7.4) Gibco 10010-023
Trypsin (0.05%) Gibco 25300-054
Cell strainer BD Bioscience 352360 100-μm cell strainer
60 mm plates BD Falcon 353004
Scissors FST 14001-12 Large
Scissors FST 14091-11 Fine, curved tip
Large Forceps FST 11000-12
Fine Forceps Any vendor
25G 5/8” needles BD 305122
22G 1.5” needles BD 305159
15 ml conical tubes BD Falcon 352097
50 ml conical tubes BD Falcon 352098
MACS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC) Miltenyi Biotec 130-092-529 FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Blue chux pads Fisher 276-12424
Absorbent pads Fisher 19-165-621
Styrofoam board Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647 Invitrogen R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 Invitrogen MSCA21
Rat IgG2a R-PE Invitrogen R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE Invitrogen MF48004
Round-bottom tube BD Falcon 352058
HBSS (–Ca, –Mg) Gibco 14175-095
HBSS (+Ca, +Mg) Gibco 14025-092 For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid Prepare in house12
10x MEM Gibco 11430-030
1 M HEPES Gibco 15630-080
0.34 N NaOH Prepare in house
Cover slips Corning 2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers Invitrogen A-20004
0.89 M NaHCO Gibco 25080-094

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
  2. Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
  3. Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
  4. Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
  5. Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  6. Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
  7. Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
  8. Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  9. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  10. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
  11. Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
  12. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  13. Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
  14. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
  15. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
  16. Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
  17. Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 114 adipogenesis yağ kök hücre ASC ECM kollajen manyetik hücre ayırma MMP preadiposit Sca1 SVF
Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barnes II, R. H., Chun, T. H.More

Barnes II, R. H., Chun, T. H. Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs). J. Vis. Exp. (114), e53890, doi:10.3791/53890 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter