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Neuroscience

Detecção simultânea de c-Fos Ativação de mesolímbico e mesocortical dopamina Sites Recompensa Após Naive açúcar e gordura ingestão em ratos

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

O objetivo deste estudo é identificar redes cerebrais distribuídos relacionadas com a recompensa por delinear uma técnica de imuno confiável usando a ativação de c-fos celular para medir as mudanças simultâneas nos caminhos da dopamina e locais de terminal após a novela ingestão de gordura e açúcar em ratos.

Abstract

Este estudo usa a ativação c-fos celular para avaliar os efeitos do romance ingestão de gordura e açúcar em dopamina no cérebro (DA) vias em ratos. Ingestão de açúcares e gorduras são mediadas por suas atrações inatas, bem como as preferências aprendidas. dopamina do cérebro, especialmente meso-límbico e projecções a partir de meso-cortical a área tegmental ventral (VTA), tem sido implicada em ambas estas respostas ignorantes e aprendidas. O conceito de redes cerebrais distribuídos, em que vários sites e sistemas emissor / peptídeos interagem, foi proposta para mediar a ingestão de alimentos saborosos, mas não há evidência limitada demonstrando empiricamente tais ações. Assim, a ingestão de açúcar provoca imunorreatividade DA libertação e aumenta c-fos-like (FLI) a partir de zonas de projeção VTA DA individuais, incluindo o núcleo accumbens (NAC), amígdala (AMY) e medial córtex pré-frontal (mPFC), bem como o striatum dorsal. Além disso, administração central dos antagonistas selectivos do receptor de DA para estes locals diferencialmente reduzir aquisição e expressão de preferências de sabor condicionado desencadeados pela açúcares ou gorduras. Uma abordagem que permitam determinar se esses locais interagiram como uma rede do cérebro distribuídos em resposta ao açúcar ou gordura ingerida seria simultânea avaliar se o VTA e seus principais zonas de projeção mesotelencephalic DA (prelimbic e infralimbic mPFC, núcleo e concha do NAC basolateral e-centro-córtico medial AMY), bem como o corpo estriado dorsal exibiria coordenado e activação FLI simultânea após a ingestão oral, não condicionado de óleo de milho (3,5%), glucose (8%), frutose (8%) e a sacarina (0,2 soluções%). Esta abordagem é um primeiro passo bem sucedido em identificar a viabilidade do uso de ativação c-fos celular simultaneamente em todos os locais do cérebro relevantes para estudar a aprendizagem relacionadas com a recompensa na ingesta de alimentos em roedores.

Introduction

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Cérebro de dopamina (DA) tem sido implicado em respostas centrais para ingestão de açúcares palatáveis ​​através proposta hedônica 1,2, 3 e hábito à base de 4,5 mecanismos de ação relacionados com o esforço. A via DA primária implicados nesses efeitos origina na área tegmental ventral (VTA) e projetos ao accumbens (NAC) de núcleo e concha, a amígdala basolateral e centro-córtico-medial (AMY), núcleo eo prelimbic e medial infralimbic córtex pré-frontal (mPFC) (ver comentários 6,7). O VTA tem sido implicado na ingestão de sacarose 8,9, e liberação DA é observada após a ingestão de açúcar no NAC 10-15, AMY 16,17 e mPFC 18-20. Ingestão de gordura também estimula DA NAC liberar 21, e outra zona de projeção DA-rico para o striatum dorsal (caudado-putâmen) foi também associada a DA-mediada alimentar 22,23. Kelley 24-27 propôs que estes múltiplos projetoszonas de íon deste sistema DA-mediada formaram uma rede cerebral distribuída integrada e interativa através de extensas e íntimas interconexões 28-34.

Para além da capacidade dos antagonistas dos receptores DA D1 e D2 para reduzir a ingestão de açúcares e gorduras 35-37 38-40, sinalização DA também tem sido implicado na mediação da capacidade dos açúcares e gorduras para produzir as preferências de sabor condicionado (PCP) 41- 46. Microinjeções de um antagonista dos receptores DA D1 para o NAC, AMY ou mPFC 47-49 eliminar aquisição da PCP suscitou por intragástrico glicose. Considerando microinjeções de antagonistas do receptor quer DA D1 ou D2 na mPFC elimina aquisição de frutose-PCP 50, a aquisição e expressão de frutose-PCP são diferencialmente bloqueado por antagonistas de DA no NAC e AMY 51,52.

A técnica 53,54 c-fos foi empregue para investigar activatio neuralN induzida pela ingestão de paladar agradável e de activação neuronal. O termo "activação de c-fos" será usada em todo o manuscrito, e é operacionalmente definido por um aumento da transcrição de c-fos durante a despolarização neuronal. Ingestão de sacarose aumentou Expressão de Fos (ILF) no núcleo AMY central, o VTA, bem como a casca, mas não do núcleo, do NAC 55-57. Enquanto a ingestão de sacarose em ratos que se alimentam de sham aumentou significativamente FLI na AMY eo NAC, mas não o VTA 58, intragástrica de sacarose ou glicose infusões aumentou significativamente FLI no NAC e núcleos centrais e basolateral da AMY 59,60. Adição repetida de sacarose para acesso Chow programada aumentada FLI na CPFm, bem como a casca de NAC e o núcleo 61. Um paradigma de redução de marcha concentração de sacarose revelou que os maiores aumentos FLI ocorreu no AMY basolateral e NAC, mas não o VTA 62. Seguindo condicionado, extinção de rewa naturais relacionados com o açúcarcomportamentos rd aumentou FLI na AMY basolateral eo NAC 63. Além disso, o emparelhamento disponibilidade de açúcar a um tom resultou no aumento dos níveis de tom subsequentemente FLI na AMY basolateral 64. Ingestão de alto teor de gordura também aumentou FLI no NAC e mPFC locais 65-67.

A maioria dos estudos citados anteriormente açúcar e gordura efeitos examinada na ativação c-fos em locais únicos que não fornecem informações sobre a identificação de redes cerebrais distribuídos relacionadas com a recompensa 24-27. Além disso, muitos dos estudos também não delinear as contribuições relativas de sub-áreas do NAC (núcleo e casca), AMY (basolateral e-córtico-medial central) e mPFC (prelimbic e infralimbic) que poderiam ser examinados pelo vantagem de excelente resolução espacial, de uma única célula no mapeamento c-Fos 68. 69 O nosso laboratório usado recentemente activação de c-fos e alterações ao mesmo tempo medidos na via VTA DA e a sua prózonas de injeção (NAC, Amy e mPFC) após novela ingestão de gorduras e açúcares em ratos. O presente estudo descreve as etapas processuais e metodológicas para analisar simultaneamente se a exposição aguda a seis soluções diferentes (óleo de milho, glicose, frutose, sacarina, água e um controle de emulsão de gordura) seria diferencialmente ativar FLI em sub-áreas do NAC, AMY, CPFm, bem como o corpo estriado dorsal. Esta detecção simultânea de diferenças permitida a confirmação de efeitos significativos sobre FLI em cada local e determinação sobre se as mudanças em um determinado site correlacionadas com alterações de sites relacionados, proporcionando assim um apoio para uma rede do cérebro distribuídos 24-27. Estes procedimentos testados se o VTA, o prelimbic e infralimbic CPFm, o núcleo e a casca da NAC, e o AMY basolateral e centro-cortico-medial), bem como o corpo estriado dorsal exibiria coordenado e activação FLI simultânea depois, a ingestão não condicionada por via oral de glucose (8%), frutose (8%), óleo de milho (3,5%) e soluções de sacarina (0,2%).

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Protocol

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Estes protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal certificando que todos os assuntos e procedimentos estão em conformidade com o National Institutes of Health Guide para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Temas

  1. Compra e / ou do sexo masculino da raça Sprague-Dawley (260-300 g).
  2. ratos Casa individualmente em gaiolas de malha de arame. Mantê-los numa 12:12 h ciclo claro / escuro com ração e água disponíveis ad libitum.
  3. Atribuir os tamanhos das amostras apropriadas (por exemplo, N ≈ 6-8) aleatoriamente em grupos.

2. Equipamentos e ingestão de procedimentos de teste

  1. Utilize tubos de centrífuga calibrado com rolhas de borracha e um tubo de metal Sipper ângulo de 45 ° para proporcionar uma medição precisa (± 0,1 ml) das soluções apresentadas. Fixá-los à gaiolas de alojamento por uma mola de metal esticada para permitir a visibilidade das calibrações.
  2. Restringir rações alimentares (~15 / g / dia) dos ratos para reduzir o peso para 85% do seu peso corporal original para aumentar a motivação para consumir as soluções. Nota: A redução de peso deve demorar entre 3-5 dias.
  3. Fornecer soluções de pré-formação (10 ml) de 0,2% sacarina durante quatro dias através de uma sessão de 1 hora para maximizar a probabilidade de que os ratos irão provar as soluções de ensaio subsequentes com latência curta (menos de 1 min).
  4. Confirmam o caudal através do tubo de centrífuga por derramar algumas gotas.
  5. Pesar os tubos antes e depois de cada sessão para obter uma medição de admissão.
  6. Executar um teste de ingestão no quinto dia em subgrupos receberam uma das seis soluções (10 ml, 1 h): a) água, b) romance aromatizado (0,05% aroma de cereja) 0,2% de sacarina, c) 8% de frutose, d), 8 % de glucose, e) o óleo de milho 3,5% suspenso em goma de xantano 0,3%, e f) 0,3% de goma de xantano.
  7. Certifique-se de que as soluções nutritivas são isocalóricas; Assim, a concentração de óleo de milho 3,5% é isocalórica para as soluções de açúcar 8%.
  8. Certifique-them soluções de amostra ratos com latência curta (menos de 1 min). Se este requisito não for cumprido, em seguida, descartar o assunto do estudo.

3. Preparação do Tecido

  1. Anestesiar cada animal através de uma injecção intraperitoneal de pentobarbital de 90 minutos após a exposição inicial a cada solução de ensaio. Confirmar que os animais estão devidamente anestesiados pela demonstração de que o animal não é mais sensível a esses reflexos como a retirada de beliscar pé, piscando na sequência de pressões da córnea, direta ou balançando a cabeça ao estímulo pavilhão auricular profunda.
  2. Perfundir cada animal transcardialmente como descrito anteriormente 69.
    1. Anestesiar ratos com uma overdose de pentobarbital sódico (65 mg / kg), retire a caixa torácica e expor o peito para o acesso livre para o coração 69.
    2. Coloque a agulha no ápex da válvula do coração esquerdo, e cortar a veia cava. Administrar solução tampão de fosfato (PBS, ~ 180 mL), seguido por um fixador co tamponado com fosfatontaining paraformaldeído a 4% (~ 180 mL).
    3. Certifique-se de que o animal realmente está sendo perfundido corretamente examinando se o líquido está deixando outras cavidades, como o nariz, boca e áreas genitais. Nota: a fixação adequada com paraformaldeído será acompanhado por grandes movimentos musculares. Se isso não ocorrer, volte a ajustar a agulha até que ocorra essa reação.
  3. Remover o cérebro do crânio rapidamente cortando pêlo e da pele longe do crânio. Use fórceps para quebrar e remover o osso do cérebro que se deslocam de trás para a frente. Trabalho inicialmente na área abaixo e por trás do cerebelo, assegurando que o rongeur é entre o osso e pia-máter meníngea. Uma vez que a parte superior e os lados do crânio é removido, usar uma pequena espátula para levantar o cérebro a partir da base, e cortar nervos cranianos com pequenas tesouras. Tenha cuidado para não danificar o cérebro durante a tentativa de remover o osso.
  4. Fixar os cérebros em uma solução de paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C.Colocar os cérebros numa solução de PBS sacarose a 30% / 70% à temperatura ambiente até que eles se depositam no fundo do recipiente.
  5. Bloquear o cérebro
    1. Remova a parte rostral do cérebro corte caudal transversalmente ao bulbo olfativo.
    2. Remover a parte caudal do cérebro cortando transversalmente ao nível do cerebelo e da ponte.
  6. Monte o cérebro coronal com a parte caudal fixo para o palco de um micrótomo deslizante, e corte cortes coronais (40 mm) através do mPFC (2,86-2,20 mm rostral à bregma), o núcleo NAC e shell e dorsal striatum (+ 1,76-1,60 mm rostral à bregma), o AMY (-2,12 - -2,92 mm caudal ao bregma), e o VTA (-5,20 - -5,60 mm caudal ao bregma). Use um rato atlas do cérebro de 70 para orientação.
  7. Recolhe secções de flutuação livre em poços individuais de uma placa de 24 poços com PBS durante 71 eventual análise imuno-histoquímica. Use Parafilm para selar a 24 nósplaca ll para se certificar de que a PBS não evaporar no recipiente e secar o cérebro. Armazenar o tecido cerebral em 4 ° C.

4. Procedimentos de c-fos (Adaptado de 71)

  1. Tratar cada secção com 5 ml de 5% de Soro normal de cabra e 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h.
  2. Incubar as secções tratados com os anticorpos primários (anticorpo de coelho anti-c-fos, 1: 5000) a 4 ° C durante 36 horas em poços contendo 1 mL de PBS.
  3. Lavar as secções 3x com PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  4. Incubar com anticorpos secundários (anticorpos de cabra anti-coelho biotinilado; 1: 200) à TA durante 2 horas em poços contendo 1 mL de PBS.
  5. Lavar 3x cada secção em PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  6. Incubar as secções enxaguado durante 2 horas numa mistura de avidina-peroxidase de rábano disponíveis comercialmente que vem num kit composto por Avadin DH (100 ul) e biotinilada peroxidase H (100 uL) em 5 ml de PBS.
  7. Re-lavar as seções 3x na PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  8. Reagir as secções com 0,05% de diaminobenzidina (DAB) na presença de 0,0015% de H 2 O 2 durante 5 - 10 minutos, dependendo da reactividade do tecido em poços contendo 5 ml de solução de DAB.
  9. Duplo-label as seções VTA. Incubar-los com um anticorpo da tirosina hidroxilase (TH) (coelho anti-rato TH, 1: 2000) em PBS (5 ml) durante a noite a 4 ° C.
  10. Enxaguar secções 3x em PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  11. Incubar com anticorpos secundários (anti-coelho de cabra biotinilado; 1: 200) em PBS (5 ml) à temperatura ambiente durante 2 h.
  12. Enxaguar secções 3x em PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  13. Visualizar os anticorpos por meio de um complexo anticorpo-peroxidase secundário. Reagir com uma combinação de 0,05% de DAB e uma solução de sulfato de níquel de 0,3%, para 5 - 10 min, dependendo da reacção do tecido em poços contendo 5 ml da solução DAB / NiCl.
  14. Certifique-se de que a solução DAB é verde claro de cor leitosa a partir deles reacção com o sulfato de níquel de 0,3%. Se a solução for demasiado verde, então a reacção será muito escura.
  15. Montar todas as secções em lâminas revestidas com gelatina. Deixe-os secar durante a noite, e depois cobri-derrapante com algumas gotas de uma solução baseada em tolueno (TBS).
  16. Código desliza de modo que a condição experimental é desconhecida para os observadores.

5. Determinação do c-fos imunorreactiva Counts

  1. Atribuir pares de observadores imparciais contar neurônios Fos-positivos nessas regiões de interesse (ROI): prelimbic mPFC, infralimbic mPFC, núcleo NAC, NAC escudo, núcleos AMY basolateral, AMY-centro-córtico medial, striatum dorsal, e VTA. Delinear se c-Fos imunorreatividade estava presente em TH + e TH células da VTA. A Figura 1 fornece uma imagem capturada de tela do NAC do microscópio.

figura 1
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Analisar, pelo menos, três fatias representativas por sítio comum a todos os animais em todas as condições de teste.
  2. Use um software e um microscópio óptico para analisar toda a região para cada ROI, traçando um esboço (Figura 1).
    1. Para um determinado site, abra o aplicativo e clique no menu drop-down aquisição e clique em "Imagem Live". Trazer o ROI em foco e clique na tela para estabelecer um ponto de referência. Então trace a região escolhida do cérebro usando a grade como um guia. Uma vez que o rastreamento é concluído, contagem de células (passos 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Clique duas vezes no ícone do software. Vá para a barra de menu, clique em "Aquisição" e depois "Imagem Live". Trazer o ROI em foco e clique na tela para estabelecer um ponto de referência.
      2. Vá para a barra de ferramentas de rede e clique em "Display Grid" e "rótulos Use grade". Delinear o ROI com um traço predeterminado.
      3. Contagem de todas as células em cada área ROI, selecione um "+" na barra lateral esquerda para manter a contagem de células c-fos. Clique em cada célula individualmente para registrar a contagem. Considere-se uma célula positiva para o c-fos, quando um circulo vermelho escuro definido é observado (Figura 1).
    2. Repita esse processo para cada site.
    3. Gravar conta em um caderno de laboratório e no computador para análise futura. Vá para a barra de menu, clique em "Arquivo", "Salvar arquivo de dados" para salvar a detecção e contagem.
    4. Certifique-se de que a confiabilidade entre avaliadores (utilizando a correlação de contagem) dos dois avaliadores desinformados para cada seção em cada ROI sempre superior a 0,8.

    6. Estatísticas

    1. Avaliar a ingestão de sacarina de linha de base durante os primeiros quatro dias usando um com medidas repetidas análise 1 de variância (ANOVA), comparando as entradas de sacarina dos Dias 1, 2, 3 e 4 69.
    2. Compare ingestão de sacarina (Dia 4) com entradas de teste (dia 5) dos seis grupos que utilizam a-blocos casualizados, 2-way ANOVA 69.
    3. Use comparações de Tukey (P <0,05) para determinar os efeitos significativos individuais 69.
    4. Determinar a confiabilidade entre avaliadores, e depois usar a contagem de um observador comum.
    5. Contagens médias c-fos para as três fatias representativas para cada local 69.
      1. Executar uma 1-way ANOVA de activação de c-fos induzida por ingestão das seis soluções (3,5% de óleo de milho, 8% de glucose, 8% de frutose, 0,2% de sacarina aromatizada, xacontrole Nthan goma e água) para a perilímbica mPFC 69.
      2. análises paralelas repetição dos seis grupos para infralimbic mPFC, núcleo NAC, shell NAC, basolateral AMY, AMY-centro-córtico medial, VTA e striatum dorsal. Use comparações de Tukey (P <0,05) para revelar efeitos significativos individuais 69.
    6. Compare ingestão de óleo de milho com a ingestão de água e ingestão de seu agente de suspensão, goma xantana. Comparar frutose e glicose com entradas tanto a ingestão de água e da ingestão do edulcorante não nutritivo, a sacarina.
    7. Estabelecer se relações significativas entre a ingestão de soluções e ativação de c-fos em cada um dos locais foram observadas utilizando correlações r Bonferroni (p <0,05).
      1. Sistematicamente comparar as contagens de c-fos na perilímbica e no córtex pré-frontal infralimbic para cada animal no grupo óleo de milho 3,5%.
      2. Repetir análises sistematicamente paralelas de cada par dos seis locais (VTA, striatum dorsal, infralimbic mPFC, perilímbica mPFC, NAC core, shell NAC, basolateral AMY,-centro-córtico medial AMY) para o óleo de milho 3,5%.
      3. Repetir análises sistematicamente paralelas destes seis locais para as outras cinco condições experimentais de admissão (8% de glucose, 8% de frutose, 0,2% de sacarina aromatizado, de controlo de goma de xantano e água).
    8. Tirar proveito do facto de que os mesmos animais dentro de uma condição da solução, foram avaliados em todos os locais, determinando as relações significativas entre a activação de c-fos através de soluções e dentro de cada solução utilizando Bonferroni r correlações (p <0,05).

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Representative Results

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Todos os resultados representativos descritos abaixo foram publicados anteriormente 69, e são re-apresentado aqui para apoiar "prova de conceito" na indicação da eficácia da técnica.

solução Intakes
diferenças significativas na ingestão de sacarina de base foram observados durante os primeiros quatro dias para todos os animais (F (3,108) = 57,27, p <0,001) com entradas (Dia 1: 1,3 (± 0,2) ml; Dia 2: 3,9 (± 0,4) ml ; Dia 3: 5,9 (± 0,6) ml; Dia 4: 7,1 (± 0,6) ml) de forma significativa (p <0,05, teste de Tukey HSD) e progressivamente crescente. ingestão de frutose e ingestão de glicose, mas não o óleo de milho ou a sacarina no dia 5 de forma significativa (p <0,05, teste de Tukey HSD teste) aumentaram em relação ao dia de ingestão 4 sacarina (p <0,05, teste de Tukey HSD teste) com frutose (9,6 (± 0,4) ml ) e glicose (9,4 (± 0,6) ml) significativamente mais elevada do que SACCingestão harin. Além disso, o consumo de óleo de milho (7,4 (± 0,6) ml) foi significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) mais elevada do que a ingestão de goma de xantano.

Estes resultados levantaram a possibilidade de que a ingestão de solução por si só pode explicar qualquer activação de c-fos observada em qualquer um dos sites. Para examinar esta, foram realizadas correlações r Bonferroni em que a ingestão das cinco soluções foi relacionada com a activação de c-fos em cada um dos seis locais. correlações significativas conseguiram ser observado entre a ingestão de solução e a activação de c-fos no núcleo (R (29) = 0,186), invólucro (R (29) = 0,029) ou total (R (29) = 0,10) Nac, o prelimbic ( R (29) = 0,23), infralimbic (R (29) = 0,30) ou total (R (29) = 0,14) CPFm, o VTA (R (29) = 0,10), o striatum dorsal (R (29) = 0,14 ) ou a basolateral (R (29) = 0,47), o Centro-cortico-medial (R (29) = 0,48) ou total (R (29) = 0,409) AMY. Dada a elevada correlação entre a ingestão e AMY c-fos ativação, ainda correlações foram realizadas para cada solução individual. Significativo (p <0,05, teste de Tukey HSD teste) relações não conseguiu ser observado entre a ingestão e Amy FLI para frutose (basolateral (r = 0,15), Centro-cortico-medial (r = 0,13), total (r = 0,13)), glicose (basolateral (r = 0,17), Centro-cortico-medial (r = 0,17), total r = 0,13)), sacarina (basolateral (r = 0,42), Centro-cortico-medial (r = 0,42), total (r = 0,42)) ou óleo de milho (basolateral (r = 0,54), Centro-cortico-medial (r = 0,59), total (r = 0,64)). Uma significativa (p <0,05, teste de Tukey HSD) foi observada uma correlação negativa entre a ingestão total de goma de xantano e AMY FLI (r = 0,94).

CPFm c-Fos Activação
O óleo de milho significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumento total (Figura 2A), infralimbic (Figura 2B) e prelimbic (Figura 2C) CPFm c-Fos conta em relação à água (*) ou o controlo de goma de xantano(#). Frutose significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumento da contagem de c-fos no infralimbic CPFm em relação à água (*) ou sacarina (+) (Figura 2B), mas não no total ou prelimbic contagens mPFC. Em contraste, a glicose ou sacarina não conseguiu alterar totais, perilímbicos ou infralimbic contagens mPFC c-Fos. A Figura 3 mostra seções mPFC representativas dos animais que apresentaram aumento de milho induzido pelo óleo FLI em relação à água.

Figura 2
Figura 2. gordo ou a ingestão de açúcar diferencialmente Aumenta A activação de c-fos em Medial córtex pré-frontal (CPFm). As alterações na activação de c-fos (média ± EPM) são observadas em todo o CPFm (Painel A), a área CPFm infralimbic (Painel B), e a área prelimbic CPFm (Painel C) após o consumo (1 hr) de água, a sacarina (0,2%), Goma xantana (controlo de óleo de milho), glucose (8%), frutose (8%) ou óleo de milho (3,5%). (Anteriormente publicado 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A real CPFm A activação de c-fos Seguindo gorduras e açúcares. Activação de C-fos foi observado em animais expostos a ingestão de óleo de milho (Painéis A (aumento de 4 vezes) e C (ampliação de 10 vezes)), que foi significativamente maior do que a ingestão de água (Painéis B (aumento de 4 vezes) e D (ampliação de 10 vezes)). Representação das sub-áreas delimitadas, com o Prelimbic (PL) e infralimbic (IL) mPFC são diagramado em Painéis A (óleo de milho) e C (água) assim como a parte de tpainéis mangueira (A e C) está ampliada e uma ampliação de 10 vezes nos painéis correspondentes (B e D). Setas em Painéis C e D indicam células positivas c-fos representativas. Todas as barras de escala são de 100 uM. (Anteriormente publicado 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

AMY c-Fos Activação
O óleo de milho significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD teste) aumentou AMY total (Figura 4A), basolateral (Figura 4B) e-cortico-medial central (Figura 4C) subzona AMY c-Fos conta em relação à água (*) ou o controle de goma de xantano (#). A glucose também significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumento total (Figura 4A), basolateral (Figura 4B) e centro-cortico-medial ( (Figura 4A) e-centro-córtico medial subzona (Figura 4C) do AMY c-Fos conta em relação à água (*) ou sacarina (+), mas não em sub-área do AMY basolateral. Sacarina não conseguiu alterar total, a basolateral ou central-cortico-medial AMY c-Fos conta em relação à água. Uma análise detalhada dos núcleos individuais dentro do AMY revelou que as alterações significativas verificadas na área basolateral da AMY também foram observadas nos núcleos AMY basolaterais e laterais individuais. As mudanças significativas verificadas na zona de centro-córtico medial do AMY também foram observados no indivíduo central, cortical e medial AMY núcleos. Figura 5 apresenta seções AMY representativosde animais que apresentam aumento petróleo milho, glicose, e induzida por frutose FLI em relação à água. (Anteriormente publicado 69).

Figura 4
Figura 4. A gordura ou a ingestão de açúcar diferencialmente Aumenta A activação de c-fos na amígdala (AMI). As alterações na activação de c-fos (média ± EPM) são observadas em todo o AMY (Painel A), a área AMY basolateral (Painel B) , e a área central de AMY-córtico-medial (Painel C) após o consumo (1 hr) de água, a sacarina, goma de xantano, glicose, frutose ou óleo de milho. As alterações significativas verificadas na área basolateral da AMY também foram observadas nos núcleos AMY basolaterais e laterais individuais. As mudanças significativas verificadas na zona de centro-córtico medial do AMY também foram observadas nos núcleos AMY centrais, cortical e medial individuais. (Publicado anteriormente 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Activação AMY real c-fos Seguindo gorduras e açúcares. Observou-se a activação C-fos em animais expostos a ingestão de óleo de milho (Painéis A (aumento de 4 vezes), D (ampliação de 10 vezes) e G (60- vezes de ampliação)), glicose (Painéis B (aumento de 4 vezes) e e (ampliação de 10 vezes)), e a frutose (pains C (ampliação de 4 vezes) e F (10 vezes)), que foram significativamente maiores do que isso da ingestão de água (Painéis H (aumento de 4 vezes) e I (ampliação de 10 vezes)). representaçãoas sub-áreas delimitadas, com o-cortico-medial central (CMC) e AMY basolateral (BLA) estão esquematizados nos painéis A (óleo de milho), B (glicose), C (frutose) e H (água) assim como a parte desses painéis (a, B, C e H) ampliadas a 10 vezes de ampliação nos painéis correspondentes (D, e, F e I). O sub-área delineada no Painel D (óleo de milho, uma ampliação de 10 vezes) é ampliada para ampliação de 60 vezes no Painel D. setas nos Painéis D, E, F, G e I indicam células positivas para c-fos representativos. Todas as barras de escala são 100 uM, excepto para o painel G (50 ^ M). (Anteriormente publicado 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NAC c-Fos Activation
O óleo de milho significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumento total (Figura 6A) e o núcleo ( (Figura 6C). Glucose significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumento da contagem de c-Fos no núcleo NAc (Figura 6B), mas não no total da NAc NAc ou o invólucro em relação a sacarina (+) ou água (*). Em contraste, a frutose e a sacarina falhou para diferir a partir de água para provocar a activação de c-Fos no núcleo e / ou escudo NAc. A Figura 7 mostra secções representativas no núcleo NAc de animais que mostram um aumento óleo- milho ou induzida pela glicose em relação à água FLI .

Figura 6
Figura 6. A gordura ou ingestão de açúcar diferencialmente Aumenta Activation c-fos no NAC. Alterações na ativação do c-fos (média ± SEM) em todo o NAC (Painel A), o núcleo NAC (Painel B), eo shell NAC (Painel C) após o consumo (1 hr) de água, a sacarina, goma de xantano, glicose, frutose ou óleo de milho. (Anteriormente publicado 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. A real NAC núcleo, mas não NAC Shell A activação de c-fos Seguindo gorduras e açúcares. Activação de C-fos foi observado em animais expostos a ingestão de óleo de milho (Painéis A (aumento de 4 vezes), D (ampliação de 10 vezes ) e G (ampliação de 60 vezes)) e glicose (Painéis B (aumento de 4 vezes) e e (ampliação de 10 vezes)), que foram significativamente maiores do que a ingestão de água (pains C (aumento de 4 vezes) e F (10 vezes magnificação)). Representação das sub-áreas delimitadas, com o núcleo Nac e o escudo NAc estão esquematizados nos painéis A (óleo de milho), B (glicose) e C (água) assim como a parte desses painéis (A, B, C e H) ampliado ampliação a 10 vezes nos painéis correspondentes (D, e e F). A sub-área delineada no Painel D (óleo de milho, uma ampliação de 10 vezes) é ampliada para ampliação de 60 vezes no painel G. Arrows em Painéis D, E, F e G indicam células positivas c-fos representativas. Todas as barras de escala são de 100 uM. (Anteriormente publicado 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estriado dorsal c-Fos Activação
O óleo de milho significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumento da contagem de c-fos no estriado dorsal em relação à água (*) ou a goma de xantana (#) (Figure 8A). A glucose ou frutose significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumentou dorsal estriatal FLI sacarina em relação ao (+) (Figura 8A). Em contraste, a sacarina não conseguiu diferem de água na indução dorsal estriado de ativação c-Fos. Figura 9 exibe dorsais representante seções do estriado de animais com aumento petróleo milho, glucose ou induzida por frutose FLI em relação à água.

Figura 8
Figura 8. gordura ou ingestão de açúcar diferencialmente Aumenta Activation c-fos na Dorsal estriado e ventral tegmental área. Dorsal atriatal (Painel A) e na área tegmental ventral (Painel B) foram verificadas alterações para a ativação do c-fos (média ± SEM) seguinte consumo (1 hr) de água, a sacarina, goma de xantano, glicose, frutose ou óleo de milho. (Anteriormente publicado 69).

Figura 9
Figura 9. A activação do estriado dorsal real c-fos Seguindo gorduras e açúcares. C-fos activação foi observado em animais expostos a ingestão de óleo de milho (Painéis A (aumento de 4 vezes), D (ampliação de 10 vezes) e L (60 ampliação fold)), glicose (Painéis B (aumento de 4 vezes) e e (ampliação de 10 vezes)), frutose (Pains C (aumento de 4 vezes) e F (ampliação de 10 vezes)), que foram significativamente maiores do que a ingestão de água (painéis de H (aumento de 4 vezes) e I (ampliação de 10 vezes)). Delineado um sub-reas do striatum dorsal nos painéis A (óleo de milho), B (glicose), C (frutose) e H (água) está indicado que ampliada a 10 vezes de ampliação nos painéis correspondentes (D, E, F e I). A sub-área delineada no Painel D (óleo de milho, uma ampliação de 10 vezes) é ampliada para ampliação de 60 vezes no painel G. Arrows em Painéis D, E, F e G indicam células positivas c-fos representativas. Todas as barras de escala são 100 uM, excepto para o painel G (50 ^ M). (Anteriormente publicado 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

VTA c-Fos Activação
O óleo de milho significativamente (p <0,05, teste de Tukey HSD) aumento da contagem de c-fos em TH + VTA células em relação ao controlo de goma de xantano (#) (Figura 8B). Em contraste, a glucose, a frutose ou a sacarina não conseguiu alterar as contagens c-fos no VTA relativa à água. A Figura 10 mostra células VTA c-Fos-ativados de animais que apresentaram aumento de milho induzido pelo óleo FLI em relação à água representante TH + e TH e.

Figura 10
Figura 10. ventral tegmental área Activação real c-fos Seguindo gorduras e açúcares. VTA foi observada activação de c-fos em animais expostos ao óleo de milho (Painéis A (4 vezes) e C (10 vezes)) e água (Painéis B (4 vezes) e D (10 vezes)). Setas pretas indicam células representativas de marcação dupla TH / c-fos positivas, enquanto as setas cinzentas indicam representativos c-fos apenas células. Todas as barras de escala são de 100 uM. (Anteriormente publicado 69.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ove_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Relações de c-Fos Activation Entre Sites e Soluções
O padrão de contagem de c-Fos em animais expostos ao óleo de milho revelou significativa (p <0,05) correlações positivas entre o núcleo CNS e tanto o shell Nac (r = 0,971) ou a totalidade mPFC (r = 0,670), entre o mPFC prelimbic e quer o infralimbic CPFm (r = 0,940) ou estriado dorsal (r = 0,849), entre o infralimbic CPFm e dorsal estriado (r = 0,749), entre o AMY basolateral e-centro-córtico medial (r = 0,999), e entre o estriado dorsal e do VTA (r = 0,723). Em contraste, o padrão de contagem de c-fos em animais expostos ao óleo de milho revelou significativa (p <0,05) correlação negativa entre a AMY basolateral e quer o núcleo NAc (r = -0,712) ou concha (r = -0,708), e entre o AMY-centro-córtico medial e quer o núcleo Nac (r = -0,712) ou shell (r = -0,710) .O padrão de c-Fos conta em animais eXposed à glicose revelou significativa (p <0,05) correlações positivas entre o prelimbic e infralimbic mPFC (r = 0,930), entre o estriado dorsal e, ou o VTA (r = 0,821), basolateral (r = 0,910) ou-córtico-medial Central (r = 0,911) Amy, e entre o centro e basolateral-cortico-medial (r = 0,999) AMY. O padrão de contagem de c-Fos em animais expostos a frutose revelou significativa (p <0,05) correlações positivas entre o núcleo CNS e tanto o shell Nac (r = 0,969) ou prelimbic mPFC (r = 0,740), entre o reservatório CNS e do prelimbic CPFm (r = 0,733), e entre o prelimbic infralimbic CPFm (r = 0,959), e entre o basolateral e AMY-centro-córtico medial (r = 0,996) .O padrão de contagem de c-fos em animais expostos a sacarina revelou significativa (p <0,05) correlações positivas entre o núcleo CNS e shell Nac (r = 0,792), entre o reservatório e dorsal striatum Nac (r = 0,715), e entre o prelimbic mPFC umND infralimbic CPFm (r = 0,999).

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Discussion

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O objetivo do estudo foi determinar se a fonte (VTA) e as metas de projeção do cérebro anterior (NAC, Amy, mPFC) de Da neurônios relacionados com a recompensa foram ativados simultaneamente após a novela ingestão de gordura e açúcar em ratos utilizando a técnica de c-fos celular . O presente estudo é uma descrição detalhada dos protocolos de um estudo publicado anteriormente 69. Postula-se que o VTA, suas principais zonas de projeção para o prelimbic e infralimbic mPFC, o núcleo ea casca do NAC e do AMY basolateral e centro-córtico-medial, bem como o striatum dorsal agiria como uma rede do cérebro distribuídos 24 -27, e exibir coordenado simultânea e ILF seguinte romance ingestão de glucose (8%), frutose (8%) ou óleo de milho (3,5%) em relação a soluções de sacarina (0,2%), água e outras soluções de controlo. O óleo de milho, glucose e frutose, mas não sacarina ingestão produzida activação significativa e diferencial FLI do VTA, o prelimbic e infralimbic mPFC, o núcleo ea casca do NAC, o basolateral e-córtico-medial centro AMY, eo striatum dorsal. Em adição à técnica de c-fos, foram utilizadas medidas comportamentais de açúcar, a gordura e a ingestão de edulcorante artificial.

Um passo crítico incluiu amostragem pontual de ingestão de tal forma que eles seriam comparativamente iguais, garantindo assim que quaisquer diferenças na ativação do c-fos em sites deveram-se à solução que está sendo consumida antes a qualquer padrão ou magnitude da ingestão. Os quatro dias de ingestão de sacarina de linha de base assegurado que os animais com restrição de alimentos amostrados as soluções rapidamente e, desse modo, minimizado os efeitos não-específicos. Um segundo passo fundamental foi que o procedimento causou o mínimo de stress ou novidade para os animais como mudanças no independente valência emocional do tipo de admissão também poderiam produzir ativação c-fos. Portanto, os resultados fornecem uma "prova de conceito" convincentes para a eficácia desta abordagem e protocolos relacionados com aidentificar se a exposição aguda a gordura (por exemplo, óleo de milho), açúcar (glucose e frutose) e soluções de adoçante não nutritivo (sacarina) activam simultaneamente ROI de DA-mediada de um modo sugestivo de um sistema coordenado cérebro distribuído 24-27.

Como a ativação ideal c-Fos exige respostas sensíveis ao tempo antes do sacrifício 51,52, procedimentos previamente validados 42,44 maximizada amostragem solução com curta latência no teste de 1-hr. Assim, os ratos foram treinados alimento restringido com soluções 0,2% de sacarina (10 ml, 1 h) durante 4 dias, e dada a solução de ensaio no quinto dia. ingestão de sacarina de linha de base e significativamente aumentado progressivamente, e entradas de frutose e glicose, mas não de óleo de milho ou a sacarina no quinto dia foram significativamente maiores do que a ingestão de sacarina quarto dia. Assim, as soluções associadas com o aumento da FLI significativamente aumentada (glicose, frutose) ou não conseguiu afectar (óleo de milho) re ingestãolativo à formação sacarina anterior, e apareceu a ser mediada através de um mecanismo de incentivo comportamentais relacionadas com a recompensa. A consideração cuidadosa deve ser tomado para assegurar a amostragem e igualdade de comportamento. Outros pesquisadores possam efetivamente utilizar este procedimento para estudar outros tipos de novas soluções ou introduzir variações no paradigma para compreender os mecanismos relacionados com a adaptação e aprendizagem.

A vantagem do presente protocolo é a capacidade de comparar os efeitos de açúcares bem estudadas (frutose, glicose) e gorduras (óleo de milho) e comparar os seus c-fos efeitos ativando com que de controles importantes (o adoçante não nutritivo, sacarina, um emulsificante de controle, goma xantana, e água), e então examinar esses efeitos em seis locais do cérebro relacionadas. Embora esta abordagem tem vantagens óbvias em permitir análise simultânea em todos os locais cerebrais dos diferentes substâncias de sabor agradável, que tem o inconveniente de produzir um conjunto de dados potencialmente astronomiade células que exibem expressão neuronal. Para tornar isso mais manejável, tomamos a abordagem da análise de três cortes coronais representante por local comum a todos os animais em todas as condições de teste. Isto, obviamente, é acompanhada da advertência de escolher os níveis apropriados de cada ROI nestes três seções. Dada a ampla extensão rostro-caudal do AMY, NAC, mPFC, striatum dorsal e VTA, essa advertência não deve ser tomada de ânimo leve. Além disso, é, em seguida, Compete aos investigadores para ser consistente na selecção com precisão cada uma das três secções representativas em todos os animais em todos os locais. erros menor nesta escolha pode levar a "falsos positivos" e "falsos negativos". A eficiência da contagem também é uma variável importante. Nossa solução para este confundem potencial era para atribuir dois avaliadores desinformados para cada seção em cada ROI, e em seguida, garantir que a confiabilidade entre avaliadores (utilizando a correlação de contagens) excedeu sempre 0,8. Esta abordagem, embora duplicative, nos deu muito maior garantia sobre a precisão como a confiabilidade entre avaliadores ultrapassado facilmente este critério mínimo. Foram analisados ​​sub-regiões do NAC (núcleo vs. shell), AMY (baso-lateral vs.-córtico-medial central) e mPFC (perilímbica vs. infralimbic). Estas regiões podem ser divididas ainda mais, particularmente os núcleos individuais Amy, o patch e matriz compartimentos do estriado dorsal, eo shell NAC (vértice, arco, cone, zona intermediária). Como o shell NAC não conseguiu exibir consistentemente alterações na FLI seguintes óleo de milho, glicose ou frutose, não foi realizada ainda sub-análises desta estrutura. exame definitivo das zonas de patch e matriz do striatum dorsal exigido técnicas de imuno-histoquímica ainda que não foram utilizados no presente estudo, mas seria um importante estudo de acompanhamento. As análises dos núcleos AMY individuais dentro de cada sub-região seria também um futuro estudo adicional.

Estudos anteriores mostraram que sucaumentou o consumo aumentou FLI no núcleo AMY central, o VTA, bem como a casca, mas não core, do NAC, mas infusões sacarina orais ou IG são em grande parte ineficazes 55-57, 60-62. ingestão de glicose e frutose provocou efeitos específicos de açúcar mediante FLI com ambos eficazes na Central AMY-cortico-medial e estriado dorsal, o ex eficaz no núcleo e o NAc AMY basolateral, e este último eficaz na CPFm infralimbic. ingestão Sacarina falhou para extrair quaisquer alterações em qualquer local FLI em relação à água. Ingestão de gordura também aumentou FLI em locais accumbal e mPFC em estudos anteriores 65-67, e produziu a ativação significativa simultânea na VTA, infralimbic e prelimbic mPFC, striatum dorsal, o núcleo NAC, eo AMY basolateral e-centro-córtico medial.

Embora estudos anteriores demonstraram que a ingestão de açúcar e gordura induzida FLI em sistemas DA cérebro anterior meso-corticolímbicas e nigro-estriatais, o presente estudo sistematicamenteavaliadas ativação simultânea FLI na VTA, basolateral e AMY centro-córtico-medial, striatum dorsal, prelimbic e infralimbic núcleo mPFC, a NAC e casca após a ingestão aguda de óleo de milho, frutose, glicose ou sacarina. Aumentos significativos FLI eram altamente relacionadas entre si através dos locais do cérebro anterior, apoiando a ideia de activação rede cerebral distribuídos mediação de açúcar e ingestão de gordura. Tais protocolos que identificam mudanças simultâneas em vários loci cérebro podem ser utilizados em condições crônicas e binging, bem como sob condicionado e preferências. Esses estudos mostram que uma forte correlação anatômica (c-fos) pode ser efetivamente usado em vários locais do cérebro simultaneamente para identificar candidatos para mediar a ingestão e as preferências palatável em animais que podem fornecer insights sobre condições médicas humanos relacionadas com a obesidade, diabetes e outros distúrbios alimentares .

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Graças a Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson e Theologia Karagiorgis pelo seu trabalho árduo neste projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

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References

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Detecção simultânea de c-Fos Ativação de mesolímbico e mesocortical dopamina Sites Recompensa Após Naive açúcar e gordura ingestão em ratos
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Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

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