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Neuroscience

मेसोलिम्बिक और Mesocortical डोपामाइन इनाम साइटों से सी-Fos एक्टिवेशन के साथ पता लगाना भोले चीनी और चूहों में वसा घूस के बाद

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक विश्वसनीय immunohistological तकनीक का वर्णन सेलुलर सी FOS सक्रियण का उपयोग कर चूहों में वसा और शर्करा के उपन्यास घूस के बाद डोपामाइन रास्ते और टर्मिनल साइटों में एक साथ परिवर्तन को मापने के द्वारा इनाम से संबंधित वितरित मस्तिष्क नेटवर्क की पहचान है।

Abstract

इस अध्ययन में वसा और चूहों में मस्तिष्क डोपामाइन (डीए) रास्ते पर चीनी के उपन्यास घूस के प्रभाव का आकलन करने के लिए सेलुलर सी FOS सक्रियण उपयोग करता है। शर्करा और वसा के सेवन उनके सहज आकर्षण के रूप में अच्छी तरह के रूप में सीखा वरीयताओं से मध्यस्थता कर रहे हैं। ब्रेन डोपामाइन, विशेष रूप से मेसो-लिम्बिक और उदर tegmental क्षेत्र (VTA) से मेसो-cortical अनुमानों, इन अशिक्षित और सीखा प्रतिक्रियाओं दोनों में फंसाया गया है। वितरित मस्तिष्क नेटवर्क, जिसमें कई साइटों और ट्रांसमीटर / पेप्टाइड सिस्टम बातचीत की अवधारणा, स्वादिष्ट भोजन का सेवन मध्यस्थता करने के लिए प्रस्तावित किया गया है, लेकिन सीमित सबूत अनुभव से इस तरह के कार्यों का प्रदर्शन नहीं है। इस प्रकार, चीनी का सेवन नाभिक accumbens (एनएसी), प्रमस्तिष्कखंड (एमी) ​​सहित अलग-अलग VTA डीए प्रक्षेपण क्षेत्रों से डीए जारी है और बढ़ जाती है सी-Fos-तरह immunoreactivity (FLI) और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (mPFC) के साथ ही पृष्ठीय स्ट्रिएटम औसत दर्जे elicits। इन साइट में चयनात्मक डीए रिसेप्टर विरोधी के आगे, केंद्रीय प्रशासनविभिन्न अधिग्रहण और शक्कर या वसा से हासिल वातानुकूलित स्वाद वरीयताओं की अभिव्यक्ति को कम। एक दृष्टिकोण है जिसके द्वारा निर्धारित करने के लिए है कि क्या इन साइटों चीनी या वसा का सेवन के जवाब में एक वितरित मस्तिष्क नेटवर्क के रूप में बातचीत का मूल्यांकन एक साथ किया जाएगा कि क्या VTA और उसके प्रमुख mesotelencephalic डीए प्रक्षेपण क्षेत्र (prelimbic और infralimbic mPFC, कोर और एनएसी के खोल, basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी) के साथ ही पृष्ठीय स्ट्रिएटम समन्वित प्रदर्शित होगा और मक्का का तेल (3.5%), ग्लूकोज (8%), फ्रक्टोज (8%) और साकारीन की मौखिक, असुविधाजनक सेवन के बाद एक साथ FLI सक्रियण (0.2 %) समाधान की। यह दृष्टिकोण कृन्तकों में स्वादिष्ट भोजन की घूस में इनाम से संबंधित सीखने अध्ययन के लिए प्रासंगिक मस्तिष्क साइटों भर में एक साथ सेलुलर सी FOS सक्रियण का उपयोग की व्यवहार्यता की पहचान करने में एक सफल पहला कदम है।

Introduction

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ब्रेन डोपामाइन (डीए) के माध्यम से स्वादिष्ट शर्करा का सेवन करने के लिए केंद्रीय प्रतिक्रियाओं में फंसाया गया है प्रस्तावित hedonic 1,2, प्रयास से संबंधित 3 और आदत के आधार पर कार्रवाई की 4,5 तंत्र। प्राथमिक डीए मार्ग इन प्रभावों में फंसा उदर tegmental क्षेत्र (VTA) में निकलती है, और नाभिक accumbens (एनएसी) कोर और खोल, basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे प्रमस्तिष्कखंड (एमी), और prelimbic और infralimbic औसत दर्जे के लिए परियोजनाओं प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (mPFC) (समीक्षा 6.7 देखें)। VTA सुक्रोज का सेवन 8,9 में फंसा दिया गया है, और डीए रिहाई एनएसी 10-15, एमी 16,17 और mPFC 18-20 में निम्नलिखित चीनी का सेवन मनाया जाता है। वसा का सेवन भी उत्तेजित करता है डीए एनएसी रिलीज 21, और पृष्ठीय स्ट्रिएटम (पूंछवाला-putamen) के लिए एक और डीए युक्त प्रक्षेपण क्षेत्र भी महंगाई भत्ते की मध्यस्थता खिला 22,23 के साथ संबद्ध किया गया है। केली 24-27 प्रस्ताव किया है कि इन एकाधिक परियोजनाइस महंगाई भत्ते की मध्यस्थता प्रणाली के आयन क्षेत्रों व्यापक और अंतरंग interconnections 28-34 के माध्यम से एक एकीकृत और इंटरैक्टिव वितरित मस्तिष्क नेटवर्क का गठन किया।

डीए डी 1 और डी 2 रिसेप्टर विरोधी की क्षमता शर्करा और वसा 35-37 38-40 की खपत को कम करने के अलावा, महंगाई भत्ते सिगनल भी शर्करा और वसा वातानुकूलित स्वाद वरीयताओं का उत्पादन करने के लिए (सीएफपी) की क्षमता मध्यस्थता में फंसाया गया है 41- 46। एनएसी, एमी या mPFC 47-49 में एक डीए डी 1 रिसेप्टर प्रतिपक्षी के Microinjections सीएफपी के अधिग्रहण intragastric ग्लूकोज द्वारा हासिल समाप्त। जबकि mPFC में या तो डीए डी 1 डी 2 या रिसेप्टर विरोधी के microinjections फ्रक्टोज-सीएफपी 50 के अधिग्रहण समाप्त, अधिग्रहण और फ्रुक्टोज-सीएफपी की अभिव्यक्ति विभिन्न एनएसी और एमी 51,52 में डीए विरोधियों द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं।

सी-FOS तकनीक 53,54 तंत्रिका activatio जांच करने के लिए नियोजित किया गया हैn स्वादिष्ट सेवन और तंत्रिका सक्रियण द्वारा प्रेरित किया। शब्द "सी-FOS सक्रियण" पांडुलिपि भर में इस्तेमाल किया जाएगा, और सक्रिय न्यूरोनल विध्रुवण के दौरान सी-Fos की वृद्धि की प्रतिलेखन द्वारा परिभाषित किया गया है। सुक्रोज का सेवन केंद्रीय एमी नाभिक में Fos-तरह immunoreactivity (FLI) में वृद्धि हुई, VTA के रूप में अच्छी तरह से खोल, लेकिन नहीं कोर, एनएसी 55-57 की। दिखावा खिला चूहों में सुक्रोज का सेवन जबकि काफी एमी और एनएसी में FLI वृद्धि हुई है, लेकिन नहीं VTA 58, intragastric सुक्रोज या ग्लूकोज लेनी काफी FLI एनएसी और एमी 59,60 के मध्य और basolateral नाभिक में वृद्धि हुई है। अनुसूचित चाउ उपयोग करने के लिए सुक्रोज के बार-बार अतिरिक्त के रूप में अच्छी तरह से mPFC में FLI वृद्धि हुई एनएसी शेल और कोर 61 के रूप में। एक sucrose एकाग्रता downshift प्रतिमान है कि सबसे बड़ा FLI बढ़ जाती है basolateral एमी और एनएसी में हुई पता चला है, लेकिन नहीं VTA 62। बाद कंडीशनिंग, चीनी से संबंधित प्राकृतिक रीवा के विलुप्तआरडी व्यवहार basolateral एमी और एनएसी 63 में FLI वृद्धि हुई है। इसके अलावा, एक टोन करने के लिए बाँधना चीनी उपलब्धता स्वर बाद में basolateral एमी 64 में FLI स्तर में वृद्धि के परिणामस्वरूप। उच्च वसा का सेवन भी एनएसी और mPFC साइटों 65-67 में FLI वृद्धि हुई है।

पहले से उद्धृत अध्ययन के अधिकांश एकल साइटों है कि इनाम से संबंधित वितरित मस्तिष्क नेटवर्क 24-27 की पहचान के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं में सी-FOS सक्रियण पर चीनी और वसा प्रभाव की जांच की। इसके अलावा, अध्ययन के कई लोग भी एनएसी (कोर और शेल), एमी (basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे) और mPFC के उप-क्षेत्रों के सापेक्ष योगदान को चित्रित नहीं किया (prelimbic और infralimbic) कि संभावित द्वारा जांच किया जा सकता है उत्कृष्ट स्थानिक, सी-Fos मानचित्रण 68 में एकल कोशिका संकल्प का लाभ। हमारी प्रयोगशाला में 69 हाल ही में VTA डीए मार्ग और उसके समर्थक में सी-FOS सक्रियण और एक साथ मापा परिवर्तन का इस्तेमाल कियाjection क्षेत्र (एनएसी, एमी और mPFC) वसा और चूहों में शर्करा के उपन्यास घूस के बाद। वर्तमान अध्ययन प्रक्रियात्मक और methodological चरणों का वर्णन एक साथ छह अलग अलग समाधान करने के लिए है कि क्या तीव्र जोखिम (मक्का का तेल, ग्लूकोज, फ्रक्टोज, साकारीन, पानी और एक मोटी पायस नियंत्रण) का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न एनएसी, एमी के उप-क्षेत्रों में FLI को सक्रिय होता है, mPFC के साथ ही पृष्ठीय स्ट्रिएटम। मतभेद की यह एक साथ पता लगाने के लिए अनुमति के रूप में प्रत्येक साइट और दृढ़ संकल्प में FLI पर महत्वपूर्ण प्रभाव की पुष्टि के लिए कि क्या एक विशेष साइट में परिवर्तन, संबंधित साइटों में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध जिससे एक वितरित मस्तिष्क नेटवर्क 24-27 के लिए समर्थन प्रदान करते हैं। इन प्रक्रियाओं का परीक्षण किया है कि क्या VTA, prelimbic और infralimbic mPFC, कोर और एनएसी के खोल, और basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी) के साथ ही पृष्ठीय स्ट्रिएटम समन्वित प्रदर्शित होगा और मौखिक, असुविधाजनक सेवन के बाद एक साथ FLI सक्रियण ग्लूकोज (8%), फ्रक्टोज की (8%), मक्का का तेल (3.5%) और साकारीन (0.2%) समाधान।

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Protocol

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इन प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का प्रमाण है कि सभी विषयों और प्रक्रियाओं की देखभाल के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों और प्रयोगशाला पशु की उपयोग के अनुपालन में हैं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. विषयों

  1. खरीद और / या नस्ल पुरुष Sprague-Dawley चूहों (260 - 300 ग्राम)।
  2. व्यक्तिगत रूप से तार जाल पिंजरों में चूहों हाउस। चूहे चाउ और पानी उपलब्ध यथेच्छ के साथ एक 0:12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर उन्हें बनाए रखना।
  3. निरुपित उचित नमूना आकार (जैसे, एन ≈ 6 - 8) बेतरतीब ढंग से समूहों में।

2. परीक्षण उपकरण और प्रक्रियाओं का सेवन

  1. रबड़ stoppers के साथ calibrated सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करें और एक 45 डिग्री के कोण धातु sipper ट्यूब सटीक माप प्रदान करने के लिए प्रस्तुत समाधान के (0.1 मिलीलीटर ±)। एक तना हुआ धातु वसंत द्वारा घर पिंजरों के लिए उन्हें सुरक्षित calibrations की दृश्यता की अनुमति है।
  2. खाद्य राशन को प्रतिबंधित (~15 / जी / दिन) चूहों के समाधान का उपभोग करने की प्रेरणा बढ़ाने के लिए उनके मूल शरीर के वजन का 85% करने के लिए वजन कम करने के लिए। नोट: वजन में कमी 3 के बीच ले जाना चाहिए - 5 दिन।
  3. संभावना है कि चूहों कम (कम से कम 1 मिनट) विलंबता के साथ बाद में परीक्षण समाधान नमूना होगा अधिकतम करने के लिए एक 1 घंटा सत्र में चार दिनों के लिए 0.2% साकारीन के पूर्व प्रशिक्षण समाधान (10 एमएल) प्रदान करें।
  4. कुछ बूँदें spilling से अपकेंद्रित्र ट्यूब के माध्यम से प्रवाह की पुष्टि करें।
  5. पहले और प्रत्येक सत्र के बाद ट्यूबों के वजन का सेवन माप प्राप्त करने के लिए।
  6. एक) पानी, ख) उपन्यास स्वाद (0.05% चेरी स्वाद) 0.2% साकारीन, ग) 8% फ्रुक्टोज, घ) 8: छह समाधानों में से एक प्राप्त उपसमूहों पर पांचवें दिन सेवन परीक्षण (10 मिलीलीटर, 1 घंटा) निष्पादित करें % ग्लूकोज, ई) 3.5% मक्का का तेल 0.3% जिंक गम में निलंबित कर दिया, और एफ) 0.3% जिंक गम।
  7. सुनिश्चित करें कि पोषक तत्व समाधान isocaloric कर रहे हैं; इस प्रकार, 3.5% मकई तेल एकाग्रता 8% चीनी के समाधान के लिए isocaloric है।
  8. सुनिश्चित वेंकम विलंबता (कम से कम 1 मिनट) के साथ चूहों नमूना समाधान पर। इस आवश्यकता को पूरा नहीं कर रहा है, तो अध्ययन से इस विषय त्यागें।

3. ऊतक तैयार

  1. प्रत्येक परीक्षा के समाधान के लिए प्रारंभिक प्रदर्शन के बाद pentobarbital 90 मिनट की एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रत्येक जानवर anesthetize। पुष्टि करें कि जानवरों को ठीक ढंग से प्रदर्शित किया कि जानवर नहीं रह पैर चुटकी करने के लिए वापसी के रूप में इस तरह के सजगता, प्रत्यक्ष कार्निया दबाव या सिर में गहरी पंख उत्तेजना के झटकों के बाद निमिष के लिए उत्तरदायी है द्वारा anesthetized हैं।
  2. के रूप में पहले 69 में वर्णित transcardially प्रत्येक जानवर छिड़कना।
    1. सोडियम pentobarbital (65 मिलीग्राम / किग्रा) की अधिक मात्रा के साथ चूहों anesthetize, ribcage को हटाने और दिल 69 करने के लिए स्वतंत्र पहुँच के लिए छाती का पर्दाफाश।
    2. बाएं हृदय वाल्व के शीर्ष में सुई प्लेस, और कटौती रग कावा। प्रशासन फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस, ~ 180 मिलीलीटर) एक फॉस्फेट बफर लगानेवाला सह द्वारा पीछा किया4% paraformaldehyde (~ 180 मिलीलीटर) ntaining।
    3. सुनिश्चित करें कि पशु वास्तव में जांच के तरल ऐसी नाक, मुंह, और जननांग क्षेत्र के रूप में अन्य गुहाओं, जा रहा है कि क्या सही ढंग से भरकर रखा जा रहा है। नोट: paraformaldehyde के साथ उचित निर्धारण बड़ी मांसपेशी आंदोलनों के साथ किया जाएगा। यदि यह नहीं होती है, सुई फिर से समायोजित जब तक इस प्रतिक्रिया होती है।
  3. जल्दी से फर और त्वचा को काटने खोपड़ी से दूर द्वारा खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें। दरार और मस्तिष्क पीछे से सामने करने के लिए चलती से हड्डी को दूर करने के rongeurs का प्रयोग करें। नीचे और सेरिबैलम के पीछे क्षेत्र में शुरू में काम करते हैं, यह सुनिश्चित करना कि rongeur हड्डी और तानिका पिया मेटर के बीच है। एक बार खोपड़ी के शीर्ष और पक्षों को हटा रहे हैं, आधार से मस्तिष्क को उठाने के लिए एक छोटा सा रंग का उपयोग करें, और छोटी कैंची से कपाल नसों धज्जी। हड्डी को दूर करने का प्रयास करते समय मस्तिष्क को नुकसान नहीं सावधान रहें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक 4% paraformaldehyde समाधान में दिमाग को ठीक करें।एक 30% सूक्रोज / 70% पीबीएस कमरे के तापमान पर समाधान में दिमाग की जगह जब तक वे कंटेनर के नीचे बसा।
  5. मस्तिष्क ब्लॉक
    1. मस्तिष्क घ्राण बल्ब को transversely दुम काटने का व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा निकालें।
    2. मस्तिष्क सेरिबैलम और पोंस के स्तर पर transversely काटने की दुम हिस्सा निकालें।
  6. coronally मस्तिष्क माउंट दुम हिस्सा एक रपट microtome के चरण के लिए तय हो गई है, और कटौती राज्याभिषेक वर्गों (40 माइक्रोन) mPFC के माध्यम से (2.86-2.20 मिमी शीर्षस्थान करने के लिए व्याख्यान चबूतरे), एनएसी कोर और खोल और पृष्ठीय स्ट्रिएटम (+ 1.76 - +1,60 मिमी शीर्षस्थान करने के लिए व्याख्यान चबूतरे), एमी (-2.12 - -2.92 मिमी शीर्षस्थान के लिए दुम), और VTA (-5.20 - -5.60 मिमी शीर्षस्थान के लिए दुम)। मार्गदर्शन के लिए एक चूहे के मस्तिष्क एटलस 70 का प्रयोग करें।
  7. एक 24 अच्छी तरह से थाली अंतिम प्रतिरक्षाऊतकरसायन विश्लेषण 71 के लिए पीबीएस के साथ भरा के व्यक्तिगत कुओं में मुक्त अस्थायी वर्गों लीजिए। 24 हम सील करने के लिए Parafilm का प्रयोग करेंडालूँगा प्लेट यकीन है कि पीबीएस कंटेनर में लुप्त हो जाना नहीं है और मस्तिष्क सूख बनाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस में मस्तिष्क के ऊतकों की दुकान।

4. सी FOS प्रक्रिया (71 से अनुकूलित)

  1. 0.2% ट्राइटन X-100 पीबीएस में 1 घंटे के लिए 5% सामान्य बकरी सीरम के 5 मिलीलीटर और साथ प्रत्येक अनुभाग समझो।
  2. पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त कुओं में 36 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर: प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इलाज वर्गों (5000 खरगोश विरोधी सी FOS, 1) सेते हैं।
  3. कुल्ला धारा 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस (5 एमएल) के साथ 3x।
  4. पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त कुओं में 2 घंटे के लिए आरटी पर: माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते (200 1 biotinylated बकरी विरोधी खरगोश)।
  5. 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में प्रत्येक अनुभाग 3x (5 एमएल) कुल्ला।
  6. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध avidin-हॉर्सरैडिश peroxidase मिश्रण है कि पीबीएस के 5 मिलीलीटर में Avadin डीएच (100 μl) और biotinylated हॉर्सरैडिश peroxidase एच (100 μl) से बना एक किट में आता है में 2 घंटे के लिए rinsed वर्गों सेते हैं।
  7. पुन: कुल्ला वर्गों पंजाब में 3xएस 10 मिनट प्रत्येक के लिए (5 एमएल)।
  8. 10 मिनट थपका समाधान के 5 मिलीलीटर युक्त कुओं में ऊतक की जेट पर निर्भर करता है - 5 के लिए 0.0015% एच 22 की उपस्थिति में 0.05% diaminobenzidine (थपका) के साथ वर्गों प्रतिक्रिया।
  9. डबल-लेबल VTA वर्गों। पीबीएस में (5 एमएल) 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर: उन्हें एक tyrosine hydroxylase (ध) एंटीबॉडी (2,000 खरगोश विरोधी चूहा वें, 1) के साथ सेते हैं।
  10. वर्गों कुल्ला 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस (5 एमएल) में 3x।
  11. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस (5 एमएल) में: माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते (200 1 biotinylated बकरी विरोधी खरगोश)।
  12. वर्गों कुल्ला 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस (5 एमएल) में 3x।
  13. एक माध्यमिक एंटीबॉडी peroxidase जटिल का उपयोग करके एंटीबॉडी कल्पना। 0.05% थपका का एक संयोजन है और एक 0.3% निकल सल्फेट समाधान के साथ प्रतिक्रिया के लिए 5 - 10 मिनट थपका / एनआईसीएल समाधान के 5 मिलीलीटर युक्त कुओं में ऊतकों की प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है।
  14. सुनिश्चित करें कि थपका समाधान यह रंग से रंग में दूधिया रोशनी हरे रंग की है0.3% निकल सल्फेट के साथ प्रतिक्रिया। तो समाधान भी हरे रंग की है, तो प्रतिक्रिया भी अंधेरा हो जाएगा।
  15. जिलेटिन लेपित स्लाइड पर सभी वर्गों माउंट। उन्हें सूखी रात भर दो, और फिर कवर पर्ची एक टोल्यूनि आधारित समाधान (टीबीएस) की कुछ बूंदों के साथ।
  16. संहिता स्लाइड इतना है कि प्रयोगात्मक हालत पर्यवेक्षकों के लिए अज्ञात है।

5. सी FOS का निर्धारण immunoreactive गिनता

  1. prelimbic mPFC, infralimbic mPFC, एनएसी कोर, एनएसी खोल, basolateral एमी नाभिक, केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी, पृष्ठीय स्ट्रिएटम, और VTA: ब्याज की इन क्षेत्रों (आरओआई) में Fos पॉजिटिव न्यूरॉन्स गिनती करने के लिए निष्पक्ष पर्यवेक्षकों के जोड़े निरुपित। चित्रित करना है कि क्या सी-Fos immunoreactivity वें + और ​​VTA में गु कोशिकाओं में मौजूद था। चित्रा 1 माइक्रोस्कोप से एनएसी के एक स्क्रीन पर कब्जा कर लिया चित्र प्रदान करता है।

आकृति 1
यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. परीक्षण की स्थिति के सभी में साइट सभी जानवरों के लिए आम के अनुसार कम से कम तीन प्रतिनिधि स्लाइस का विश्लेषण।
  2. सॉफ्टवेयर और एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग एक रूपरेखा (चित्रा 1) अनुरेखण द्वारा प्रत्येक रॉय के लिए पूरे क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए।
    1. एक दिया साइट के लिए, आवेदन खुला और अधिग्रहण ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें और क्लिक करें "लाइव छवि"। ध्यान में रॉय को ले आओ और स्क्रीन पर क्लिक करें एक संदर्भ बिंदु की स्थापना। फिर टीआरएक गाइड के रूप में ग्रिड का उपयोग कर चुना मस्तिष्क क्षेत्र ऐस। एक बार ट्रेस पूरा हो गया है, कोशिकाओं (- 5.3.1.3 कदम 5.3.1.1) गिनती।
      1. सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करें। मेनू पट्टी के पास जाओ, "अधिग्रहण" और फिर "लाइव छवि" पर क्लिक करें। ध्यान में रॉय को ले आओ और स्क्रीन पर क्लिक करें एक संदर्भ बिंदु की स्थापना।
      2. ग्रिड उपकरण पट्टी पर जाएं और क्लिक करें "प्रदर्शन ग्रिड" और "उपयोग ग्रिड लेबल"। एक पूर्व निर्धारित पता लगाने के साथ रॉय को रेखांकित करें।
      3. प्रत्येक रॉय क्षेत्र में सभी कोशिकाओं की गणना, बाएं हाथ साइडबार में एक "+" का चयन सी FOS कोशिकाओं की गिनती रखने के लिए। मायने रखता है रजिस्टर करने के लिए अकेले प्रत्येक कोशिका पर क्लिक करें। एक सेल सी FOS के लिए सकारात्मक विचार जब एक परिभाषित गहरे लाल वृत्त (चित्रा 1) मनाया जाता है।
    2. प्रत्येक साइट के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    3. रिकार्ड एक प्रयोगशाला नोटबुक में और भविष्य के विश्लेषण के लिए कंप्यूटर पर गिना जाता है। मेनू पट्टी के पास जाओ, "फाइल" पर क्लिक करें, "सहेजें डेटा फ़ाइल" ट्रेसिंग और मायने रखता बचाने के लिए।
    4. प्रत्येक रॉय में प्रत्येक अनुभाग के लिए है कि अंतर करदाता दो बेख़बर रेटर की विश्वसनीयता (गिनती के सह-संबंध का उपयोग कर) सुनिश्चित हमेशा 0.8 से अधिक है।

    6. सांख्यिकी

    1. एक दोहराया उपायों विचरण (एनोवा) के 1-जिस तरह से विश्लेषण का उपयोग कर 1 दिन, 2, 3 और 4 69 की साकारीन सेवन की तुलना पहले चार दिनों में आधारभूत साकारीन सेवन का मूल्यांकन।
    2. एक यादृच्छिक ब्लॉक 2 तरह से एनोवा 69 का उपयोग करते हुए छह समूहों की कसौटी सेवन दिवस (5) के साथ साकारीन सेवन (4 दिन) की तुलना करें।
    3. Tukey तुलना (पी <0.05) का उपयोग व्यक्तिगत महत्वपूर्ण प्रभाव 69 निर्धारित करने के लिए।
    4. अंतर करदाता विश्वसनीयता निर्धारित है, और फिर एक आम पर्यवेक्षक के मायने रखता का उपयोग करें।
    5. प्रत्येक साइट 69 के लिए तीन प्रतिनिधि स्लाइस के लिए औसत सी FOS मायने रखता है।
      1. सी-FOS सक्रियण छह समाधान (3.5% मक्का का तेल, 8% ग्लूकोज, फ्रक्टोज 8%, 0.2% स्वाद साकारीन, XA के सेवन से प्रेरित का एक 1-रास्ता एनोवा प्रदर्शन करनाNthan गम नियंत्रण और जल) perilimbic mPFC 69 के लिए।
      2. infralimbic mPFC, एनएसी कोर, एनएसी खोल, basolateral एमी, केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी, VTA और पृष्ठीय स्ट्रिएटम के लिए छह समूहों में से दोहराएँ समानांतर विश्लेषण। Tukey तुलना (पी <0.05) का उपयोग व्यक्तिगत महत्वपूर्ण प्रभाव 69 प्रकट करते हैं।
    6. दोनों पानी के सेवन और उसके निलंबन एजेंट का सेवन, जिंक गम के साथ मकई तेल का सेवन की तुलना करें। दोनों पानी का सेवन और गैर पोषक स्वीटनर, साकारीन के सेवन के साथ फ्रक्टोज और ग्लूकोज सेवन की तुलना करें।
    7. स्थापित करना है कि क्या साइटों में से प्रत्येक में समाधान सेवन और सी-FOS सक्रियण के बीच महत्वपूर्ण संबंधों Bonferroni आर सहसंबंध (पी <0.05) का उपयोग कर मनाया गया।
      1. व्यवस्थित perilimbic और 3.5% मक्का का तेल समूह में प्रत्येक पशु के लिए infralimbic पूर्व ललाट प्रांतस्था में सी-FOS मायने रखता है की तुलना करें।
      2. छह साइटों में से प्रत्येक जोड़ी के व्यवस्थित ढंग से समानांतर विश्लेषण दोहराएँ (VTA, पृष्ठीय स्ट्रिएटम, infralimबीआईसी mPFC, perilimbic mPFC, एनएसी कोर, एनएसी खोल, basolateral एमी, केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे का 3.5% मक्का का तेल एमी)।
      3. अन्य पांच प्रयोगात्मक सेवन की स्थिति (8% ग्लूकोज, फ्रक्टोज 8%, 0.2% स्वाद साकारीन, जिंक गम नियंत्रण और पानी) के लिए इन छह साइटों की व्यवस्थित समानांतर विश्लेषण दोहराएँ।
    8. तथ्य यह है कि एक समाधान हालत के भीतर एक ही जानवरों के समाधान के पार और Bonferroni का उपयोग कर प्रत्येक समाधान के भीतर ग FOS सक्रियण के बीच महत्वपूर्ण संबंधों को निर्धारित करने से सभी साइटों में थे मूल्यांकन का लाभ ले लो r सहसंबंध (पी <0.05)।

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Representative Results

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नीचे वर्णित सभी प्रतिनिधि परिणाम पहले प्रकाशित किया गया है 69, और कर रहे हैं यहाँ तकनीक के प्रभाव का संकेत में "अवधारणा के सबूत 'का समर्थन करने के लिए फिर से प्रस्तुत किया।

समाधान Intakes
आधारभूत साकारीन सेवन में काफी अंतर है सेवन के साथ सभी जानवरों (एफ (3,108) = 57.27, पी <0.001) (1 दिन के लिए पहले चार दिनों में मनाया गया: 1.3 (0.2 ±) मिलीलीटर, दिन 2: 3.9 (0.4 ±) मिलीलीटर ; दिन 3: 5.9 (0.6 ±) मिलीलीटर, 4 दिन: 7.1 (0.6 ±) एमएल) काफी (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) और उत्तरोत्तर बढ़ रही है। 5 दिन काफी पर fructose और ग्लूकोज का सेवन, लेकिन न मक्का का तेल या साकारीन सेवन (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षा) में वृद्धि हुई 4 दिन साकारीन का सेवन करने के रिश्तेदार (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) फ्रक्टोज (9.6 (± 0.4) मिलीलीटर के साथ ) और ग्लूकोज (9.4 (0.6 ±) एमएल) SACC तुलना में काफी अधिकहरिन सेवन। इसके अलावा, मक्का का तेल का सेवन (7.4 (± 0.6) एमएल) काफी था (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) जिंक गम सेवन से अधिक है।

इन परिणामों की संभावना है कि समाधान के सेवन से प्रति साइटों में से किसी में किसी भी मनाया ग FOS सक्रियण के लिए खाते सकता है उठाया। इस जांच करने के लिए, Bonferroni आर सहसंबंध प्रदर्शन किया गया, जिसमें पांच समाधान के सेवन छह साइटों में से प्रत्येक में सी-FOS सक्रियण से संबंधित था। (आर (29) = 0.186) महत्वपूर्ण सहसंबंध कोर में समाधान का सेवन और सी-FOS सक्रियण के बीच मनाया जा करने में विफल रहा, शैल (आर (29) = 0.029) या कुल (आर (29) = 0.10) एनएसी, prelimbic ( आर (29) = 0.23), infralimbic (आर (29) = 0.30) या कुल (आर (29) = 0.14) mPFC, VTA (आर (29) = 0.10), पृष्ठीय स्ट्रिएटम (आर (29) = 0.14 ) या basolateral (आर (29) = 0.47), सेंट्रो-कॉर्टिको औसत दर्जे (आर (29) = 0.48) या कुल (आर (29) = 0,409) एमी। सेवन और एमी ग FOS सक्रियण, आगे correla के बीच उच्च सहसंबंध को देखते हुएमाहौल प्रत्येक व्यक्ति के समाधान के लिए प्रदर्शन किया गया। (Basolateral (आर = 0.15), सेंट्रो-कॉर्टिको औसत दर्जे (आर = 0.13), कुल (आर = 0.13)) महत्वपूर्ण (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) रिश्तों फ्रुक्टोज के लिए सेवन और एमी FLI के बीच मनाया जा करने में विफल रहा, ग्लूकोज (basolateral (आर = 0.17), सेंट्रो-कॉर्टिको औसत दर्जे (आर = 0.17), कुल आर = 0.13)), साकारीन (basolateral (आर = 0.42), सेंट्रो-कॉर्टिको औसत दर्जे (आर = 0.42), कुल (आर = 0.42)) या मक्का का तेल (basolateral (आर = 0.54), सेंट्रो-कॉर्टिको औसत दर्जे (आर = 0.59), कुल (आर = 0.64))। एक महत्वपूर्ण (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) नकारात्मक सहसंबंध जिंक गम का सेवन और कुल एमी FLI (आर = 0.94) के बीच मनाया गया।

mPFC सी-Fos एक्टिवेशन
मकई तेल काफी (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) की कुल वृद्धि हुई (2A चित्रा), infralimbic (चित्रा 2 बी) और prelimbic (चित्रा -2) mPFC सी-Fos पानी (*) या जिंक गम नियंत्रण के सापेक्ष में गिना जाता है(#)। काफी फ्रक्टोज (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) पानी (*) या साकारीन (+) (चित्रा 2 बी) को infralimbic mPFC सापेक्ष में वृद्धि हुई सी-Fos मायने रखता है, लेकिन कुल या prelimbic mPFC मायने रखता है। इसके विपरीत, ग्लूकोज या साकारीन, कुल perilimbic या infralimbic mPFC सी-Fos मायने रखता बदलने के लिए। दिखा पानी के लिए बढ़ा मक्का का तेल प्रेरित FLI रिश्तेदार जानवरों के 3 दिखाता प्रतिनिधि mPFC वर्गों चित्रा विफल रहा है।

चित्र 2
चित्रा 2. वसा या चीनी का सेवन विभिन्न औसत दर्जे का prefrontal प्रांतस्था (mPFC) में सी-FOS एक्टिवेशन बढ़ जाती है। सी FOS सक्रियण में परिवर्तन (± SEM के मतलब है) पूरे mPFC (पैनल), infralimbic mPFC क्षेत्र में विख्यात हैं (पैनल बी), और prelimbic mPFC क्षेत्र (पैनल सी) के बाद की खपत (1 घंटा) पानी की, साकारीन (0.2%), जिंक गम (मकई के तेल के लिए नियंत्रण), ग्लूकोज (8%), फ्रक्टोज (8%) या मक्का का तेल (3.5%)। (पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. वसा और शर्करा के बाद वास्तविक mPFC सी FOS एक्टिवेशन। सी FOS सक्रियण मक्का का तेल (पैनलों ए (4 गुना बढ़ाई) और सी (10 गुना बढ़ाई)) में काफी अधिक था के सेवन से अवगत कराया पशुओं में मनाया गया पानी (पैनलों बी (4 गुना बढ़ाई) और विकास (10 गुना बढ़ाई)) के सेवन की तुलना में। Prelimbic (पीएल) और infralimbic (IL) mPFC की चित्रित उप-क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व पैनलों ए (मक्का का तेल) और सी (जल) में diagramed कर रहे हैं के रूप में टी का हिस्सा हैंनली पैनल (ए और सी) इसी पैनल में 10 गुना बढ़ाई (बी और डी) के लिए बढ़ाया। पैनलों सी और डी में तीर प्रतिनिधि सी FOS सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है। सभी स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। (पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एमी ग-Fos एक्टिवेशन
मकई तेल काफी (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) कुल एमी (चित्रा -4 ए), basolateral (चित्रा 4 बी) और केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे में वृद्धि हुई है (चित्रा 4C) उप-क्षेत्र एमी ग-Fos पानी के सापेक्ष में गिना जाता है (*) या जिंक गम नियंत्रण (#)। ग्लूकोज भी काफी (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) की कुल वृद्धि (चित्रा -4 ए), basolateral (चित्रा 4 बी) और केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे ( (चित्रा -4 ए) और केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे का उप-क्षेत्र एमी की (चित्रा 4C) सी-Fos पानी (*) या साकारीन (+) के सापेक्ष में गिना जाता है, लेकिन नहीं basolateral एमी उप-क्षेत्र में। Saccharin कुल basolateral या केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी ग-Fos पानी के सापेक्ष मायने रखता बदलने में नाकाम रहे। एमी के भीतर व्यक्तिगत नाभिक के विस्तृत विश्लेषण से पता चला है कि महत्वपूर्ण परिवर्तन एमी की basolateral क्षेत्र में नोट भी व्यक्ति basolateral और पार्श्व एमी नाभिक में नोट किया गया। एमी की केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे क्षेत्र में नोट महत्वपूर्ण परिवर्तन भी व्यक्ति केंद्रीय, cortical और औसत दर्जे एमी नाभिक में नोट किया गया। 5 प्रदर्शित करता प्रतिनिधि एमी वर्गों चित्रादिखा वृद्धि हुई मकई तेल, glucose-, और पानी के लिए फ्रुक्टोज प्रेरित FLI रिश्तेदार जानवरों की। (पहले 69 प्रकाशित किया।)

चित्रा 4
चित्रा 4. वसा या चीनी का सेवन विभिन्न प्रमस्तिष्कखंड (एमी) ​​में सी-FOS एक्टिवेशन बढ़ जाती है। सी FOS सक्रियण में परिवर्तन (± SEM के मतलब है) पूरे एमी (पैनल) में उल्लेख किया जाता है, basolateral एमी क्षेत्र (पैनल बी) , और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी क्षेत्र (पैनल सी) पानी, साकारीन, जिंक गम, ग्लूकोज, फ्रक्टोज या मक्का का तेल की खपत (1 घंटा) के बाद। एमी की basolateral क्षेत्र में नोट महत्वपूर्ण परिवर्तन भी व्यक्ति basolateral और पार्श्व एमी नाभिक में नोट किया गया। एमी की केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे क्षेत्र में नोट महत्वपूर्ण परिवर्तन भी व्यक्ति केंद्रीय, cortical और औसत दर्जे एमी नाभिक में नोट किया गया। (इससे पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. वास्तविक एमी ग FOS एक्टिवेशन वसा और शर्करा के बाद। सी FOS सक्रियण मक्का का तेल (पैनलों ए (4 गुना बढ़ाई), डी (10 गुना बढ़ाई) और जी के सेवन से अवगत कराया पशुओं में मनाया गया था (60 गुना बढ़ाई)), ग्लूकोज (पैनलों बी (4 गुना बढ़ाई) और (10 गुना बढ़ाई)), और फ्रुक्टोज (पैनलों सी (4 गुना बढ़ाई) और एफ (10 गुना)) में है कि अधिक से काफी अधिक थे पानी (पैनलों एच (4 गुना बढ़ाई) और मैं (10 गुना बढ़ाई)) के सेवन की। का प्रतिनिधित्वकेंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे (सीएमसी) और basolateral (बीएलए) एमी की चित्रित उप-क्षेत्रों पैनलों ए (मक्का का तेल), बी (ग्लूकोज) में diagramed कर रहे हैं, सी (fructose) और एच (पानी) के रूप में हिस्सा हैं उन पैनलों (ए, बी, सी और एच) इसी पैनल (डी, ई, एफ और मैं) में to10 गुना बढ़ाई बढ़ाया की। पैनल डी में चित्रित उप-क्षेत्र (मक्का का तेल, 10 गुना बढ़ाई) पैनलों डी, ई, एफ, जी में पैनल डी तीर में 60 गुना बढ़ाई बढ़ाया है और मैं प्रतिनिधि सी FOS सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है। सभी पैमाने सलाखों पैनल जी (50 माइक्रोन) के अलावा 100 माइक्रोन कर रहे हैं। (पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एनएसी सी-Fos एक्टिवेशन
मकई तेल काफी (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षा) में वृद्धि हुई कुल (चित्रा 6A) और कोर ( (चित्रा 6C)। काफी ग्लूकोज (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) एनएसी कोर (चित्रा 6B) में वृद्धि हुई सी-Fos मायने रखता है, लेकिन कुल एनएसी या साकारीन (+) या पानी (*) के लिए एनएसी खोल सापेक्ष में नहीं। इसके विपरीत, फ्रक्टोज और साकारीन एनएसी कोर और / या खोल में सी-Fos सक्रियण जानने में पानी से अलग करने में विफल रहा। दिखा वृद्धि हुई मकई तेल या पानी के लिए ग्लूकोज प्रेरित FLI रिश्तेदार जानवरों की एनएसी कोर में 7 प्रदर्शित करता है चित्रा प्रतिनिधि वर्गों ।

चित्रा 6
चित्रा 6 फैट या चीनी का सेवन विभिन्न एनएसी में सी-FOS एक्टिवेशन बढ़ जाती है। सी FOS सक्रियण में परिवर्तन (मतलब ± SEM) पूरे एनएसी (पैनल), एनएसी कोर (पैनल बी), और एनएसी खोल में (पैनल सी) पानी, साकारीन, जिंक गम, ग्लूकोज, फ्रक्टोज या मक्का का तेल की खपत (1 घंटा) के बाद। (पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. वास्तविक एनएसी कोर, लेकिन नहीं एनएसी शैल सी FOS एक्टिवेशन वसा और शर्करा के बाद। सी FOS सक्रियण मक्का का तेल (पैनलों ए (4 गुना बढ़ाई), डी (10 गुना बढ़ाई के सेवन से अवगत कराया पशुओं में मनाया गया ) और जी (60 गुना बढ़ाई)) और ग्लूकोज (पैनलों बी (4 गुना बढ़ाई) और ई (10 गुना बढ़ाई)) में पानी के सेवन की तुलना में काफी अधिक थे (पैनलों सी (4 गुना बढ़ाई) और एफ (10 गुना magnification))। एनएसी कोर और एनएसी खोल के चित्रित उप-क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व पैनलों ए (मक्का का तेल) में diagramed कर रहे हैं, बी (ग्लूकोज) और सी (पानी) के रूप में उन पैनलों (ए, बी, सी और एच) का हिस्सा हैं to10 गुना इसी पैनल में बढ़ाई बढ़ाया (डी, ई और एफ)। पैनल डी में चित्रित उप-क्षेत्र (मक्का का तेल, 10 गुना बढ़ाई) पैनलों डी, ई में पैनल जी तीर में 60 गुना बढ़ाई बढ़ाया है, एफ और जी प्रतिनिधि सी FOS सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है। सभी स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। (पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पृष्ठीय Striatal सी-Fos एक्टिवेशन
मकई तेल काफी (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) पानी (*) या जिंक गम (#) (Figur के लिए पृष्ठीय स्ट्रिएटम सापेक्ष में वृद्धि हुई सी-Fos मायने रखता हैई 8A)। ग्लूकोज या काफी fructose (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) साकारीन (+) (चित्रा 8A) की वृद्धि हुई पृष्ठीय striatal FLI रिश्तेदार। इसके विपरीत, साकारीन पृष्ठीय striatal सी-Fos सक्रियण जानने में पानी से अलग करने में विफल रहा। दिखा वृद्धि हुई मकई तेल, पानी के लिए glucose- या फ्रुक्टोज प्रेरित FLI रिश्तेदार जानवरों के 9 प्रदर्शित करता प्रतिनिधि पृष्ठीय striatal वर्गों चित्रा।

आंकड़ा 8
8 चित्रा वसा या चीनी का सेवन विभिन्न पृष्ठीय striatum और उदर tegmental क्षेत्र में सी-FOS एक्टिवेशन बढ़ जाती है। पृष्ठीय atriatal (पैनल) और उदर tegmental क्षेत्र (पैनल बी) परिवर्तन सी FOS सक्रियण के लिए विख्यात थे (मतलब ± SEM) निम्नलिखित पानी, साकारीन, जिंक गम, ग्लूकोज, फ्रक्टोज या मक्का का तेल की खपत (1 घंटा)। (पहले 69 प्रकाशित किया।)

9 चित्रा
9 चित्रा वास्तविक पृष्ठीय Striatal सी FOS एक्टिवेशन वसा और शर्करा के बाद। सी FOS सक्रियण मक्का का तेल (पैनलों ए (4 गुना बढ़ाई), डी (10 गुना बढ़ाई) और जी के सेवन से अवगत कराया पशुओं में मनाया गया था (60 गुना बढ़ाई)), ग्लूकोज (पैनलों बी (4 गुना बढ़ाई) और (10 गुना बढ़ाई)), फ्रक्टोज (पैनलों सी (4 गुना बढ़ाई) और एफ (10 गुना बढ़ाई)) में पानी के सेवन की तुलना में काफी अधिक थे (पैनलों एच (4 गुना बढ़ाई) और मैं (10 गुना बढ़ाई))। चित्रित उप-एकपैनलों ए (मकई तेल) में पृष्ठीय स्ट्रिएटम के reas, बी (ग्लूकोज), सी (fructose) और एच (जल) संकेत कर रहे हैं कि इसी पैनल (डी, ई, एफ और मैं) में to10 गुना बढ़ाई बढ़ाया। पैनल डी में चित्रित उप-क्षेत्र (मक्का का तेल, 10 गुना बढ़ाई) पैनलों डी, ई में पैनल जी तीर में 60 गुना बढ़ाई बढ़ाया है, एफ और जी प्रतिनिधि सी FOS सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है। सभी पैमाने सलाखों पैनल जी (50 माइक्रोन) के अलावा 100 माइक्रोन कर रहे हैं। (पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

VTA सी-Fos एक्टिवेशन
मकई तेल काफी (पी <0.05, Tukey एचएसडी परीक्षण) वें + VTA कोशिकाओं जिंक गम नियंत्रण (#) (चित्रा 8B) के सापेक्ष में वृद्धि हुई सी-Fos मायने रखता है। इसके विपरीत, ग्लूकोज, फ्रक्टोज या साकारीन VTA सापेक्ष में सी-Fos मायने रखता बदल करने में विफल पानी के लिए। 10 प्रदर्शित करता है चित्रा प्रतिनिधि वें + और ​​गु और दिखा पानी के लिए बढ़ा मक्का का तेल प्रेरित FLI रिश्तेदार जानवरों के सी-Fos-सक्रिय VTA कोशिकाओं।

चित्रा 10
चित्रा 10 वास्तविक उदर tegmental क्षेत्र ग FOS एक्टिवेशन वसा और शर्करा के बाद। VTA सी FOS सक्रियण मक्का का तेल (पैनलों ए (4 गुना) और सी (10 गुना)) और पानी (पैनलों बी के संपर्क में पशुओं में मनाया गया (4 गुना) और विकास (10 गुना))। काला तीर, प्रतिनिधि डबल लेबल वें / C-FOS सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है जबकि ग्रे तीर ही कोशिकाओं से संकेत मिलता प्रतिनिधि सी FOS। सभी स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। (पहले प्रकाशित 69।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> साइटें और समाधान के बीच सी-Fos एक्टिवेशन के रिश्ते
(आर = 0.971) मक्का का तेल के संपर्क में पशुओं में सी-Fos गिनती के पैटर्न महत्वपूर्ण (पी <0.05) सकारात्मक एनएसी कोर और या तो एनएसी खोल के बीच सह-संबंध का पता चला या पूरे mPFC (आर = 0.670), prelimbic mPFC और बीच या तो infralimbic mPFC (आर = 0.940) या पृष्ठीय स्ट्रिएटम (आर = .849), infralimbic mPFC और पृष्ठीय स्ट्रिएटम के बीच (आर = .749), basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी के बीच (आर = 0.999), और बीच पृष्ठीय स्ट्रिएटम और VTA (आर = .723)। (आर = -0.712) इसके विपरीत, मक्का का तेल के संपर्क में पशुओं में सी-Fos गिनती के पैटर्न महत्वपूर्ण (पी <0.05) नकारात्मक basolateral एमी और या तो एनएसी कोर के बीच सह-संबंध का पता चला या खोल (आर = -0.708), और केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी और या तो एनएसी कोर के बीच (आर = -0.712) या खोल (आर = -0.710) सी-Fos की व्याप्ति पैटर्न में जानवरों ई मायने रखता हैपता चला महत्वपूर्ण (पी <0.05) सकारात्मक prelimbic और infralimbic mPFC (आर = 0.930) के बीच सह-संबंध ग्लूकोज पृष्ठीय स्ट्रिएटम और या तो VTA के बीच Xposed (आर = .821), basolateral (आर = 0.910) या केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे का (आर = 0.911) एमी, और basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे के बीच (आर = 0.999) एमी। (आर = 0.969) फ्रुक्टोज के संपर्क में पशुओं में सी-Fos गिनती के पैटर्न महत्वपूर्ण (पी <0.05) सकारात्मक एनएसी कोर और या तो एनएसी खोल के बीच सह-संबंध का पता चला या prelimbic mPFC (आर = .740), एनएसी खोल और बीच prelimbic mPFC (आर = .733), prelimbic और infralimbic mPFC के बीच (आर = .959), और basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी के बीच (आर = 0.996) संपर्क में पशुओं में सी-Fos गिनती की व्याप्ति पैटर्न का पता चला साकारीन करने के लिए महत्वपूर्ण (पी <0.05) एनएसी कोर और एनएसी खोल के बीच सकारात्मक सहसंबंध (आर = .792), एनएसी खोल और पृष्ठीय स्ट्रिएटम के बीच (आर = .715), और prelimbic mPFC एक के बीचएन डी infralimbic mPFC (आर = 0.999)।

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Discussion

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अध्ययन के लक्ष्य सेलुलर सी FOS तकनीक का उपयोग करता है, तो स्रोत (VTA) और अग्रमस्तिष्क प्रक्षेपण लक्ष्यों को डीए इनाम से संबंधित न्यूरॉन्स की (एनएसी, एमी, mPFC) एक साथ चूहों में वसा और शर्करा के उपन्यास घूस के बाद सक्रिय थे निर्धारित किया गया था । वर्तमान अध्ययन में पहले 69 में प्रकाशित एक अध्ययन के प्रोटोकॉल की एक विस्तृत वर्णन है। यह धारणा थी कि VTA, prelimbic और infralimbic mPFC, कोर और एनएसी के खोल और basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी, साथ ही साथ पृष्ठीय स्ट्रिएटम के लिए अपने प्रमुख प्रक्षेपण जोनों एक वितरित मस्तिष्क नेटवर्क 24 के रूप में कार्य करेगा -27, और प्रदर्शित समन्वित और एक साथ FLI ग्लूकोज (8%), फ्रक्टोज (8%) या मक्का का तेल (3.5%) साकारीन (0.2%), पानी और अन्य नियंत्रण के समाधान के समाधान के रिश्तेदार के उपन्यास सेवन के बाद। मकई का तेल, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज, लेकिन साकारीन VTA, prelimbic और infralimbic सांसद के सेवन का उत्पादन महत्वपूर्ण और अंतर FLI सक्रियण नहींएफसी, कोर और एनएसी, basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी की खोल, और पृष्ठीय स्ट्रिएटम। सी-FOS तकनीक के अलावा, चीनी, वसा और कृत्रिम स्वीटनर सेवन के व्यवहार उपायों कार्यरत थे।

एक महत्वपूर्ण कदम है, सेवन के समय पर नमूने ऐसी है कि वे अपेक्षाकृत बराबर होगा शामिल जिससे यह सुनिश्चित करना है कि साइटों भर में सी-FOS सक्रियण में कोई मतभेद थे की वजह से नहीं बल्कि समाधान या तो पैटर्न या सेवन की भयावहता सेवन किया जा रहा। आधारभूत साकारीन सेवन के चार दिन सुनिश्चित किया है कि खाना-प्रतिबंधित जानवरों समाधान नमूना जल्दी से, और इस तरह गैर विशिष्ट प्रभाव को कम से कम। एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम है कि प्रक्रिया पशुओं के लिए कम से कम तनाव या नवीनता कारण के रूप में सेवन प्रकार के भावनात्मक संयोजक स्वतंत्र में परिवर्तन भी सी-FOS सक्रियण का उत्पादन कर सकता था। इसलिए, निष्कर्षों से संबंधित इस दृष्टिकोण और प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता के लिए एक ठोस 'की अवधारणा का सबूत "प्रदानपहचान के लिए कि क्या वसा को तीव्र जोखिम (जैसे, मक्का का तेल), शर्करा (ग्लूकोज और फ्रुक्टोज) और गैर-पोषक स्वीटनर (साकारीन) समाधान एक साथ महंगाई भत्ते की मध्यस्थता रॉय सक्रिय तरीके से एक समन्वित वितरित मस्तिष्क प्रणाली 24-27 का सूचक है।

1 घंटे की परीक्षा में कम विलंबता के साथ 51,52 बलिदान क्योंकि इष्टतम सी-Fos सक्रियण समय के प्रति संवेदनशील प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता से पहले, पहले से मान्य प्रक्रियाओं 42,44 को बड़ा समाधान नमूना। इस प्रकार, भोजन प्रतिबंधित चूहों 0.2% साकारीन समाधान के साथ (10 मिलीलीटर, 1 घंटा) 4 दिनों के लिए प्रशिक्षित किया है, और पांचवें दिन पर परीक्षण समाधान दिया गया। आधारभूत साकारीन सेवन काफी है और उत्तरोत्तर वृद्धि हुई है, और पांचवें दिन फ्रक्टोज और ग्लूकोज, लेकिन नहीं मक्का का तेल या साकारीन सेवन चौथे दिन साकारीन सेवन की तुलना में काफी अधिक थे। इसलिए, वृद्धि हुई FLI काफी वृद्धि हुई (ग्लूकोज, फ्रक्टोज) के साथ जुड़े समाधान या (मक्का का तेल) का सेवन पुन को प्रभावित करने में विफलपिछले साकारीन प्रशिक्षण के लिए lative, और एक इनाम से संबंधित व्यवहार प्रोत्साहन तंत्र के माध्यम से मध्यस्थता जा दिखाई दिया। सावधानी से विचार नमूना और व्यवहार की समानता सुनिश्चित करने के लिए उठाए जाने की जरूरत है। अन्य शोधकर्ताओं को प्रभावी ढंग से प्रतिमान में उपन्यास समाधान के अन्य प्रकार के बदलाव के अध्ययन या अनुकूलन और सीखने से संबंधित तंत्र को समझने के लिए लागू करने के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग कर सकते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल का लाभ, अच्छी तरह से अध्ययन शर्करा (फ्रुक्टोज, ग्लूकोज) और वसा के प्रभाव की तुलना (मक्का का तेल) और महत्वपूर्ण नियंत्रण की तुलना के साथ प्रभाव को सक्रिय (गैर पोषक स्वीटनर, साकारीन तुलना उनकी ग FOS करने की क्षमता है एक नियंत्रण पायसीकारकों, जिंक गम, और पानी), और फिर छह संबंधित मस्तिष्क साइटों भर में इन प्रभावों की जांच। हालांकि इस दृष्टिकोण अलग स्वादिष्ट पदार्थों के मस्तिष्क साइटों भर में एक साथ परीक्षा की इजाजत देने में स्पष्ट लाभ है, यह एक संभावित खगोलीय डेटा सेट का निर्माण करने में खामी हैन्यूरोनल अभिव्यक्ति प्रदर्शित कोशिकाओं की। यह अधिक प्रबंधनीय बनाने के लिए हम परीक्षण की स्थिति के सभी में साइट सभी जानवरों के लिए आम के अनुसार तीन प्रतिनिधि राज्याभिषेक स्लाइस का विश्लेषण करने के दृष्टिकोण लिया। इस कोर्स के इन तीन वर्गों में प्रत्येक रॉय के उचित स्तर को चुनने की चेतावनी के साथ है। एमी, एनएसी, mPFC, पृष्ठीय स्ट्रिएटम और VTA के व्यापक rostro दुम हद को देखते हुए, इस चेतावनी को हल्के ढंग से नहीं लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह तो जांचकर्ताओं पर अवलंबी सही सभी साइटों भर में सभी जानवरों भर में तीन प्रतिनिधि वर्गों में से प्रत्येक के चयन में लगातार हो रहा है। इस चुनाव में छोटी गलतियों "झूठी सकारात्मक 'और' झूठी नकारात्मक" करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। मतगणना की क्षमता भी एक प्रासंगिक चर रहा है। इस संभावित उलझाना के लिए हमारे समाधान प्रत्येक रॉय में प्रत्येक खंड के लिए दो बेख़बर रेटर आवंटित करने के लिए, और फिर उस अंतर करदाता विश्वसनीयता (गिनती के सह-संबंध का उपयोग) हमेशा 0.8 पार सुनिश्चित किया गया था। यह दृष्टिकोण, जबकि duplicative, हमें अधिक से अधिक सटीकता के बारे में अब तक आश्वासन दिया के रूप में अंतर करदाता विश्वसनीयता आसानी से इस न्यूनतम कसौटी पार हो गई। एनएसी के उप-क्षेत्रों (कोर बनाम खोल), एमी (Baso पार्श्व बनाम केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे) और mPFC (perilimbic बनाम infralimbic) विश्लेषण किया गया। इन क्षेत्रों में, आगे विभाजित किया जा सकता है विशेष रूप से अलग-अलग एमी नाभिक, पृष्ठीय स्ट्रिएटम के पैच और मैट्रिक्स डिब्बों, और एनएसी खोल (शिखर, मेहराब, कोन, मध्यवर्ती क्षेत्र)। क्योंकि एनएसी खोल लगातार मक्का का तेल, ग्लूकोज या fructose निम्नलिखित FLI में परिवर्तन को प्रदर्शित करने में विफल रहा है, इस संरचना के आगे सब-विश्लेषण प्रदर्शन नहीं कर रहा था। पृष्ठीय स्ट्रिएटम के पैच और मैट्रिक्स क्षेत्रों की निश्चित परीक्षा के लिए आवश्यक आगे प्रतिरक्षाऊतकरसायन तकनीक है कि वर्तमान अध्ययन में कार्यरत नहीं थे, लेकिन एक महत्वपूर्ण अनुवर्ती अध्ययन किया जाएगा। प्रत्येक उप-क्षेत्र के भीतर व्यक्तिगत एमी नाभिक का विश्लेषण भी एक अतिरिक्त भविष्य के अध्ययन के लिए किया जाएगा।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि सफलतागुलाब का सेवन केंद्रीय एमी नाभिक में FLI वृद्धि हुई है, VTA के रूप में अच्छी तरह से खोल, लेकिन नहीं कोर, एनएसी की है, फिर भी मौखिक या आईजी साकारीन लेनी काफी हद तक अप्रभावी 55-57, 60-62 कर रहे हैं। ग्लूकोज और फ्रुक्टोज सेवन दोनों केंद्रीय-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी और पृष्ठीय स्ट्रिएटम, एनएसी कोर और basolateral एमी में पूर्व प्रभावी करने में प्रभावी है, और infralimbic mPFC में बाद प्रभावी साथ FLI पर चीनी विशेष प्रभाव हासिल। Saccharin सेवन पानी के लिए किसी भी साइट के सापेक्ष में FLI में किसी भी बदलाव को प्रकाश में लाना करने में विफल रहा। वसा का सेवन भी पिछले अध्ययनों 65-67 में accumbal और mPFC साइटों में FLI वृद्धि हुई है, और VTA, infralimbic और prelimbic mPFC, पृष्ठीय स्ट्रिएटम, एनएसी कोर में एक साथ महत्वपूर्ण सक्रियण का उत्पादन किया, और basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी।

हालांकि पिछले अध्ययनों प्रदर्शन किया है कि चीनी और वसा का सेवन व्यवस्थित प्रेरित अग्रमस्तिष्क मेसो-corticolimbic और nigro-striatal डीए प्रणालियों में FLI, वर्तमान अध्ययनVTA में मूल्यांकन एक साथ FLI सक्रियण, basolateral और मध्य-कॉर्टिको औसत दर्जे एमी, पृष्ठीय स्ट्रिएटम, prelimbic और infralimbic mPFC, एनएसी कोर और खोल मक्का का तेल, फ्रक्टोज, ग्लूकोज या साकारीन की तीव्र सेवन के बाद। उल्लेखनीय FLI बढ़ जाती है अत्यधिक अग्रमस्तिष्क साइटों भर में एक दूसरे से जुड़े हुए थे, वितरित मस्तिष्क नेटवर्क सक्रियण चीनी और वसा का सेवन मध्यस्थता करने के विचार का समर्थन। ऐसे कई मस्तिष्क लोकी में एक साथ परिवर्तन की पहचान प्रोटोकॉल पुरानी और binging की शर्तों के तहत के साथ ही कंडीशनिंग और वरीयताओं के तहत उपयोग किया जा सकता है। इन अध्ययनों से पता चलता है कि एक मजबूत शारीरिक सहसंबंधी (सी-FOS) को प्रभावी ढंग से एक साथ स्वादिष्ट सेवन और जानवरों में वरीयताओं कि मानव चिकित्सा मोटापा, मधुमेह से संबंधित स्थिति और अन्य विकारों खाने में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है मध्यस्थता के लिए उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए कई मस्तिष्क साइटों में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

इस परियोजना पर उनकी कड़ी मेहनत के लिए डायना इकाज़ा-Culaki, Cristal सैम्पसन और Theologia Karagiorgis करने के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

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Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

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