Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

זיהוי סימולטני של הפעלת ג-Fos מאתרים זכו דופמין Mesolimbic ו Mesocortical בעקבות סוכר נאיבי בליעת שומן אצל חולדות

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

מטרת מחקר זה היא לזהות רשתות מוח מופצות הקשורות גמול על ידי התוויית טכניקת immunohistological אמינה באמצעות הפעלת C-FOS הסלולר למדוד לשינוים סימולטניים מסלולי דופאמין ואתרי מסוף לאחר בליעת רומן של שומן וסוכר בחולדות.

Abstract

מחקר זה משתמש הפעלת C-FOS הסלולר להעריך השפעות של בליעת רומן של שומן וסוכר על הדופמין במוח (DA) מסלולים בחולדות. קשר הפוך בין צריכת סוכרים והשומנים מתווכות על ידי האטרקציות המולדות שלהם, כמו גם העדפות לומדים. דופמין במוח, במיוחד-הלימבית טווה ותחזיות-מוחיות טווות מאזור tegmental הגחון (VTA), היה מעורב בשתי תגובות שלא נלמדו ולומדים אלה. הרעיון של רשתות מוח להפיץ, שבו מספר אתרים ומערכות משדר / פפטיד אינטראקציה, הוצע לתווך צריכת מזון טעימה, אבל יש ראיות מוגבלות הוכחת פעולות כאלה באופן אמפירי. לפיכך, צריכת סוכר מעוררת שחרור ועליות DA C-FOS דמוי immunoreactivity (FLI) מאזורי הקרנה פרטיים VTA DA כולל הגרעין הנסמך (NAC), האמיגדלה (איימי) המדיאלי קליפת המוח הקדם חזיתית (mPFC) וכן בסטריאטום הגבי. יתר על כן, הממשל המרכזי של אנטגוניסטים לקולטן DA סלקטיבית לתוך האתר אלהזה להפחית רכישת ביטוי דיפרנציאלי של העדפות טעם מותנות שהושרו על ידי סוכרים או שומנים. גישה אחת שלפיו אפשר לקבוע אם האתרים הללו תקשרו כרשת מוח מופצת בתגובת סוכר או צריכת שומן יהיו בו זמנית להעריך אם VTA ואזורי הקרנת DA mesotelencephalic העיקריים (prelimbic ו mPFC, ליבת פגז infralimbic של NAC, basolateral והמרכזי-cortico-המדיאלי איימי) וכן בסטריאטום הגבה יציג מתואם הפעלת FLI סימולטני לאחר אוראלית, צריכה מותנית של שמן תירס (3.5%), גלוקוז (8%), פרוקטוז (8%) ו סכרין (0.2 %) פתרונות. גישה זו היא צעד ראשון מוצלח בזיהוי הכדאיות של שימוש הפעלת C-FOS הסלולר בו זמנית על פני אתרי מוח רלוונטיים ללמוד למידה הקשורה גמול ב בליעה של מזון טעים במכרסמים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דופמין במוח (DA) היה מעורב בתגובות מרכזיות צריכת סוכרים טעימים דרך מוצע נהנתן 1,2, מאמץ הקשורות 3 והרגל מבוסס 4,5 מנגנוני פעולה. מסלול DA העיקרי מעורב תופעות אלה מקורו באזור tegmental הגחון (VTA), ופרויקטים אל nucleus accumbens (NAC) הליבה פגז, האמיגדלה basolateral והמרכזי-cortico-המדיאלי (איימי), ואת prelimbic המדיאלי infralimbic קליפת המוח הקדם חזיתית (mPFC) (ראה סקירות 6,7). VTA היה מעורב צריכת סוכרוז 8,9, ושחרור DA הוא ציין צריכת הסוכר הבא NAC 10-15, איימי 16,17 ו mPFC 18-20. צריך שומן גם מגרה DA NAC לשחרר 21, ועוד אזור הקרנת DA-עשיר בסטריאטום הגבי (caudate-putamen) נקשר גם עם בתיווך DA האכלת 22,23. קלי 24-27 הציע פרויקט המרובה אלהאזורי יון של מערכת DA בתיווך זה יצר רשת מוח מופצת משולבת אינטראקטיבית באמצעות חיבורים נרחבים ואינטימיים 28-34.

בנוסף ליכולת של אנטגוניסטים לקולטן DA D1 ו- D2 להפחית את צריכת הסוכרים 35-37 ושומנים 38-40, איתות DA גם היה מעורב בתיווך היכולת של סוכרים ושומנים לייצר העדפות הטעם מותנה (CFP) 41- 46. Microinjections של אנטגוניסט לקולטן D1 DA לתוך NAC, איימי או mPFC 47-49 לחסל רכישת CFP שהושרו על ידי גלוקוז intragastric. בעוד microinjections מאחד DA D1 או D2 אנטגוניסטים לקולטן לתוך mPFC מבטלת רכישת פרוקטוז-CFP 50, ברכישה ביטוי של פרוקטוז-CFP נחסמים באופן דיפרנציאלי על ידי היריבים DA ב NAC ואיימי 51,52.

53,54 הטכניקה-פוס ג הועסק לחקור activatio העצביתn המושרה על ידי צריכה טעימה פעילות עצבית. המונח "הפעלת C-FOS" תשמש ברחבי כתב היד, והוא מוגדר על ידי מבצעי שעתוק מוגבר c-Fos במהלך שלילת קוטביות עצבית. צריכת סוכרוז גדל פוס-כמו immunoreactivity (FLI) בגרעין איימי המרכזי, VTA וכן הקליפה, אבל לא הליבה, של NAC 55-57. בעוד צריכת סוכרוז בחולדות-האכלת דמה גדילה משמעותית FLI ב איים ואת NAC, אך לא את VTA 58, חליטות סוכרוז או גלוקוז intragastric גדילה משמעותית FLI ב NAC והגרעינים מרכזיים basolateral של איימי 59,60. חיבור חוזר של סוכרוז גישת צ'או אמורה גדל FLI ב mPFC וכן קליפת NAC ליבת 61. פרדיגמה downshift ריכוז סוכרוז חשפה כי עליות FLI הגדולות שחלו מאיים basolateral ו NAC, אך לא את VTA 62. מיזוג בעקבות, הכחדה של Rewa הטבעי קשור הסוכרהתנהגויות rd גדל FLI ב איימי basolateral ואת NAC 63. יתר על כן, זמין סוכר זיווג לצליל הביא את הטון בהמשך העלאת רמות FLI ב איימי basolateral 64. צריכה עתיר שומן גם גדילת FLI באתרי NAC ו mPFC 65-67.

רוב המחקרים המצוטטים בעבר בחנו סוכר ואפקטי שומן על הפעלת C-FOS אשר אתרי יחיד, אשר אינו מספקים מידע על זיהוי של רשתות מוח מופצות הקשורות גמול 24-27. יתר על כן, רבים מהמחקרים גם לא להתוות את התרומה היחסית של תת תחומים של NAC (הליבה הקליפה), איימי (basolateral ו-המדיאלי מרכזי-cortico) ו mPFC (prelimbic ו infralimbic) כי ניתן היה לבדוק באופן פוטנציאלי על ידי היתרון של רזולוציה מרחבית, תא בודד מצוין במיפוי c-Fos 68. המעבדה שלנו 69 שהיו בשימוש לאחרונה הפעלה C-FOS ושינויים למדוד בו זמנית במסלול VTA DA ופרו שלהאזורי jection (NAC, איימי mPFC) לאחר בליעת רומן של שומנים וסוכרים בחולדות. המחקר הנוכחי מתאר את הצעדים פרוצדורליות מתודולוגיים לנתח בו זמנית האם חשיפה אקוטית עד שישה פתרונות שונים (שמן תירס, גלוקוז, פרוקטוז, סוכרזית, מים פקד תחליב שומן) יפעיל FLI דיפרנציאלי אזורי משנה של NAC, איימי, mPFC וכן בסטריאטום הגבי. זיהוי סימולטני זה של הבדלים מותר אישור של השפעות משמעותיות על FLI בכל אתר ונחישות באשר לשאלה האם שינויים באתר אחד מסוים בקורלציה עם שינויי אתרים קשורים, ובכך לספק תמיכה עבור רשת מוח מופצת 24-27. נהלים אלה נבדקים אם VTA, את prelimbic ו infralimbic mPFC, ליבת הפגז של NAC, ואת איימי basolateral והמרכזי-cortico-המדיאלי) וכן בסטריאטום הגבה יציג מתואם הפעלת FLI סימולטני לאחר צריכה אוראלית, מותנה של גלוקוז (8%), פרוקטוז (8%), שמן תירס (3.5%) ו סכרין (0.2%) פתרונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש המאשר כי כל הנושאים והנהלים עומדים ה- National Institutes of מדריך בריאות לטיפול ושימוש בחי מעבדה.

1. נושאים

  1. זכר רכישה ו / או גזע חולדות Sprague-Dawley (260 - 300 גרם).
  2. חולדות בית בנפרד בכלובים מחוט. לשמור אותם על אור hr 00:12 / חושך מחזור עם צ'או החולדה כרצונך מים זמין.
  3. הקצאת גודל מדגם מתאים (למשל, n ≈ 6 - 8) באופן אקראי לקבוצות.

נהלי מנגנון בדיקה 2. וצריכה

  1. השתמש צינורות צנטריפוגה מכוילים עם פקקי גומי צינור קשית מתכת 45 ° זווית כדי לספק מדידה מדויקת (± 0.1 מיליליטר) של הפתרונים המוצגים. Secure אותם בכלובים הביתה על ידי קפיץ מתכת מתוח כדי לאפשר שקיפות של כיולים.
  2. הגבל מנות מזון (~15 / g / יום) של החולדות כדי להפחית משקל עד 85% ממשקל הגוף המקורי שלהם כדי להגדיל את המוטיבציה לצרוך פתרונות. הערה: הפחתת המשקל צריכה לקחת בין 3 - 5 ימים.
  3. לספק פתרונות מראש אימונים (10 מ"ל) של סכרין 0.2% במשך ארבעה ימים באמצעות הפעלת hr 1 על מנת למקסם את ההסתברות כי חולדות יהיה לטעום את פתרונות בדיקה שלאחר מכן עם קצר חביון (פחות מ 1 דק ').
  4. אשר הזרימה דרך הצינור צנטריפוגות ידי שפיכת כמה טיפות.
  5. לשקול צינורות לפני ואחרי כל פגישה כדי להשיג מדידה צריכה.
  6. בצע בדיקת צריכת ביום החמישי על תת-קבוצות קבלת אחד מששת פתרונות (10 מ"ל, 1 hr): א) מים, ב) רומן בטעם (טעם דובדבן 0.05%) 0.2% סכרין, ג) 8% פרוקטוז, ד) 8 גלוקוז%, ה) שמן תירס 3.5% המרחפים קסנטן 0.3%, ו-ו ') קסנטן 0.3%.
  7. ודא כי הפתרונות התזונתיים הם isocaloric; וכך, ריכוז 3.5% תירס-שמן הוא isocaloric לפתרונות סוכר 8%.
  8. ודא הלפתרונות חולדות מדגמים עם חביון קצר (פחות מ 1 דקה '). אם דרישה זו אינה מתקיימת, ואז להשליך את הנושא מן המחקר.

3. רקמות הכנה

  1. להרדים כל חיה על ידי זריקת intraperitoneal של 90 דקות פנטוברביטול לאחר חשיפה ראשונית לכל פתרון מבחן. ודא חיות מורדמות כראוי על ידי ההוכחה כי החיים אינם מגיבים רפלקסים כגון נסיגת קמצוץ רגל, מהבהב בעקבות לחץ קרני ישיר או נענוע ראש לגירוי פינה עמוק.
  2. Perfuse כל חיה transcardially כפי שתואר לעיל 69.
    1. להרדים חולדות עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital (65 מ"ג / ק"ג), להסיר את בית החזה ולחשוף את החזה לגישה חופשית אל לב 69.
    2. מניחים את מחט הקודקוד של שסתום הלב שמאל וחתך את הווריד הנבוב. נהל פתרון חיץ פוספט (PBS, ~ 180 מ"ל) ואחריו שיתוף מקבע שנאגרו-פוספטntaining paraformaldehyde 4% (~ 180 מ"ל).
    3. להבטיח כי בעל החיים למעשה מתבצע perfused כראוי ידי בדיקה האם הנוזל עוזב חללים אחרים, כמו האף, פה, ואזורי מין. הערה: קיבוע תקין עם paraformaldehyde ילווה תנועות שרירים גדולות. אם זו אינה מתרחשת, להתאים מחדש את המחט עד התגובה הזו מתרחשת.
  3. הסר את המוח מהגולגולת במהירות על ידי חיתוך פרווה ועור מן הגולגולת. השתמש rongeurs לפצח ולהסיר את העצם מהמוח נע האחורי לחזית. עבודה בתחילה באזור שמתחת ומאחורי המוח הקטן, על מנת להבטיח כי rongeur הוא בין עצם הקרום רך קרום המוח. לאחר למעלה ובצדדים של הגולגולת יוסרו, השתמש מרית קטנה כדי להרים את המוח מהבסיס, וחתוך עצבי גולגולת עם מספריים קטנים. היזהר שלא להזיק למוח תוך ניסיון להסיר את העצם.
  4. תקן את המוח בפתרון paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C.מניחים את המוח בתמיסה PBS 30% סוכרוז / 70% בטמפרטורת החדר עד שהם להתיישב בחלק התחתון של המיכל.
  5. חסום את המוח
    1. הסר את החלק המקורי של מוח חיתוך זנב באופן רוחבי נורת חוש הריח.
    2. הסר את חלק הזנב של מוח קיצוץ רוחבי ברמה של המוח הקטן ואת פונס.
  6. הר המוח coronally עם חלק הזנב מקובע בשלב של microtome זזה, וחותכי חלקי עטרה (40 מיקרומטר) דרך mPFC (2.86-2.20 מ"מ המקורי גבחת), ליבת NAC בסטריאטום פגז הגבי (+ 1.76 - +1,60 מ"מ מקורי גבחת), איימי (-2.12 - -2.92 מ"מ הזנב גבחת), ואת VTA (-5.20 - -5.60 מ"מ הזנב גבחת). השתמש אטלס מוח עכברוש 70 להדרכה.
  7. אסוף סעיפים חופשיים צף לתוך בארות בודדות של צלחת 24 גם מלא PBS לניתוח immunohistochemical סופי 71. השתמש Parafilm לאטום את 24 אנחנוצלחת ll לוודא את PBS לא להתאדות במיכל ולייבש את המוח. אחסן את רקמת המוח ב- C ° 4.

4. הליכים-פוס ג (מעובד מתוך 71)

  1. פנקו כל קטע עם 5 מ"ל של 5% רגילה עיזים סרום 0.2% Triton X-100 ב PBS עבור שעה 1.
  2. דגירה סעיפים שטופלו נוגדנים ראשוניים (-FOS אנטי-ג ארנב, 1: 5,000) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 36 שעות בבארות המכילה 1 מ"ל של PBS.
  3. חלקים לשטוף 3x עם PBS (5 מ"ל) במשך 10 דקות כל אחד.
  4. דגירה עם נוגדנים משני (ארנב נגד עז biotinylated; 1: 200) ב RT עבור שעה 2 ב בארות המכיל 1 מ"ל של PBS.
  5. יש לשטוף כל 3x סעיף ב PBS (5 מ"ל) במשך 10 דקות כל אחד.
  6. דגירת הסעיפים השטופים עבור שעה 2 בתערובת peroxidase avidin-חזרת זמינה מסחרי שמגיעה ערכה המורכבת DH Avadin (100 μl) ו Biotinylated חזרה Peroxidase H (100 μl) ב 5 מיליליטר של PBS.
  7. Re-לשטוף את הסעיפים 3x ב PBS (5 מ"ל) במשך 10 דקות כל אחד.
  8. מגיב את החלקים עם 0.05% diaminobenzidine (DAB) בנוכחות של 0.0015% H 2 O 2 עבור 5 - 10 דקות, תלוי תגובתיות של רקמות בארות המכילות 5 מיליליטר של פתרון DAB.
  9. פעמיים תווית בסעיפים VTA. דגירה אותם עם נוגדן hydroxylase טירוזין (TH) (TH אנטי עכברוש ארנב, 1: 2,000) ב PBS (5 מ"ל) לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. לשטוף חלקים 3x ב PBS (5 מ"ל) במשך 10 דקות כל אחד.
  11. דגירה עם נוגדנים משני (ארנב נגד עז biotinylated; 1: 200) ב- PBS (5 מ"ל) בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
  12. לשטוף חלקים 3x ב PBS (5 מ"ל) במשך 10 דקות כל אחד.
  13. דמיינו את הנוגדנים באמצעות קומפלקס נוגדן-peroxidase משני. מגיב עם שילוב של 0.05% DAB ופתרון סולפט ניקל 0.3%, עבור 5 - 10 דקות, תלוי את התגובה של רקמות בארות המכילות 5 מיליליטר של פתרון DAB / NiCl.
  14. ודא כי פתרון DAB הוא ירוק בהיר חלבי בצבע ממנותגובתו עם סולפט ניקל 0.3%. אם הפתרון הוא ירוק מדי, אז התגובה תהיה כהה מדי.
  15. הר את כל החלקים על גבי שקופיות ג'לטין מצופה. תנו להם לילה יבש, ולאחר מכן לכסות החלקה עם כמה טיפות של תמיסת טולואן מבוסס (TBS).
  16. קוד מחליק כך תנאי הניסוי אינו ידוע המשקיפים.

קביעת 5.-פוס ג immunoreactive ספירות

  1. הקצאת זוגות משקיפים משוחד לספור נוירונים Fos-חיוביים באזורים אלה של עניין (ROI): prelimbic mPFC, infralimbic mPFC, ליבת NAC, פגז NAC, גרעינים איימו basolateral, איימי המרכזי-מדיאלית-cortico, בסטריאטום הגבי, ו VTA. להתוות אם immunoreactivity c-Fos נכח TH + ו- TH- תאי VTA. איור 1 מספקת תמונה של תמונת מסך של NAC מן מיקרוסקופ.

איור 1
אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. לנתח לפחות שלוש פרוסות נציג לכל אתר משותף לכל בעלי החיים בכל תנאי הבדיקה.
  2. השתמש בתוכנה ו מיקרוסקופ אופטי כדי לנתח את האזור כולו עבור כל ROI על ידי התחקות מתווה (איור 1).
    1. עבור אתר נתון, פתח את היישום ולחץ על התפריט הנפתח רכישת ולחץ על "תמונה חיה". תביא את ההחזר על ההשקעה אל מוקד ולחץ על המסך כדי להקים נקודת התייחסות. ואז trאס באזור המוח נבחר באמצעות הרשת כמדריך. לאחר השמץ הושלם, לספור תאים (שלבי 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה. עבור אל בשורת התפריטים, לחץ על "רכישה" ולאחר מכן "תמונה חיה". תביא את ההחזר על ההשקעה אל מוקד ולחץ על המסך כדי להקים נקודת התייחסות.
      2. עבור אל סרגל הכלים הרשת ולחץ על "רשת המדיה '" תוויות רשת השימוש ". התווה את ההחזר על ההשקעה בשמץ מראש.
      3. לספור את כל התאים בכל אזור ROI, לבחור "+" בסרגל הצדדי ביד שמאל לשמור ספירה של תאים C-FOS. לחץ על כל תא בנפרד לרשום ספירות. חשבתי על תא חיובי-פוס ג כאשר העיגול אדום כהה מוגדר הוא ציין (איור 1).
    2. חזור על תהליך זה עבור כל אתר.
    3. שיא סופרת במחברת המעבדה במחשב לצורך ניתוח עתידי. עבור אל בשורת התפריטים, לחץ על "קובץ", "נתונים על שמירת קובץ" כדי לשמור את העקיבה וספירת.
    4. ודא כי אמינות בין מדרג (באמצעות מתאם של ספירות) של שני מדרגים מיודעים עבור כל מקטע בכל ROI תמיד עולה 0.8.

    6. סטטיסטיקה

    1. הערכת צריכת סוכרזית הבסיס במהלך ארבעת הימים הראשונים באמצעות ניתוח חזר אמצעים 1 כיוונית של שונות (ANOVA) השוואת צריכת סוכרזית של 1 ימים, 2, 3 ו -4 69.
    2. השוואת צריכת סכרין (יום 4) עם צריכת הבדיקה (יום 5) של שש קבוצות באמצעות 69 אקראיים-בלוק 2-way ANOVA.
    3. השתמש השוואות Tukey (p <0.05) כדי לקבוע השפעות משמעותיות פרט 69.
    4. לקבוע אמינות בין-rater, ולאחר מכן להשתמש ספירת צופה משותף.
    5. C-FOS ממוצע ספירה לשלוש פרוסות הנציג עבור כל אתר 69.
      1. בצע 1-way ANOVA של הפעלת C-FOS המושרה על ידי צריך מששת הפתרונים (שמן תירס 3.5%, גלוקוז 8%, 8% פרוקטוז, 0.2% בטעם סכרין, XAמלאת מי מסטיק Nthan) עבור perilimbic mPFC 69.
      2. ניתוחים מקבילים חזרו שש הקבוצות עבור infralimbic mPFC, ליבת NAC, פגז NAC, basolateral איימי, איימי המרכזי-מדיאלית-cortico, VTA בסטריאטום הגבה. השתמש השוואות Tukey (p <0.05) כדי לחשוף השפעות משמעותיות פרט 69.
    6. השוואת צריכת שמן תירס עם צריכת מים הוא וצריכה של סוכן ההשעיה שלו, קסנטן. השוואת צריכת פרוקטוז וגלוקוז בשתי מצריכת מים וצריך של סכרין, הממתיק שאינו תזונתי.
    7. לקבוע אם קשר משמעותי בין צריכת פתרון והפעלה פוס-ג בכל האתרים נצפה באמצעות מתאמי r Bonferroni (p <0.05).
      1. באופן שיטתי להשוות ספירת פוס-C perilimbic ואת קליפת המוח הקדם חזיתית infralimbic עבור כל חיה בקבוצה שמן תירס 3.5%.
      2. חזור על ניתוחים במקביל שיטתי של כל זוג אחד מששת האתרים (VTA, בסטריאטום הגבי, infralimmPFC BIC, perilimbic mPFC, הליבה NAC, פגז NAC, איימי basolateral, איימי מרכזי-cortico-המדיאלי) עבור שמן תירס 3.5%.
      3. חזור על ניתוחים במקביל שיטתי של ששת אתרים אלה במשך החמישה התנאים הצריכים הניסיוניים האחרים (גלוקוז 8%, 8% פרוקטוז, 0.2% סוכרזית בטעמים, בקרת קסנטן ומים).
    8. נצלו את העובדה שאותו החיות בתוך מצב פתרון הוערכו בכל האתרים על ידי קביעת קיומו של קשר מובהק בין הפעלת C-FOS על פני פתרונות ובתוך כל פתרון באמצעות Bonferroni r מתאמים (p <0.05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל תוצאות הנציג המתואר להלן פורסמו בעבר 69, והם מחדש המוצגים כאן כדי לתמוך "הוכחה של מושג" ב המציין את האפקטיביות של הטכניקה.

צריכת פתרון
הבדלים משמעותיים צריכת סוכרזית הבסיס נצפו במהלך ארבעת הימים הראשונים עבור כל בעלי החיים (F (3,108) = 57.27, p <0.001) עם צריכת (יום 1: 1.3 (± 0.2) מ"ל; יום 2: 3.9 (± 0.4) מ"ל ; יום 3: 5.9 (± 0.6) מ"ל; יום 4: 7.1 (± 0.6) מ"ל) באופן משמעותי (p <0.05, מבחן Tukey HSD) והגדלת בהדרגה. פרוקטוזה וצריכת גלוקוז, אך לא שמן תירס או סכרין צריכה ביום 5 משמעותי (p <0.05, מבחן Tukey HSD) עלה ביחס צריכת סוכרזית יום 4 (p <0.05, Tukey HSD בדיקה) עם פרוקטוז (9.6 (± 0.4) מיליליטר וגלוקוז) (9.4 (± 0.6) מ"ל) גבוה משמעותית משיעור saccצריכת Harin. יתר על כן, צריכת שמן תירס (7.4 (± 0.6) מ"ל) היה גבוה באופן מובהק (p <0.05, מבחן Tukey HSD) גבוה יותר מאשר צריכת קסנטן.

תוצאות אלו העלו את האפשרות כי צריכת פתרון כשלעצמו עשוי להסביר את כל הפעלה C-FOS הנצפה בכל האתרים. כדי לבחון זאת, מתאמי r Bonferroni בוצעו בם צריכה של החמישה הפתרונים הייתה קשורה הפעלה-פוס ג בכל אחד מששת האתרים. קשרים מובהקים הצליחו להבחין בין צריכת פתרון והפעלה פוס-ג בגלעין (r (29) = 0.186), מעטפת (r (29) = 0.029) או מלא (r (29) = 0.10) NAC, את prelimbic ( r (29) = 0.23), infralimbic (r (29) = 0.30) או מלא (r (29) = 0.14) mPFC, את VTA (r (29) = 0.10), בסטריאטום הגבי (r (29) = 0.14 ) או איימי basolateral (r (29) = 0.47), את centro-cortico-המדיאלי (r (29) = 0.48) או מלא (r (29) = 0,409). בהתחשב המתאם הגבוה בין הצריכה והפעלת C-FOS איימי, correla נוסףמשא בוצע עבור כל פתרון יחיד. המשמעותי (p <0.05, Tukey HSD בדיקה) מערכות יחסים כושלים שיש לקיימה בין צריכה ואיים FLI עבור פרוקטוז (basolateral (r = 0.15), centro-cortico-המדיאלי (r = 0.13), סך הכל (r = 0.13)), גלוקוז (basolateral (r = 0.17), centro-cortico-המדיאלי (r = 0.17), r הכולל = 0.13)), סכרין (basolateral (r = 0.42), centro-cortico-המדיאלי (r = 0.42), סך הכל (r = 0.42)) או שמן תירס (basolateral (r = 0.54), centro-cortico-המדיאלי (r = 0.59), סך הכל (r = 0.64)). A (p <0.05, מבחן Tukey HSD) משמעותי מתאם שלילי נצפה בין צריכת קסנטן ואת FLI איימי הכולל (r = 0.94).

c-Fos mPFC הפעלה
שמן תירס משמעותי (p <0.05, מבחן Tukey HSD) הכולל גדל (איור 2 א), infralimbic (איור 2 ב) ו prelimbic (איור 2 ג) mPFC c-Fos סופר ביחס למים (*) או באמצעות שלט קסנטן(#). פרוקטוז משמעותית (p <0.05, Tukey HSD הבדיקה) עלה ספירת ג-FOS אשר ביחס mPFC infralimbic למים (*) או סוכרזית (+) (איור 2 ב), אבל לא ספירת mPFC מוחלט או prelimbic. לעומת זאת, גלוקוז או סכרין הצליח לשנות mPFC הכולל, perilimbic או infralimbic ספירת c-Fos. איור 3 מציג נציג קטעי mPFC של חיות מראה יחסית FLI תירס גדל נגרמת שמן למים.

איור 2
צריכת איור 2. שומן או סוכר דיפרנציאלי מגדילה הפעלת פוס-ג בקורטקס הפרה-פרונטלי המדיאלי (mPFC). שינויים הפעלה C-FOS (ממוצע ± SEM), כפי שמראה mPFC כולו (לוח א '), באזור mPFC infralimbic (לוח B), ואת שטח mPFC prelimbic (לוח ג) הצריכה הבאה (1 hr) של מים, סכרין (0.2%), קסנטן (שליטה על שמן תירס), גלוקוז (8%), פרוקטוז (8%) או שמן תירס (3.5%). (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. בפועל mPFC C-FOS הפעיל בעקבות שומנים וסוכרים. C-FOS הפעלה נצפתה בבעלי חיים החשופים לגורמי צריכת שמן תירס (לוחות A (פי 4 גדלה) ו- C (פי 10 הגדלה)) כי היה גדול יותר משמעותי מזו של צריכת (B פאנלים (הגדלה פי 4) ו- D (פי 10 ההגדלה)) מים. ייצוג של תת-באיזורים המסומנים של Prelimbic (PL) ו infralimbic (IL) mPFC הם שרטט ב לוחות (שמן תירס) ו- C (מים) וכך גם חלק tלוחות צינור (A ו- C) מוגדל הגדלה של פי 10 בתוך הלוחות המקבילים (B ו- D). חצי הפנלים C ו- D עולים תאים חיוביים C-FOS נציג. כל ברי הסולם הם 100 מיקרומטר. (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

C-Fos איימי הפעלה
שמן תירס משמעותי (p <0.05, Tukey HSD בדיקה) עלה איימי הכולל (איור 4 א), basolateral (איור 4B) ו-המדיאלי מרכזי-cortico (איור 4C) איימו תת תחום c-Fos סופר ביחס למים (*) או השליטה קסנטן (#). גלוקוז גם באופן משמעותי (p <0.05, Tukey HSD הבדיקה) הכולל גדל (איור 4 א), basolateral (איור 4B) ומרכז-cortico-המדיאלי ( (איור 4 א) ו-תת תחום-המדיאלי מרכזי-cortico (4C איור) של איימי c-Fos סופרת ביחס למים (*) או סוכרזית (+), אבל לא איים תת התחום basolateral. סכרין הצליחו לשנות הכל, basolateral או מרכזי-cortico-המדיאלי איימי c-Fos סופרת ביחס למים. ניתוח מדוקדק של גרעינים בודדים בתוך איימי גילה כי השינויים המשמעותיים ציינו באזור basolateral של איימי נרשמו גם הגרעינים איימו basolateral לרוחב הפרט. השינויים המשמעותיים ציינו באזור המרכז-מדיאלית-cortico של איימי צוינו גם מרכזי הפרט, קליפת המוח המדיאלי איימו גרעינים. איור 5 מציג קטעים איימו נציגחי מראה שמן תירס גדל, glucose-, ויחסית FLI-induced פרוקטוז למים. (שפורסם בעבר 69.)

איור 4
צריכת איור 4. שומן או סוכר דיפרנציאלי מגדילת הפעלת פוס-ג באמיגדלה (איימי). שינויי הפעלת C-FOS (ממוצע ± SEM), כפי שמראה מאיים כולו (לוח א '), באזור איימי basolateral (לוח ב') , ואזור איימי המרכזי-מדיאלית-cortico (לוח ג) בעקבות צריכה (1 hr) של מים, סוכרזית, קסנטן, גלוקוז, פרוקטוז או שמן תירס. השינויים המשמעותיים ציינו באזור basolateral של איימי נרשמו גם הגרעינים איימו basolateral לרוחב הפרט. השינויים המשמעותיים ציין באזור המרכז-מדיאלית-cortico של איימי נרשמו גם הגרעינים מרכזי הפרט, קליפת המוח המדיאלי איימי. (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
C-FOS איימו בפועל איור 5. הפעלה בעקבות שומנים וסוכרים. הפעלת C-FOS נצפתה בבעלי חיים החשופים לגורמי קשר הפוכים בין צריכת שמן תירס (לוחות (פי 4 גדלה), D (פי 10 הגדלה) ו- G (60 ההגדלה לקפל)), גלוקוז (לוחות B (פי 4 הגדלה) ו- E (הגדלה של פי 10)), ופרוקטוז (C פאנלים (הגדלה פי 4) ו- F (פי 10)) כי הייתה גדולה יותר משמעותית מזה של צריכת (H פאנלים (הגדלה פי 4) ואני (הגדלה של פי 10)) מים. ייצוגהמשנה באיזורים המסומנים של-מדיאלית-cortico המרכזי (CMC) ואת איימי (BLA) basolateral הם שרטט ב לוחות (שמן תירס), B (גלוקוז), C (פרוקטוז) ו- H (מים) וכך גם חלק לוחות אלה (A, B, C ו- H) מוגדל הגדלת to10 של פי לוחות המקבילים (D, E, F ואני). The-תת תחום שמסומן בלוח D (שמן תירס, הגדלה של פי 10) מוגדל הגדלה פי 60 בלוח ד חצים פאנלים D, E, F, G ואני עולה תאים חיוביים C-FOS נציג. כל ברי הסולם הם 100 מיקרומטר, למעט לוח G (50 מיקרומטר). (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

C-Fos NAC הפעלה
שמן תירס משמעותי (p <0.05, Tukey HSD בדיקה) הכולל גדל (איור 6 א) ו ליבה ( (איור 6 ג). גלוקוז באופן משמעותי (p <0.05, Tukey HSD הבדיקה) עלה ספירת c-Fos בליבת NAC (איור 6), אך לא NAC הכולל או ביחס פגז NAC כדי סכרין (+) או מים (*). לעומת זאת, פרוקטוז סכרין לא נבדלים המים לעורר ההפעלה c-Fos בליבת NAC ו / או פגז. איור 7 מציג קטעים נציג בליבה של חיות NAC מראה שמן תירס גדל או קרוב משפחה FLI-induced גלוקוז למים .

איור 6
צריכת איור 6. שומן או סוכר דיפרנציאלי מגדילת הפעלת פוס-ג ב NAC. שינויי הפעלת C-FOS (ממוצע ± SEM) ב NAC כולו (לוח א '), ליבת NAC (לוח ב'), ואת קליפת NAC (לוח ג) בעקבות צריכה (1 hr) של מים, סוכרזית, קסנטן, גלוקוז, פרוקטוז או שמן תירס. (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. בפועל Core NAC, אבל לא NAC מעטפת ההפעלה פוס-ג בעקבות שומנים וסוכרים. הפעלה C-FOS נצפתה בבעלי חיים החשופים לגורמים קשר הפוך בין צריכת שמן תירס (לוחות (פי 4 הגדלה), D (הגדלה פי 10 ) ו- G (הגדלה פי 60)) וגלוקוז (לוחות B (פי 4 הגדלה) ו- E (הגדלה של פי 10)) כי הייתה גדולה יותר משמעותית מזו של צריכת מים (C פאנלים (הגדלה של פי 4) ו F (פי 10 Magnification)). ייצוג של תת-באיזורים המסומנים של הליבה NAC ואת הקליפה NAC הם שרטט ב לוחות (שמן תירס), B (גלוקוז) ו- C (מים) וכך גם חלק לוחות אלה (A, B, C ו- H) הגדלת to10 פי מוגדלת של לוחות המקבילים (D, E ו- F). The-תת תחום שמסומן בלוח D (שמן תירס, הגדלה של פי 10) מוגדל הגדלה פי 60 בלוח ג חצים פאנלים D, E, F ו- G מצביעים תאים חיוביים C-FOS נציג. כל ברי הסולם הם 100 מיקרומטר. (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגבי של הסטריאטום c-Fos ההפעלה
שמן תירס משמעותי (p <0.05, Tukey HSD בדיקה) עלה c-Fos סעיפי ביחס בסטריאטום הגבה למים (*) או קסנטן (#) (Figurדואר 8A). גלוקוז או פרוקטוז משמעותי (p <0.05, מבחן Tukey HSD) עלה ביחס FLI מגבה של הסטריאטום כדי סכרין (+) (איור 8 א). לעומת זאת, סכרין לא נבדל מים לעורר הפעלה של הסטריאטום גב c-Fos. איור 9 מציג הגבה נציגי סעיפי striatal של חי מראה שמן תירס גדל, glucose- או פרוקטוז-induced ביחס FLI למים.

הספרה 8
צריכת איור 8. שומן או סוכר דיפרנציאלי מגדילת הפעלת פוס-ג הגבה בסטריאטום ו גחון tegmental הפינה. הגבי atriatal (לוח א ') ואזור tegmental גחון (לוח ב') שינויים צוינו עבור הפעלת פוס-ג (ממוצע ± SEM) הבא הצריכה (1 hr) של מים, סוכרזית, קסנטן, גלוקוז, פרוקטוז או שמן תירס. (שפורסם בעבר 69.)

איור 9
איור 9. striatal הגבי בפועל C-FOS הפעלת בעקבות שומנים וסוכרים. הפעלה C-FOS נצפתה בבעלי חיים החשופים לגורמים קשר הפוך בין צריכת שמן תירס (לוחות (פי 4 הגדלה), D (פי 10 ההגדלה) ו- G (60 ההגדלה -fold)), גלוקוז (לוחות B (פי 4 הגדלה) ו- E (הגדלה של פי 10)), פרוקטוז (פאנלים C (פי 4 הגדלה) ו- F (הגדלה של פי 10)) כי הייתה גדולה יותר משמעותית מזו של צריכת מים (H פאנלים (פי 4 הגדלה) ואני (הגדלה של פי 10)). תת-a שמסומןreas של בסטריאטום הגבה ב לוחות (שמן תירס), B (גלוקוז), C (פרוקטוז) ו- H (מים) מסומן כי מוגדל הגדלת to10 של פי לוחות המקבילים (D, E, F ואני). The-תת תחום שמסומן בלוח D (שמן תירס, הגדלה של פי 10) מוגדל הגדלה פי 60 בלוח ג חצים פאנלים D, E, F ו- G מצביעים תאים חיוביים C-FOS נציג. כל ברי הסולם הם 100 מיקרומטר, למעט לוח G (50 מיקרומטר). (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

C-Fos VTA הפעלה
שמן תירס משמעותי (p <0.05, Tukey HSD בדיקה) עלה ספירת c-Fos ב TH + VTA תאים ביחס לשליטת קסנטן (#) (איור 8B). לעומת זאת, גלוקוז, פרוקטוז או סכרין הצליח לשנות סעיפים ג-FOS אשר ביחס VTA למים. איור 10 מציג נציג ביחס FLI TH + ו- TH- ו- c-Fos המופעל VTA תאים של בעלי חיים מראים תירס גדל נגרמת שמן למים.

איור 10
איור 10. הפעלת C-FOS פינת הגחון tegmental בפועל בעקבות שומנים וסוכרים. VTA הפעלה C-FOS נצפתה בבעלי חיים החשופים לגורמים שמן תירס (לוחות (פי 4) ו- C (פי 10)) ומים (B פאנלים (פי 4) ו- D (פי 10)). חיצים שחורים מצביעים פעמים שכותרתו נציג תאים TH / C-FOS חיובית, בעוד חצים אפורים מציינים תאי C-FOS נציג יחיד. כל ברי הסולם הם 100 מיקרומטר. (פורסם בעבר 69.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> יחסים של הפעלת ג-Fos בין אתרים ופתרונות
דפוס הפעולה של ספירת c-Fos בחיות חשופה לשמן תירס חשף משמעותי (p <0.05) מתאמים חיוביים בין הליבה NAC ואו הקליפה NAC (r = 0.971) או כולו mPFC (r = 0.670), בין mPFC prelimbic ו גם בסטריאטום mPFC (r = 0.940) או הגבי infralimbic (r = 0.849), בין בסטריאטום mPFC ועל הגב infralimbic (r = 0.749), בין איימי basolateral והמרכזי-cortico-המדיאלי (r = 0.999), ובין הסטריאטום הגב ואת VTA (r = 0.723). לעומת זאת, דפוס של ספירת c-Fos בחיות חשופה לשמן תירס חשף משמעותי (p <0.05) מתאמים שליליים בין איימי basolateral ואו הליבה NAC (r = -0.712) או פגז (r = -0.708), ו בין איימי מרכזי-מדיאלית-cortico ואו הליבה NAC (r = -0.712) או פגז (r = -0.710) .the דפוס של c-Fos סופרת בדואר חיותXposed לגלוקוז חשף משמעותי (p <0.05) מתאמים חיוביים בין prelimbic ו infralimbic mPFC (r = 0.930), בין בסטריאטום הגבי ואו VTA (r = 0.821), basolateral (r = 0.910) או-cortico-המדיאלי המרכזי (r = 0.911) איים, ובין-המדיאלי המרכזי-cortico basolateral ו (r = 0.999) איים. דפוס הפעולה של ספירת c-Fos בבעלי חיים החשופים לגורמי פרוקטוז חשף משמעותיים (p <0.05) מתאמים חיוביים בין ליבת NAC ואו קליפת NAC (r = 0.969) או prelimbic mPFC (r = 0.740), בין קליפת NAC ואת prelimbic mPFC (r = 0.733), בין prelimbic ו infralimbic mPFC (r = 0.959), ובין איימי basolateral והמרכזי-cortico-המדיאלי (r = 0.996) .the דפוס של ספירת c-Fos בבעלי חיים החשופים לגורמים סכרין גילה משמעותי (p <0.05) מתאמים חיוביים בין ליבת NAC ופצצות NAC (r = 0.792), בין בסטריאטום הפגז ועל גב NAC (r = 0.715), ובין א mPFC prelimbicnd infralimbic mPFC (r = 0.999).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מטרת המחקר הייתה לקבוע אם המקור (VTA) ומטרות הקרנת המוח קדמיות (NAC, איימי, mPFC) של נוירונים גמול הקשורות DA הופעלו בו זמנית לאחר בליעת רומן של שומן וסוכר בחולדות באמצעות טכניקת הסלולר C-FOS . המחקר הנוכחי הוא תיאור מפורט של הפרוטוקולים של מחקר שפורסם בעבר 69. זה היה שיערו כי VTA, אזורי השלכה העיקרי שלה אל prelimbic ו infralimbic mPFC, הליבה פגז של NAC ואת basolateral ואיימי מרכזי-cortico-המדיאלי, וכן בסטריאטום הגבי תפעל כרשת המוח מופץ 24 -27, ולהציג מתואם FLI סימולטני לאחר צריכת הרומן של גלוקוז (8%), פרוקטוז (8%) או שמן תירס (3.5%) פתרונות ביחס סכרין (0.2%), מים ופתרונות בקרה אחרים. שמן תירס, גלוקוזה ופרוקטוזה, אבל לא סכרין הפעלת FLI משמעותי הפרש צריך פיק של VTA, את prelimbic ו infralimbic MPFC, הליבה פגז של NAC, איימי basolateral והמרכזי-cortico-המדיאלי, ואת בסטריאטום הגבי. בנוסף לטכניקה פוס-ג, אמצעי התנהגותיים של סוכר, שומן וצריכת ממתיק מלאכותי הועסקו.

שלב קריטי אחד כלל דגימה בזמן של צריכה כזה שהם יהיו שווים יחסית, ובכך להבטיח כי כל הבדלי הפעלת C-FOS פני אתרים נבעו הפתרון להישרף או לייתר דיוק את התבנית או עוצמת היניקה. ארבעת הימים של צריכת סוכרזית הבסיס הבטיחו כי חיות-מוגבל מזון שנדגמו הפתרונות במהירות, ובכך למזער תופעות הלא ספציפית. שלב קריטי שני היה כי הנוהל שנגרם מתח או חידוש מינימאלי חיות כשינויים עצמאיים ערכיות רגשית מסוג צריך גם יכולים לייצר הפעלת C-FOS. לכן, הממצאים מספקים "הוכחה של מושג" משכנעת את האפקטיביות של גישה זו ופרוטוקולים הקשוריםלזהות האם חשיפה אקוטית לשומן (למשל, שמן תירס), סוכר (גלוקוז ופרוקטוז) פתרונות שאינם תזונתי ממתיק (סוכרזית) בו זמנית להפעיל ROI בתיווך DA של באופן מרמז על מערכת מוח מופצת מתואמת 24-27.

בגלל הפעלה האופטימלי c-Fos דורשת תגובות זמן רגיש לפני להקריב 51,52, נהלים תוקף בעבר 42,44 דגימת פתרון מוגדל עם חביון קצר במבחן 1-hr. לפיכך, חולדות מוגבל מזון אומנו פתרונות סכרין 0.2% (10 מ"ל, 1 hr) במשך 4 ימים, ובהינתן פתרון המבחן ביום החמישי. צריכת סוכרזית Baseline משמעותית ומתמשך גדלה, פרוקטוז וגלוקוז, אך לא צריכים שמן תירס או סוכרזית ביום החמישי היו גבוהים יותר משמעותי מאשר צריכת סכרין היום הרביעי. לפיכך, פתרונות הקשורים FLI גדל גדל באופן משמעותי (גלוקוז, פרוקטוז) או לא הצליח להשפיע (שמן תירס) מחדש צריכהlative לאימון סכרין הקודמת, ועשיתי כאילו שאני בתיווך באמצעות מנגנון תמריץ התנהגותי הקשורות גמול. בחינה קפדנית צריכה לנקוט על מנת להבטיח דגימה ושוויון של התנהגות. חוקרים אחרים יכולים להשתמש ביעילות בהליך זה כדי לחקור סוגים אחרים של פתרונות חדשניים או להציג וריאציות בפרדיגמה להבין מנגנונים הקשורים להסתגלות ולמידה.

היתרון של הפרוטוקול הנוכחי הוא היכולת להשוות אפקטים של סוכרים היטב למדו (פרוקטוז, גלוקוז) ושומנים (שמן תירס) ולהשוות C-FOS הפעיל אפקטים שלהם עם יותר של פקדים חשובים (הממתיק שאינו תזונתי, סכרין, מתחלב שליטה, קסנטן, ומים), ולאחר מכן לבחון את ההשפעות הללו על פני שישה באזורי מוח קשורים. למרות גישה זו יש יתרונות ברורים אשר מאפשר בחינה בו זמנית על פני אתרי מוח של חומרים טעימים השונים, יש לו את החסרון של הפקת ערכת נתונים אסטרונומיים פוטנציאלישל תאים המציגים ביטוי עצבי. כדי להפוך את זה יותר לניהול, לקחנו את הגישה של ניתוח שלוש פרוסות עטרת נציג לכל אתר משותף לכל בעלי החיים בכל תנאי הבדיקה. זה כמובן מלווה האזהרה של בחירת הרמות המתאימות של כל ROI בשלושת סעיפים אלה. בהינתן היקף rostro- הזנב רחב של הסטריאטום איימי, NAC, mPFC, הגבי ו VTA, אזהרה זה לא צריך לזלזל. יתר על כן, אז זה חובה על החוקרים להיות עקבית בבחירה במדויק כל אחד מהשלושה הסעיפים נציג בכל החיים ברחבי כל האתרים. טעויות קלות בבחירה זה יכול להוביל "false positives" ו "שלילי שווא". יעילות הספירה גם הוא משתנה רלוונטי. הפתרון שלנו עבור לבלבל את הפוטנציאל הזה היה להקצות שני מדרגים מיודעים עבור כל מקטע בכל ROI, ולאחר מכן להבטיח אמינות בין-rater (באמצעות מתאם של ספירות) תמיד גבוה מ 0.8. גישה זו, תוך duplicative, נתן לנו ביטחון גדול בהרבה על דיוק כמו האמינות-rater היתר בקלות חריגת קריטריון מינימום זה. תת-אזורים של NAC (ליבה לעומת פגז), איימי (baso-צדדית מול-המדיאלי מרכזי-cortico) ו mPFC (perilimbic לעומת infralimbic) נותחו. אזורים אלה ניתנים לחלק עוד יותר, במיוחד את הגרעינים איימו פרט, תאי תיקון מטריצה ​​של בסטריאטום הגבי, ושריון NAC (קודקוד, קשת, קונוס, אזור ביניים). בגלל קליפת NAC הצליחה להציג שינויים בעקביות FLI הבאים שמן תירס, גלוקוז או פרוקטוז, ניתוחים משנה נוספים של המבנה הזה לא בוצע. בדיקה סופית של אזורי תיקון מטריצה ​​של בסטריאטום הגבי נדרש טכניקות immunohistochemical עוד כי לא הועסקו במחקר הנוכחי, אבל יהיה מחקר מעקב חשוב. ניתוח של גרעינים איימו בודדים בתוך כל תת-אזור גם יהיה מחקר עתידי נוסף.

מחקרים קודמים הראו כי sucצריכה עלתה עלתה FLI בגרעין איימי המרכזי, VTA וכן הקליפה, אבל לא ליבה, של NAC, עדיין חליטות סכרין אוראליות או IG אינן יעילות בעיקר 55-57, 60-62. צריכת גלוקוז ופרוקטוז שהושרו השפעות ספציפיות-סוכר על FLI בשתי יעיל איימי מרכזי-cortico-המדיאלי בסטריאטום הגבי, היעיל לשעבר בליבת NAC ואת איימי basolateral, ואת יעיל האחרון ב infralimbic mPFC. צריכת סוכרזית לא הצליחה להביא שינויי FLI בכל יחסי באתר למים. צריך שומן גם גדילת FLI באתרי accumbal ו mPFC במחקרים קודמים 65-67, ופיק הפעלה משמעותית סימולטני VTA, infralimbic ו prelimbic mPFC, בסטריאטום הגבי, ליבת NAC, ואת איימי basolateral ומרכזי-cortico-המדיאלי.

למרות שמחקרים קודמים הראו כי צריכת סוכר ושומן המושרה FLI בקידמתו טווינה-corticolimbic ו Nigro-striatal מערכות DA, המחקר הנוכחי באופן שיטתיהפעלה בו זמנית FLI מוערכת ב VTA, basolateral ואיימי המרכזי-cortico-המדיאלי, בסטריאטום הגבי, prelimbic ו infralimbic mPFC, ליבת NAC ופצצות לאחר צריכה חריפה של שמן תירס, פרוקטוז, גלוקוז או סכרין. עליות FLI משמעותיים היו קשורים מאוד זה לזה מעבר באתרי המוח הקדמי, תומכים ברעיון של הפעלת רשת המוח מופץ בתיווך סוכר צריכת השומן. פרוטוקולים כגון זיהוי לשינוים סימולטניים לוקוסי מוח מרובים יכולים להיות מנוצלים בתנאים כרוניים binging כמו גם תחת מיזוג והעדפות. מחקרים אלה מראים כי זוהי מקבילה אנטומיים חזקה (C-FOS) יכולה לשמש ביעילות באזורי מוח המרובים בו זמנית כדי לזהות מועמדים בתיווך צריכה והעדפות טעימות בחיות שעשויות לספק תובנות מצבים רפואיים אדם הקשורות להשמנה, סוכרת והפרעות אכילה אחרות .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

תודה לדיאנה איקזה-Culaki, Cristal סמפסון Theologia Karagiorgis על העבודה הקשה שלהם על הפרויקט הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koob, G. F. Neural mechanisms of drug reinforcement. Ann. N.Y. Acad. Sci. 654, 171-191 (1992).
  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
  4. Horvitz, J. C., Choi, W. Y., Morvan, C., Eyny, Y., Balsam, P. D. A "good parent" function of dopamine: transient modulation of learning and performance during early stages of training. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1104, 270-288 (2007).
  5. Wickens, J. R., Horvitz, J. C., Costa, R. M., Killcross, S. Dopaminergic mechanisms in actions and habits. J. Neurosci. 27, 8181-8183 (2007).
  6. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  7. Swanson, L. W. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res. Bull. 9, 321-353 (1982).
  8. Cacciapaglia, F., Wrightman, R. M., Careli, R. M. Rapid dopamine signaling differentially modulates distinct microcircuits within the nucleus accumbens during sucrose-directed behavior. J. Neurosci. 31, 13860-13869 (2011).
  9. Martinez-Hernandez, J., Lanuza, E., Martinez-Garcia, F. Selective dopaminergic lesions of the ventral tegmental area impair preference for sucrose but not for male sex pheromones in female mice. Eur. J. Neurosci. 24, 885-893 (2006).
  10. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential influence of associative and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. J. Neurosci. 17, 851-861 (1997).
  11. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential responsiveness of dopamine transmission to food-stimuli in nucleus accumbens shell/core compartments. Neurosci. 89, 637-641 (1999).
  12. Cheng, J., Feenstra, M. G. Individual differences in dopamine efflux in nucleus accumbens shell and core during instrumental conditioning. Learn. Mem. 13, 168-177 (2006).
  13. Genn, R. F., Ahn, S., Phillips, A. G. Attenuated dopamine efflux in the rat nucleus accumbens during successive negative contrast. Behav. Neurosci. 118, 869-873 (2004).
  14. Hajnal, A., Norgren, R. Accumbens dopamine mechanisms in sucrose intake. Brain Res. 904, 76-84 (2001).
  15. Hajnal, A., Smith, G. P., Norgren, R. Oral sucrose stimulation increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. 286, R31-R37 (2003).
  16. Bassareo, V., Di Chiara, G. Modulation of feeding-induced activation of mesolimbic dopamine transmission by appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neurosci. 11, 4389-4397 (1999).
  17. Hajnal, A., Lenard, L. Feeding-related dopamine in the amygdala of freely moving rats. Neuroreport. 8, 2817-2820 (1997).
  18. Bassareo, V., De Luca, M. A., Di Chiara, G. Differential expression of motivational stimulus properties by dopamine in nucleus accumbens shell versus core and prefrontal cortex. J. Neurosci. 22, 4709-4719 (2002).
  19. Feenstra, M., Botterblom, M. Rapid sampling of extracellular dopamine in the rat prefrontal cortex during food consumption, handling, and exposure to novelty. Brain Res. 742, 17-24 (1996).
  20. Hernandez, L., Hoebel, B. G. Feeding can enhance dopamine turnover in the prefrontal cortex. Brain Res. Bull. 25, 975-979 (1990).
  21. Liang, N. C., Hajnal, A., Norgren, R. Sham feeding corn oil increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291, R1236-R1239 (2006).
  22. Dunnett, S. B., Iversen, S. D. Regulatory impairments following selective kainic acid lesions of the neostriatum. Behav. Brain Res. 1, 497-506 (1980).
  23. Salamone, J. D., Zigmond, M. J., Stricker, E. M. Characterization of the impaired feeding behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions. Neurosci. 39, 17-24 (1990).
  24. Kelley, A. E. Ventral striatal control of appetitive motivation: role in ingestive behavior and reward-related learning. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 765-776 (2004).
  25. Kelley, A. E. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms. Neuron. 44, 161-179 (2004).
  26. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E. A proposed hypothalamic-thalamic-striatal axis for the integration of energy balance, arousal and food reward. J. Comp. Neurol. 493, 72-85 (2005).
  27. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E., Will, M. J. Corticostriatal-hypothalamic circuitry and food motivation: integration of energy, action and reward. Physiol. Behav. 86, 773-795 (2005).
  28. Berendse, H. W., Galis-de-Graaf, Y., Groenewegen, H. J. Topographical organization and relationship with ventral striatal compartments of prefrontal corticostriatal projections in the rat. J. Comp. Neurol. 316, 314-347 (1992).
  29. Brog, J. S., Salyapongse, A., Deutch, A. Y., Zahm, D. S. The patterns of afferent innervation of the core and shell in the "accumbens" part of rat ventral striatum: immunohistochemical detection of retrogradely transported fluoro-gold. J. Comp. Neurol. 338, 255-278 (1993).
  30. McDonald, A. J. Organization of amygdaloid projections to the prefrontal cortex and associated stritum in the rat. Neurosci. 44, 1-14 (1991).
  31. McGeorge, A. J., Faull, R. L. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat. Neurosci. 29, 503-537 (1989).
  32. Sesack, S. R., Deutch, A. Y., Roth, R. H., Bunney, B. S. Topographical organization of the efferent projections of the medial prefrontal cortex in the rat: an anterograde tract-tracing study with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J. Comp. Neurol. 290, 213-242 (1989).
  33. Wright, C. I., Beijer, A. V., Groenewegen, H. J. Basal amygdaloid complex afferents to the rat nucleus accumbens are compartmentally organized. J. Neurosci. 16, 1877-1893 (1996).
  34. Wright, C. I., Groenewegen, H. J. Patterns of convergence and segregation in the medial nucleus accumbens of the rat: relationships of prefrontal cortical, midline thalamic and basal amygdaloid afferents. J. Comp. Neurol. 361, 383-403 (1995).
  35. Geary, N., Smith, G. P. Pimozide decreases the positive reinforcing effect of sham fed sucrose in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav. 22, 787-790 (1985).
  36. Muscat, R., Willner, P. Effects of selective dopamine receptor antagonists on sucrose consumption and preference. Psychopharmacol. 99, 98-102 (1989).
  37. Schneider, L. H., Gibbs, J., Smith, G. P. D-2 selective receptor antagonists suppress sucrose sham feeding in the rat. Brain Res. Bull. 17, 605-611 (1986).
  38. Baker, R. W., Osman, J., Bodnar, R. J. Differential actions of dopamine receptor antagonism in rats upon food intake elicited by mercaptoacetate or exposure to a palatable high-fat diet. Pharmacol. Biochem. Behav. 69, 201-208 (2001).
  39. Rao, R. E., Wojnicki, F. H., Coupland, J., Ghosh, S., Corwin, R. L. Baclofen, raclopride and naltrexone differentially reduce solid fat emulsion intake under limited access conditions. Pharmacol. Biochem. Behav. 89, 581-590 (2008).
  40. Weatherford, S. C., Smith, G. P., Melville, L. D. D-1 and D-2 receptor antagonists decrease corn oil sham feeding in rats. Physiol. Behav. 44, 569-572 (1988).
  41. Azzara, A. V., Bodnar, R. J., Delamater, A. R., Sclafani, A. D1 but not D2 dopamine receptor antagonism blocks the acquisition of a flavor preference conditioned by intragastric carbohydrate infusions. Pharmacol. Biochem. Behav. 68, 709-720 (2001).
  42. Baker, R. M., Shah, M. J., Sclafani, A., Bodnar, R. J. Dopamine D1 and D2 antagonists reduce the acquisition and expression of flavor-preferences conditioned by fructose in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 75, 55-65 (2003).
  43. Dela Cruz, J. A., Coke, T., Icaza-Cukali, D., Khalifa, N., Bodnar, R. J. Roles of NMDA and dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of flavor preferences conditioned by oral glucose in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 114, 223-230 (2014).
  44. Dela Cruz, J. A., et al. Roles of dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fat-conditioned flavor preferences in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 332-337 (2012).
  45. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Pharmacology of flavor preference conditioning in sham-feeding rats: effects of dopamine receptor antagonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 65, 635-647 (2000).
  46. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Role of D(1) and D(2) dopamine receptors in the acquisition and expression of flavor-preference conditioning in sham-feeding rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, (1), 537-544 (2000).
  47. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Activation of dopamine D1-like receptors in nucleus accumbens is critical for the acquisition, but not the expression, of nutrient-conditioned flavor preferences in rats. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
  48. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Dopamine D1-like receptor antagonism in amygdala impairs the acquisition of glucose-conditioned flavor preference in rats. Eur. J. Neurosci. 30, 289-298 (2009).
  49. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Acquisition of glucose-conditioned flavor preference requires the activation of dopamine D1-like receptors within the medial prefrontal cortex in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 214-219 (2010).
  50. Malkusz, D. C., et al. Dopamine signaling in the medial prefrontal cortex and amygdala is required for the acquisition of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 233, 500-507 (2012).
  51. Bernal, S. Y., et al. Role of dopamine D1 and D2 receptors in the nucleus accumbens shell on the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor-flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 190, 59-66 (2008).
  52. Bernal, S. Y., et al. Role of amygdala dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 205, 183-190 (2009).
  53. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J. Neurosci. Methods. 29, 261-265 (1989).
  54. VanElzakker, M., Fevurly, R. D., Breindel, T., Spencer, R. L. Environmental novelty is associated with a selective increase in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex. Learn. Mem. 15, 899-908 (2008).
  55. Norgren, R., Hajnal, A., Mungarndee, S. S. Gustatory reward and the nucleus accumbens. Physiol. Behav. 89, 531-535 (2006).
  56. Park, T. H., Carr, K. D. Neuroanatomical patterns of fos-like immunoreactivity induced by a palatable meal and meal-paired environment in saline- and naltrexone-treated rats. Brain Res. 805, 169-180 (1998).
  57. Zhao, X. L., Yan, J. Q., Chen, K., Yang, X. J., Li, J. R., Zhang, Y. Glutaminergic neurons expressing c-Fos in the brainstem and amygdala participate in signal transmission and integration of sweet taste. Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 31, 1138-1142 (2011).
  58. Mungarndee, S. S., Lundy, R. F., Norgren, R. Expression of Fos during sham sucrose intake in rats with central gustatory lesions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R751-R763 (2008).
  59. Otsubo, H., Kondoh, T., Shibata, M., Torii, K., Ueta, Y. Induction of Fos expression in the rat forebrain after intragastric administration of monosodium L-glutamate, glucose and NaCl. Neurosci. 196, 97-103 (2011).
  60. Yamamoto, T., Sako, N., Sakai, N., Iwafune, A. Gustatory and visceral inputs to the amygdala of the rat: conditioned taste aversion and induction of c-fos-like immunoreactivity. Neurosci. Lett. 226, 127-130 (1997).
  61. Mitra, A., Lenglos, C., Martin, J., Mbende, N., Gagne, A., Timofeeva, E. Sucrose modifies c-fos mRNA expression in the brain of rats maintained on feeding schedules. Neurosci. 192, 459-474 (2011).
  62. Pecoraro, N., Dallman, M. F. c-Fos after incentive shifts: expectancy, incredulity, and recovery. Behav. Neurosci. 119, 366-387 (2005).
  63. Hamlin, A. S., Blatchford, K. E., McNally, G. P. Renewal of an extinguished instrumental response: Neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neurosci. 143, 25-38 (2006).
  64. Kerfoot, E. C., Agarwal, I., Lee, H. J., Holland, P. C. Control of appetitive and aversive taste-reactivity responses by an auditory conditioned stimulus in a devaluation task: A FOS and behavioral analysis. Learn. Mem. 14, 581-589 (2007).
  65. Zhang, M., Kelley, A. E. Enhanced intake of high-fat food following striatal mu-opioid stimulation: microinjection mapping and fos expression. Neurosci. 99, 267-277 (2000).
  66. Teegarden, S. L., Scott, A. N., Bale, T. L. Early life exposure to a high fat diet promotes long-term changes in dietary preferences and central reward signaling. Neurosci. 162, 924-932 (2009).
  67. Del Rio, D., et al. Involvement of the dorsomedial prefrontal cortex in high-fat food conditioning in adolescent mice. Behav. Brain Res. 283, 227-232 (2015).
  68. Knapska, E., Radwanska, K., Werka, T., Kaczmarek, L. Functional internal complexity of amygdala: focus on gene activity mapping after behavioral training and drugs of abuse. Physiol. Rev. 87, 1113-1173 (2007).
  69. Dela Cruz, J. A. D., et al. c-Fos induction in mesotelencephalic dopamine pathway projection targets and dorsal striatum following oral intake of sugars and fats in rats. Brain Res. Bull. 111, 9-19 (2015).
  70. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Elsevier. (2006).
  71. Ranaldi, R., et al. The effects of VTA NMDA receptor antagonism on reward-related learning and associated c-fos expression in forebrain. Behav. Brain Res. 216, 424-432 (2011).
זיהוי סימולטני של הפעלת ג-Fos מאתרים זכו דופמין Mesolimbic ו Mesocortical בעקבות סוכר נאיבי בליעת שומן אצל חולדות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter