Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Sıçanlar Naif Şeker ve Yağ Yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal Dopamin Ödül Siteleri c-Fos Aktivasyon Eşzamanlı Algılama

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Bu çalışmanın amacı, sıçanlarda yağ ve şeker yeni alımından sonra dopamin yollar ve terminal sitelerinde eş zamanlı değişiklikleri ölçmek için hücresel c-fos aktivasyonu kullanılarak güvenilir bir immünohistolojik tekniği ortaya koymaya tarafından ödül ile ilgili dağıtılan beyin ağları tespit etmektir.

Abstract

Bu çalışma, sıçanlarda beyin dopamin (DA) yollar üzerinde yağ ve şeker yeni yenmesi etkilerini değerlendirmek üzere hücresel c-fos aktivasyonu kullanır. şeker ve yağ girişleri onların doğuştan konumlar yanı sıra öğrenilen tercihleri ​​aracılık eder. Beyin dopamin özellikle meso-limbik ve ventral tegmental alan (VTA) için mezokortikal çıkıntılar, bu bilgisiz ve öğrenilmiş yanıtların hem de implike edilmiştir. Birkaç site ve verici / peptid sistemleri etkileşim burada dağıtılan beyin ağları kavramı, lezzetli gıda alımını aracılık ettiği ileri sürülmüştür, ancak ampirik tür eylemleri gösteren sınırlı kanıt bulunmaktadır. Böylece, şeker alımı DA bırakma ve artar c-fos benzeri nukleus akkumbenlere (NAC), amigdala (AMY) da dahil olmak üzere bireysel VTA DA projeksiyon bölgelerinden immunreaktivitesi (FLI) ve prefrontal korteks (MPFC) yanı sıra sırt striatum medial ortaya çıkarır. Bu siteye seçici DA reseptör antagonistleri Ayrıca, merkezi yönetimşeker veya yağ tarafından ortaya klimalı lezzet tercihleri ​​edinimi ve ifadesini azaltmak farklı şekilde s. tarafından bir yaklaşım bu sitelerin değerlendirmek eşzamanlı olacaktır şeker veya yağ alımı yanıt olarak dağıtılmış beyin ağı olarak etkileşime belirlemek isteyip VTA ve onun büyük mesotelencephalic DA projeksiyon bölgeleri (prelimbic ve NAC infralimbic MPFC, çekirdek ve kabuk, bazolateral ve merkezi kortiko-medial AMY) ve dorsal striatum koordine görüntüleyecektir ve mısır yağı (% 3.5), glikoz (% 8), fruktoz (% 8) ve sakarin, oral, şartsız alınmasından sonra eş zamanlı FLI aktivasyonu (0.2 %) çözümleri. Bu yaklaşım kemirgenlerde palatable gıda alımından ödül ile ilgili öğrenme incelemek için ilgili beyin siteler arasında eşzamanlı olarak hücresel c-fos aktivasyonu kullanılarak uygulanabilirliğini belirlemede başarılı bir ilk adımdır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beyin dopamininin (DA) ile kabul edilebilir şekerlerin alımı için merkezi tepkilerine dahil edilmiştir önerilen hedonik 1,2, çaba ile ilgili 3 ve eylem 4,5 mekanizmaları alışkanlık alınmıştır. Bu etkilerin karışmış birincil DA yolu, ventral tegmental bölgeden (VTA) kaynaklanır, ve çekirdeğin akumbens (NAC) çekirdek ve kabuk, bazolateral ve orta-kortiko-medial amigdala (AMY) ve prelimbic ve infralimbic mediale projeler prefrontal korteks (MPFC) (değerlendirmeleri 6,7 bakınız). VTA sükroz alımı 8,9 sorumlu tutulmuştur ve DA sürümü NAC 10-15, AMY 16,17 ve MPFC 18-20 aşağıdaki şeker alımını görülmektedir. Yağ alımı da DA NAC 21 serbest uyarır ve dorsal striatum (kaudat-putamen) başka DA zengin projeksiyon bölgesi de DA-aracılı 22,23 besleme ile ilişkili olmuştur. Kelley 24-27 bu çoklu bir proje önerdiBu DA-aracılı sistemin iyon bölgeleri kapsamlı ve samimi bağlantıları 28-34 ile entegre ve interaktif dağıtılan beyin ağını kurdu.

Şekerler 35-37 ve yağlar 38-40 alımını azaltmak için DA D1 ve D2 reseptör antagonistlerinin yeteneğinin yanısıra, DA sinyali ayrıca şekerler ve klimalı bir lezzet tercihlerine üretmek için yağ (CFP) yeteneğini aracılık etmektedir edilmiş 41- 46. NAC, AMY veya MPFC 47-49 içine DA D1 reseptör antagonisti olan Microinjections mide içi glukoz tarafından ortaya OBP edinimi ortadan kaldırır. MPFC içine DA D1 ya da D2 ya reseptör antagonistleri microinjections fruktoz-CFP 50 edinilmesini ortadan kaldırır Oysa edinimi ve fruktoz-OBP ifadesi farklı şekilde NAC ve AMY 51,52 DA antagonistleri tarafından bloke edilir.

C-fos tekniği 53,54 nöral activatio araştırmak için kullanılan edilmiştirn kabul edilebilir alımı ve nöral aktivasyon tarafından uyarılan. şekliyle "c-fos aktivasyon" el yazması boyunca kullanılacak ve operasyonel nöronal depolarizasyon sırasında C-Fos artmış transkripsiyonu ile tanımlanır. Sükroz alımı NAC 55-57 arasında VTA yanı sıra kabuk değil, çekirdek, merkez AMY çekirdeğindeki fos benzeri immunreaktivitesi (FLI) arttı. Sahte beslenen sıçanlarda sükroz alımı ise anlamlı AMY ve NAC FLI arttı, ancak VTA 58, mide sakaroz veya glukoz infüzyonu anlamlı NAC ve AMY 59,60 merkez ve bazolateral çekirdeklerde FLI arttı. Planlanan chow erişim sakaroz tekrarlanan eklenmesi NAC kabuk ve çekirdek 61 yanı sıra MPFC içinde FLI arttı. Bir sakaroz konsantrasyon vites küçültme paradigma büyük Fli artar bazolateral AMY ve NAC meydana geldiğini ortaya ama VTA 62. Aşağıdaki klima, şeker ilişkili doğal Rewa söndürmerd davranışları bazolateral AMY ve NAC 63 FLI arttı. Dahası, bir sesi eşleştirme şeker kullanılabilirliği sonradan bazolateral AMY 64 FLI düzeyleri artan bir tonda sonuçlandı. Yüksek yağ alımı da NAC ve MPFC sitelerinde 65-67 yılında FLI arttı.

Daha önce belirtilen çalışmaların çoğu ödül ile ilgili dağıtılan beyin ağları 24-27 tanımlanması hakkında bilgi vermemektedir tek sitelerinde c-fos aktivasyonu şeker ve yağ etkilerini inceledik. Ayrıca, çalışmaların çoğu da göreceli (bazolateral ve orta-kortiko-medial) NAC (çekirdek ve kabuk), AMY ve MPFC alt alanlarının katkılarını tasvir etmedi (prelimbic ve infralimbic) potansiyel tarafından muayene edilebileceğini c-Fos haritalama 68 mükemmel mekansal, tek hücreli çözünürlükte avantajı. Laboratuvarımız 69 geçenlerde VTA DA yolunun ve yanlısı c-fos aktivasyonu ve eş zamanlı olarak ölçülen değişiklikler kullanılanjection bölgeleri (NAC, AMY ve MPFC) sıçanlarda yağ ve şekerlerin yeni alımından sonra. Bu çalışma aynı zamanda farklı şekilde NAC, AMY alt alanlarında FLI aktive edip akut altı farklı çözümler maruz kalma (mısır yağı, glikoz, fruktoz, sakarin, su ve yağ emülsiyonu denetimi) analiz etmek usul ve metodolojik adımları açıklar, MPFC yanı sıra sırt striatum. Farklılıkların Bu eşzamanlı tespiti için her site ve belirlenmesi FLI üzerinde önemli etkilerinin onay izin ister ve böylece dağıtılmış beyin ağı 24-27 için destek sağlayan, ilgili siteleri değişiklikler ile ilişkili belirli bir sitede değişiklikler. Test edilen bu işlemler VTA, prelimbic ve infralimbic MPFC, NAC çekirdek ve kabuk ve bazolateral ve merkezi kortiko-medial AMY) ve dorsal striatum olup koordine görüntüleyecektir oral, koşulsuz alınmasından sonra eş zamanlı FLI aktivasyon glikoz (% 8), fruktoz (% 8), mısır yağı (% 3.5) ve sakarin (% 0.2) çözümler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu deneysel protokoller tüm konular ve prosedürler Ulusal Bakımı Sağlık Rehberi Enstitüleri ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ile uyumlu olmasını onaylayan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Başlık

  1. Alma ve / veya cins erkek Sprague-Dawley sıçanları (260-300 g).
  2. bireysel tel örgü kafeslerde Ev fareleri. Fare yiyeceği ve su ad libitum ile 12:12 saat ışık / karanlık döngüsünde onları korumak.
  3. Uygun numune boyutlarını atayın (örneğin, n ≈ 6-8) rastgele gruplar halinde.

2. Test Aparatı ve Emme Prosedürler

  1. lastik tapalar ile kalibre santrifüj tüplerine kullanın ve 45 ° açı metal siper tüp sunulan çözümlerin (0.1 ml ±) doğru ölçüm sağlamak. kalibrasyon görünürlüğünü sağlamak için gergin metal yay tarafından ev kafeslerine sabitleyin.
  2. ~ (Gıda zahire sınırlasıçanların 15 / g / gün) çözümleri tüketmek motivasyonunu arttırmak için orijinal vücut ağırlığının% 85 ağırlığı azaltmak için. Not: ağırlık azaltma 3 arasında almalı - 5 gün.
  3. Sıçanlar kısa (en az 1 dakika) gecikme ile sonraki test çözümleri örnek olasılığını maksimize etmek için bir 1 saat oturumu üzerinden dört gün boyunca% 0.2 sakarin öncesi eğitim çözümleri (10 ml) sağlayın.
  4. bir kaç damla dökerek santrifüj tüpüne akışı onaylayın.
  5. Emme ölçümü elde etmek için önce ve her seanstan sonra tüpleri tartılır.
  6. a) su, b) yeni bir aromalı (% 0.05 kiraz aroması)% 0.2 sakarin, c)% 8 fruktoz, d); 8: bir giriş altı çözümlerden bir alıcı alt Beşinci günde testi (10 mi, 1 saat) gerçekleştirmek % glukoz, e)% 0.3 ksantan zamkı içinde süspansiyon% 3.5 mısır yağı, ve f)% 0.3 ksantan sakızı.
  7. besin çözeltileri İzokalorik olduğundan emin olun; böylece,% 3.5 mısır yağı konsantrasyonu% 8 şeker çözümleri izokalorik olduğunu.
  8. th sağlamakkısa gecikme (en az 1 dakika) sıçanlar örnek çözümler. Bu gereklilik yerine değilse, o zaman çalışma konusunu atın.

3. Doku Hazırlanması

  1. Her bir test çözeltisi için ilk maruz kaldıktan sonra pentobarbital 90 dakika bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla her bir hayvanın anestezisi. hayvanlar düzgün hayvan artık derin kulak kepçesi stimülasyon sallayarak direkt kornea basınç veya kafa aşağıdaki yanıp sönen ayak tutam çekilmesi gibi refleksler, duyarlı olduğunu göstererek anestezi onaylayın.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi 69 transkardiyal her hayvan serpmek.
    1. Sodyum pentobarbital (65 mg / kg) aşırı dozda sıçan anestezisi, göğüs kafesi kaldırmak ve kalp 69 ücretsiz erişim için göğüs maruz kalmaktadır.
    2. Sol kalp kapakçığı apeks iğne yerleştirin ve vena kava kesti. bir fosfat tamponlu sabitleyici CO, ardından fosfat tamponu çözeltisi (PBS, ~ 180 mi) yönetme% 4 paraformaldehid (~ 180 mi) ntaining.
    3. hayvan aslında sıvı gibi burun, ağız ve genital bölgelerde gibi diğer boşlukları bırakarak olup olmadığını inceleyerek doğru perfüze ediliyor emin olun. Not: paraformaldehid ile uygun sabitleme büyük kas hareketleri ile eşlik edecek. Bu oluşmazsa bu reaksiyon oluşuncaya kadar, iğne yeniden ayarlayın.
  3. çabucak kafatası kürk ve deriyi keserek kafatası beyin kaldırmak. çatlak ve arkadan öne doğru hareket beyinden kemiği kaldırmak için rongeurs kullanın. rongeur kemik ve meningeal Pia mater arasında olmasını sağlamak altında ve beyincik arkasındaki alanda başlangıçta çalışma. Kafatasının üst ve yanları kaldırıldıktan sonra, tabandan beyin kaldırmak için küçük bir spatula kullanın ve küçük makas ile kranial sinirler snip. kemik kaldırılmaya çalışılırken beyin zarar vermemek için dikkatli olun.
  4. gece boyunca 4 ° C 'de% 4 paraformaldehit solüsyonunda beyinleri düzeltildi.bunlar, kabın dibinde biriken kadar oda sıcaklığında% 30 sakroz /% 70 PBS çözeltisi içinde beyinleri yerleştirin.
  5. beyin engelle
    1. koku ampul enlemesine kaudal kesme beynin rostral kısmını çıkarın.
    2. beyincik ve pons düzeyinde enine kesme beynin kaudal kısmını çıkarın.
  6. MPFC aracılığıyla kayar mikrotom aşamasında sabit kaudal kısmı ile koronal beyin monte edin ve kesme koronal kesitler (40 mikron) (2,86 - bregma 2,20 mm rostral), NAC çekirdek ve kabuk ve dorsal striatum (+ 1,76-1,60 mm bregma rostralinde), AMY (-2,12 - bregma -2,92 mm kaudal) ve VTA (-5,20 - -5,60 mm kaudal bregma). Rehberlik için bir sıçan beyin atlası 70 kullanın.
  7. Nihai immünohistokimyasal analiz 71 PBS ile dolu bir 24-çukurlu plaka bireysel çukurlar halinde serbest yüzen bölümleri toplayın. 24 biz mühür Parafilm kullanınll plaka PBS kapta buharlaşması ve beyin kadar kuru değil emin olmak için. 4 ° C beyin dokusu saklayın.

4. c-fos Prosedürleri (71 uyarlanmıştır)

  1. % 5 normal keçi serumu içinde 5 ml% 0.2 Triton X-100, PBS içinde 1 saat süre ile, her bölüm tedavi edin.
  2. PBS 1 ml içeren tüpler içinde 36 saat boyunca 4 ° C 'de: primer antikorlar ile muamele edilmiş bölüm (5000 tavşan anti-c-fos, 1) inkübe edin.
  3. Durulama bölümler 10 dakika her biri için, PBS (5 mi) ile 3 kez.
  4. sekonder antikor ile inkübe (biyotinile keçi anti-tavşan, 1: 200), oda sıcaklığında 2 saat süre ile PBS 1 ml içeren Wells.
  5. 10 dakika her biri için PBS içinde, her bölüm, 3x (5 mi) yıkayın.
  6. 5 ml PBS içinde Avadin DH (100 ul) ve biyotinile yaban turpu peroksidaz H (100 ul) oluşan bir kit gelir ticari olarak temin edilebilen Avidin-yaban turpu peroksidaz karışımı içinde 2 saat süreyle çalkalandı bölümleri inkübe edin.
  7. Yeniden durulama bölümleri PB 3xS 10 dakika her biri için (5 mi).
  8. DAB çözeltisi 5 ml ihtiva eden oyuklara doku reaktivitesine bağlı olarak, 10 dakika - 5 için% 0.0015 H2O 2 varlığında,% 0.05 diaminobenzidin (DAB) ile bölümleri React.
  9. Çift etiket VTA bölümleri. gece boyunca 4 ° C'de PBS içinde (5 mi) bir tirosin hidroksilaz (TH) antikoru (2.000 tavşan anti-fare TH, 1) ile inkübe edin.
  10. Durulama bölümler 10 dakika her biri için, PBS (5 mi) içinde 3 kat.
  11. sekonder antikor ile inkübe (biyotinile keçi anti-tavşan, 1: 200), PBS (5 mi) içinde, oda sıcaklığında 2 saat karıştırıldı.
  12. Durulama bölümler 10 dakika her biri için, PBS (5 mi) içinde 3 kat.
  13. ikinci bir antikor peroksidaz kompleksi ile antikor görselleştirme. DAB / NiCl çözeltisi 5 ml ihtiva eden oyuklara doku reaksiyona bağlı olarak, 10 dakika - 5 için,% 0.05 DAB bir kombinasyonu ve% 0.3 nikel sülfat çözeltisi ile tepkimeye sokulur.
  14. DAB çözümü ondan renk sütlü açık yeşil olduğundan emin olun% 0.3 nikel sülfat ile tepkisi. çözüm çok yeşil ise, reaksiyon çok karanlık olacaktır.
  15. jelatin kaplı slaytlar üzerine tüm bölümleri monte edin. Bir Toluen Tabanlı Çözüm (TBS) bir kaç damla-kayma kapak sonra onları kuru gecede edelim ve.
  16. Deneysel durum gözlemcilere bilinmemektedir, böylece kod slaytlar.

c-fos 5. Belirlenmesi İmmünoeaktif Sayıları

  1. prelimbic MPFC, infralimbic MPFC, NAC çekirdek, NAC kabuk, bazolateral AMY çekirdekleri, merkezi-kortiko-medial AMY, dorsal striatum ve VTA: ilgi bu bölgelerde (YG) Fos-pozitif nöronlar saymak için tarafsız gözlemcilerin çiftleri atayın. . C-Fos immunreaktivitesi TH + ve VTA TH- hücrelerde bulunan olup olmadığını Delineate 1 mikroskop NAC bir ekran çekilen resim sağlar Şekil.

Şekil 1
Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. test koşullarında tüm tüm hayvanlar için ortak site başına en az üç Örnek dilim analiz edin.
  2. Anahat (Şekil 1) takip ederek her ROI için tüm bölgeyi analiz yazılımı ve bir optik mikroskop kullanın.
    1. Belirli bir site için, uygulamayı açın ve satın alma açılır menüsünü tıklayın ve "Canlı Image" tıklayın. odak haline ROI getirin ve bir referans noktası oluşturmak için ekrana tıklayın. Sonra trBir kılavuz olarak ızgara kullanarak seçilen beyin bölgesini ace. iz tamamlandığında, hücreler (- 5.3.1.3 5.3.1.1 adımlar) sayılır.
      1. yazılım simgesine çift tıklayın. "Acquisition" ve ardından "Canlı Image" tıklayın, menü çubuğuna gidin. odak haline ROI getirin ve bir referans noktası oluşturmak için ekrana tıklayın.
      2. ızgara araç çubuğuna gidin ve "Ekran Izgara" ve "Use ızgara etiketleri" butonuna tıklayınız. önceden belirlenmiş bir iz ROI anahat.
      3. c-fos hücrelerin sayısını tutmak için sol kenar çubuğunda bir "+" seçeneğini, her ROI alanındaki tüm hücreleri saymak. sayar kaydetmek için tek başına her bir hücreyi tıklayın. Tanımlanmış bir koyu kırmızı daire (Şekil 1) gözlendiğinde c-fos pozitif bir hücreyi ele alalım.
    2. her site için bu işlemi tekrarlayın.
    3. Tutanak bir laboratuar notebook ve gelecek analizi için bilgisayar üzerinde sayar. izleme ve sayıları kaydetmek için, "Kaydet Veri Dosyası" "Dosya" tıklayın menü çubuğuna gidin.
    4. Her ROI her bölüm için iki bilgisiz gözlemcinin (sayıları korelasyonu kullanarak) bu hakemlerarası güvenilirliğini sağlamak her zaman 0,8 aşıyor.

    6. İstatistik

    1. Gün 1, 2, 3 ve 4 69 sakarin alımı karşılaştıran bir tekrarlanan-ölçer varyans (ANOVA) 1-yönlü analizi kullanılarak ilk dört gün boyunca bazal sakarin alımı değerlendirin.
    2. Bir randomize blok 2-yönlü ANOVA 69 kullanılarak altı gruba test alımı (Gün 5) ile sakarin alımının (Gün 4) karşılaştırın.
    3. Bireysel önemli etkileri 69 belirlemek için Tukey karşılaştırmalar (p <0.05) kullanın.
    4. hakemlerarası güvenirliğini belirlemek ve daha sonra ortak bir gözlemcinin sayıları kullanın.
    5. Her site 69 üç temsilci dilim için ortalama c-fos sayar.
      1. Altı çözeltiler (% 3.5 mısır yağı,% 8 glükoz,% 8 fruktoz,% 0.2 aromalı sakarin, Xa alımı ile uyarılan c-fos aktivasyon 1-yönlü ANOVA gerçekleştirmeperilimbic MPFC 69 nthan sakız kontrolü ve su).
      2. infralimbic MPFC, NAC çekirdek, NAC kabuk, bazolateral AMY, merkezi-kortiko-medial AMY, VTA ve dorsal striatum altı gruba tekrarlayın paralel analizleri. Bireysel önemli etkileri 69 ortaya çıkarmak için Tukey karşılaştırmalar (p <0.05) kullanın.
    6. onun süspansiyon ajanı su alımı ve alımı, ksantan zamkı hem mısır yağı alımını karşılaştırın. su alımı ve besleyici olmayan tatlandırıcı, sakarin alımı hem de fruktoz ve glukoz alımı karşılaştırın.
    7. sitelerin her çözüm girişleri ve c-fos aktivasyonu arasında anlamlı ilişkiler Bonferroni r korelasyon (p <0.05) kullanılarak gözlendi olmadığını tespit.
      1. Sistematik olarak% 3.5 mısır yağı grubundaki her hayvan için perilimbic ve infralimbic ön frontal kortekste c-fos sayımları karşılaştırın.
      2. Altı sitelerin her çiftinin sistematik paralel analizler tekrarlayın (VTA, dorsal striatum, infralimbic MPFC, perilimbic MPFC% 3.5 mısır yağı için, NAC çekirdek, NAC kabuk, bazolateral AMY, merkezi-kortiko-medial AMY).
      3. Diğer beş deneysel emme koşulları (% 8 glükoz,% 8 fruktoz,% 0.2 aromalı sakarin, ksantan sakızı kontrolü ve su) için bu altı siteye sistematik Benzer analizler, tekrarlayın.
    8. Bir çözüm koşulu içinde aynı hayvanlar çözümleri arasında ve Bonferroni kullanarak her çözümün içinde c-fos aktivasyonu arasında anlamlı ilişkiler belirlenerek tüm sitelerde değerlendirildi gerçeği yararlanın korelasyonu (p <0.05) r.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıda açıklanan tüm temsilcisi sonuçları önceden 69 yayımlanmıştır ve tekniğin etkinliğini gösteren içinde "kavramının kanıtı" desteklemek için burada yeniden sunulmuştur.

çözüm Alım
bazal sakarin alımının önemli farklılıklar bütün hayvanlarda (F (3,108) = 57.27, p <0.001) girişleri ile (Gün 1 için ilk dört gün boyunca gözlendi: 1.3 (± 0.2) ml; 2. Gün: 3.9 (0.4 ±) ml ; 3. Gün: 5.9 ml (0.6 ±); 4. Gün: 7.1 (0.6 ±) ml) anlamlı (p <0.05, Tukey HSD testi) ve giderek artan. önemli ölçüde 5. Gün üzerinde fruktoz ve glikoz alımı değil, mısır yağı veya sakarin alımının (p <0.05, Tukey HSD testi) Gün 4 sakarin alımının göreli artış (p <0.05, Tukey HSD testi) fruktoz (9.6 (0.4 ±) ml ) ve Sacc anlamlı olarak daha yüksek glikoz (9.4 (0.6 ±) ml)Harin alımı. Dahası, mısır yağı alımı (7.4 (± 0.6) ml) anlamlı (p <0.05, Tukey HSD testi) ksantan zamkı alımı daha yüksek.

Bu sonuçlar çözüm alımı başına sitelerin hiçbirinde gözlenen c-fos aktivasyonu için hesap olasılığını gündeme getirdi. Bu incelemek için Bonferroni r korelasyon olduğu beş çözümlerin alımı altı sitelerin her birinde c-fos aktivasyonu ile ilişkili olduğu gerçekleştirildi. Anlamlı korelasyon iç çözelti alımı ve c-fos aktivasyonu arasındaki görülmektedir konusunda başarısız oldu (R (29) = 0.186), kabuk (R (29) = 0.029) ya da toptan (R (29) = 0.10) NAC, prelimbic ( R (29) = 0.23), infralimbic (R (29) = 0.30) ya da toptan (R (29) = 0.14) MPFC, VTA (R (29) = 0.10), arka striatum (R (29) = 0.14 ) ya da taban üzerinde (R (29) = 0.47), Centro-kortiko-medial (R (29) = 0.48) ya da toptan (R (29) = 0.409) AMY. alımı ve AMY c-fos aktivasyonu, daha korelasyon arasında yüksek korelasyon göz önüne alındığındaleri, her bir çözelti uygulandı. Önemli (p <0.05, Tukey HSD testi) ilişkileri fruktoz alımı ve AMY FLI arasında uyulması başarısız (bazolateral (r = 0.15), centro-kortiko-medial (r = 0.13), toplam (r = 0.13)), glikoz (bazolateral (r = 0.17), centro-kortiko-medial (r = 0.17), toplam r = 0.13)), sakarin (bazolateral (r = 0.42), centro-kortiko-medial (r = 0.42), toplam (r = 0.42)) ya da mısır yağı (bazolateral (r = 0.54), Centro-kortiko-medial (r = 0.59), toplam (r = 0.64)). Anlamlı (p <0.05, Tukey HSD testi) negatif korelasyon ksantan sakızı alımı ve total AMY FLI (r = 0.94) arasında gözlendi.

MPFC c-fos etkinleştirme
Önemli ölçüde Mısır yağı (p <0.05, Tukey HSD testi) artan toplam (Şekil 2A), infralimbic (Şekil 2B) ve prelimbic (Şekil 2C) MPFC c-fos, su (*) ya da ksantan sakızı kontrole göre sayar(#). Önemli ölçüde fruktoz (p <0.05, Tukey HSD testi) tamamen veya prelimbic MPFC sayıları, su (*) ya da sakarin (+) (Şekil 2B) infralimbic MPFC göreceli olarak c-fos sayıları artan, ancak. Bunun aksine, glükoz ya da sakkarin., Toplam perilimbic ya infralimbic MPFC c-fos sayılarını değiştirir suya artan mısır yağı kaynaklı FLI göreli gösteren hayvanların 3 görüntüler Örnek MPFC bölümleri Şekil başarısız oldu.

şekil 2
Şekil 2. Yağ veya şeker Emme Farklı Olarak mediyal prefrontal korteks (MPFC) c-fos Etkinleştirme'yi artırır. C-fos aktivasyonu değişiklikler (± SEM ortalama) tüm MPFC (Panel A), infralimbic MPFC bölgesinde belirtilmiştir (Panel B) ve prelimbic MPFC alanı (Panel C), aşağıdaki tüketim (1 saat), su içinde, sakarin (0.2%), Ksantan sakızı (mısır yağı kontrol), glikoz (% 8), fruktoz (% 8) ya da mısır yağı (% 3.5). (Daha önce 69 yayınlanmıştır.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. yağ ve şeker aşağıdaki istenen MPFC c-fos aktivasyonu. C-fos aktivasyonu anlamlı olarak daha yüksek mısır yağı (Panel A (4-kat büyütme) ve C (10-kat büyütmeli)) alımı maruz kalan hayvanlarda gözlenmiştir su (Panel B (4-kat büyütme) ve D (10 kat büyütme)) alımı daha. t bir parçası olarak Prelimbic (PL) ve infralimbic (IL) MPFC arasında tarif alt alanlarında Temsil Panel A (mısır yağı) ve C (su) diagramed edilirkarşılık gelen paneller, 10 misli büyütmede (B ve D) ile büyütülmüş hortum paneller (A ve C). Panel C ve D Oklar Örnek c-fos pozitif hücreler göstermektedir. Tüm ölçek çubukları 100 mikron bulunmaktadır. (Daha önce 69 yayınlanmıştır.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

AMY c-fos etkinleştirme
Önemli ölçüde Mısır yağı (p <0.05, Tukey HSD testi) toplam AMY (Şekil 4A), bazolateral (Şekil 4B) ve merkezi-kortiko-medial arttı (Şekil 4C) alt alan AMY c-Fos suya göre sayar (*) ya da ksantan sakızı kontrolü (#). Glikoz da anlamlı bulundu (p <0.05, Tukey HSD testi) artarak toplam (Şekil 4A), bazolateral (Şekil 4B) ve merkezi-kortiko-medial ( (Şekil 4A) ve merkezi-kortiko-medial alt alan Amy içinde (Şekil 4C) c-Fos su (*) veya sakarin (+) göre sayar, ama değil bazolateral AMY alt bölgede. Sakarin, toplam bazolateral veya merkezi-kortiko-medial AMY c-Fos suya göre sayar değiştirmek için başarısız oldu. AMY tek tek çekirdekler detaylı analizler AMY bazolateral alanındaki belirtildiği önemli değişiklikler bireysel bazolateral ve yan AMY çekirdeklerde not olduğunu göstermiştir. AMY merkez-kortiko-medial alanda belirtilen önemli değişiklikler aynı zamanda bireysel merkezi, kortikal ve medial AMY çekirdeklerine kaydedildi. 5 görüntüler temsilcisi AMY bölümleri Şekilartan mısır yağ, Glikoz ve fruktoz su kaynaklı Fli göreli gösteren hayvanların. (Daha önce 69 yayınladı.)

Şekil 4,
Şekil 4. Yağ veya şeker Emme Farklı Olarak amigdala (AMY) c-fos Etkinleştirme'yi artırır. C-fos aktivasyonu değişiklikler (± SEM ortalama) tüm AMY (A Paneli) belirtilmiştir, bazolateral AMY alanı (B Paneli) ve su, sakarin, ksantan zamkı, glikoz, früktoz ya da mısır yağı tüketimi (1 saat) takiben orta-kortiko-medial AMY alanı (Panel C). AMY bazolateral alanındaki belirtildiği önemli değişiklikler bireysel bazolateral ve yan AMY çekirdeklerde not edildi. AMY merkez-kortiko-medyal bölgesinde belirtilen önemli bir değişiklik tek tek kortikal, merkezi ve medial AMY çekirdeklerde not edildi. (Daha önce 69 yayınlandı.) Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Yağlar ve Şekerler ardından Şekil 5. Gerçek AMY c-fos Aktivasyon. C-fos aktivasyon mısır yağı (Panel A (4 kat büyütme), D (10 kat büyütme) ve G alımı maruz kalan hayvanlarda gözlendi (60- kat büyütmede)), glikoz (Panel B göre anlamlı düzeyde daha yüksekti (4-kat büyütme) ve E (10 kat büyütme)) ve früktoz (Panel C (4-kat büyütme) ve F (10 kat)) su (Panel H (4-kat büyütme) ve I (10 kat büyütme)) alımının. TemsiliCentral-kortiko-medial (CMC) ve bazolateral (bla) AMY arasında tarif alt alanları Panel A (mısır yağı), B (glikoz) diagramed edilir, C (fruktoz), H (su) bir parçası olarak karşılık gelen paneller (D, E, F ve I) ila 10 kat büyütme büyütülmüş olan paneller (A, B, C ve H) arasında. Panel D'de tarif alt alanı (mısır yağı, 10 kat büyütme) paneller, D, E, F, G Panel D Oklar 60 kat büyütme büyütülür ve Örnek c-fos pozitif hücreler göstermektedir. Tüm ölçek çubukları Panel G (50 mikron) hariç, 100 mikron bulunmaktadır. (Daha önce 69 yayınlanmıştır.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

NAC c-fos etkinleştirme
Mısır yağı anlamlı (p <0.05, Tukey HSD testi) artarak toplam (Şekil 6A) ve çekirdek ( (Şekil 6C). Önemli ölçüde glikoz (p <0.05, Tukey HSD testi), ancak toplam NAC veya sakarin (+) veya su (*) ile NAC kabuk göreli, NAC çekirdek (Şekil 6B) c-Fos sayıları arttı. Bunun aksine, fruktoz ve sakarin NAC çekirdek ve / veya kabuk içinde, c-fos aktivasyonunu ortaya çıkarmak sudan farklı başarısız oldu. Artış, mısır yağ veya su glikoz ile uyarılan FLI göreli gösteren hayvanların NAC çekirdek 7 görüntüler Örnek bölümleri Şekil .

Şekil 6,
Şekil 6. Yağ veya şeker Emme Farklı Olarak NAC c-fos Etkinleştirme'yi artırır. C-fos aktivasyonuna değişiklikler tüm NAC (Panel A), NAC çekirdek (Panel B), ve NAC kabuk ((± SEM demek)Su, sakarin, ksantan zamkı, glikoz, früktoz ya da mısır yağı tüketimi (1 saat), aşağıdaki panel C). (Daha önce 69 yayınlanmıştır.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7. Güncel NAC Çekirdek, ancak NAC Kabuk yağ ve şeker sonra c-fos Etkinleştirme. C-fos aktivasyon mısır yağı (Panel A (4-kat büyütme), D (10-kat büyütmeli bir alımı maruz kalan hayvanlarda gözlenmiştir ) ve G (60 kat büyütme)) ve glikoz (Panel B (4-kat büyütme) ve su alımı daha anlamlı düzeyde daha yüksekti E (10 kat büyütme)) (Panel C (4-kat büyütme) ve F (10-kat magnification)). NAC çekirdek ve NAC kabuk tarif alt alanların Temsil Panel A (mısır yağı) diagramed, B (glikoz) ve C (su) bu paneller (A, B, C ve H) bir parçası olarak büyütülmüş ila 10-kat karşılık gelen panel büyütme (D, E ve F). Panel D'de tarif alt alanı (mısır yağı, 10 kat büyütme) paneller D, E Panel G. oklar 60 kat büyütme büyütülür, F ve G Örnek c-fos pozitif hücreler göstermektedir. Tüm ölçek çubukları 100 mikron bulunmaktadır. (Daha önce 69 yayınlanmıştır.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Dorsal striatal c-fos etkinleştirme
Önemli ölçüde Mısır yağı (p <0.05, Tukey HSD testi), su (*) ya da ksantan sakızı (#) (Figür dorsal striatum nispetle c-fos sayıları artane 8A). Glikoz veya önemli ölçüde früktoz (p <0.05, Tukey HSD testi) sakarin (+) (Şekil 8A) dorsal striatal FLI göre artmaktadır. Buna karşılık, sakarin dorsal striatal c-Fos aktivasyonunu eliciting sudan farklı başarısız oldu. Artan mısır yağ, su glükoz- veya fruktoz kaynaklı Fli göreli gösteren hayvanların 9 görüntüler temsilcisi dorsal striatal bölümleri Şekil.

Şekil 8,
Şekil 8. Yağ veya şeker Emme Farklı Olarak Dorsal Striatum ve Ventral Tegmental Alanında c-fos Etkinleştirme'yi artırır. Dorsal atriatal (Panel A) ve değişiklikler c-fos aktivasyonu için not edildi ventral tegmental alan (Panel B) (ortalama ± SEM) Aşağıdaki su, sakarin, ksantan zamkı, glikoz, früktoz ya da mısır yağı tüketimi (1 saat). (Daha önce 69 yayınladı.)

Şekil 9,
Şekil 9. yağ ve şeker aşağıdakı Güncel dorsal striatal c-fos aktivasyonu. C-fos aktivasyon mısır yağı (Panel A (4-kat büyütmeli), D (10 kat büyütme) ve G alımı maruz kalan hayvanlarda gözlenmiştir (60 kat büyütme)), glikoz (Panel B (4-kat büyütme) ve E (10 kat büyütme)), fruktoz (Panel C (4-kat büyütme) ve F (10 kat büyütme)) su alımı daha anlamlı düzeyde daha yüksekti (Panel lH (4-kat büyütme) ve (10-kat büyütmeli)). Tarif alt aPanel A (mısır yağı) dorsal striatum Rea, B (glikoz), C (fruktoz), H (su) karşılık gelen paneller (D, E, F ve I) ila 10 kat büyütme büyütülmüş olduğu belirtilmiştir. Panel D'de tarif alt alanı (mısır yağı, 10 kat büyütme) paneller D, E Panel G. oklar 60 kat büyütme büyütülür, F ve G Örnek c-fos pozitif hücreler göstermektedir. Tüm ölçek çubukları Panel G (50 mikron) hariç, 100 mikron bulunmaktadır. (Daha önce 69 yayınlanmıştır.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

VTA c-fos etkinleştirme
Mısır anlamlı bir yağ (p <0.05, Tukey HSD testi), ksantan sakızı kontrol (#) (Şekil 8B) göre TH + VTA hücrelerinde c-fos sayılarını artmıştır. Bunun aksine, glükoz, früktoz ya da sakarin VTA göreceli olarak c-fos sayılarını etkilemedi su. 10 görüntüler temsili TH + ve Th- ve suya artan mısır yağı kaynaklı Fli göreli gösteren hayvanların c-Fos-aktive VTA hücreleri Şekil.

Şekil 10,
Yağ ve şeker aşağıdakı Şekil 10. Güncel ventral tegmental alan c-fos aktivasyonu. VTA c-fos aktivasyon mısır yağı (Panel A (4 kat) ve C (10-kat)) ve su (Panel B maruz kalan hayvanlarda gözlenmiştir (4 kat) ve D (10-kat)). gri oklar sadece hücreleri temsilci c-fos işaret ederken siyah oklar, temsilci çift etiketli TH / c-fos pozitif hücrelerini gösterir. Tüm ölçek çubukları 100 mikron bulunmaktadır. (Daha önce 69 yayınlanmıştır.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> Siteleri ve Çözümler İçerisinde c-Fos Aktivasyonu İlişkileri
Prelimbic MPFC arasındaki mısır yağına maruz kalan hayvanlarda c-Fos sayar desen NAC çekirdek ve NAC kabuk ya arasında anlamlı (p <0.05) pozitif korelasyon saptandı (r = 0.971) veya tüm MPFC (r = 0.670), bazolateral ve merkezi kortiko-medial AMY arasındaki infralimbic MPFC ve dorsal striatum arasında her iki infralimbic MPFC (r = 0.940) veya dorsal striatum (r = 0.849), (R = 0.749), (R = 0.999) ve bu ikisi arasında dorsal striatum ve VTA (r = 0.723). Bunun aksine, mısır yağı maruz kalan hayvanlarda, c-fos sayımları paterni bazolateral AMY ve NAC çekirdek ya arasında önemli (P <0.05) negatif korelasyon (r = -0,712) veya kabuk (r = -0,708) ve merkezi-kortiko-medial AMY ve NAC çekirdek ya arasındaki (r = -0,712) veya kabuk (r = -0,710) c-Fos hayranlarıyla desen hayvanlar e sayardorsal striatum ve ya VTA arasında, prelimbic ve infralimbic MPFC (r = 0.930) arasında ortaya anlamlı (p <0.05) pozitif korelasyon glikoz xposed (r = 0.821), bazolateral (r = 0.910) ya da merkez kortiko-medial (r = 0,911) AMY ve bazolateral ve merkez kortiko-medial arasında (r = 0.999) AMY. NAC kabuk arasındaki fruktoz maruz kalan hayvanlarda c-Fos sayar desen NAC çekirdek ve NAC kabuk ya arasında anlamlı (p <0.05) pozitif korelasyon saptandı (r = 0.969) ya da prelimbic MPFC (r = 0.740), prelimbic MPFC (r = 0,733), prelimbic ve infralimbic MPFC arasında (r = 0,959) ve bazolateral ve merkez kortiko-medial AMY arasında (r = 0.996) maruz hayvanlarda c-Fos sayar hayranlarıyla desen ortaya sakarin için NAC kabuk ve dorsal striatum arasında anlamlı (p <0.05) NAC çekirdek ve NAC kabuk arasındaki pozitif korelasyon (r = 0.792), (r = 0.715), ve prelimbic MPFC a arasındakind infralimbic MPFC (r = 0.999).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Çalışmanın amacı, kaynağı (VTA) ve ön beyin projeksiyon hedefleri DA ödül ile ilgili nöronların (NAC, AMY, MPFC) aynı anda sıçanlarda yağ ve şeker yeni alımından sonra aktive eğer hücresel c-fos tekniği kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır . Bu çalışmada, daha önce 69 yayınlanan bir çalışmanın protokollerin ayrıntılı bir açıklamasıdır. Bu VTA, prelimbic ve infralimbic MPFC, NAC çekirdek ve kabuk ve bazolateral ve merkez kortiko-medial AMY yanı sıra dorsal striatum onun büyük projeksiyon bölgeleri dağıtılmış beyin ağı 24 olarak hareket edeceğini varsayılmıştır -27 ve görüntülemek koordine ve eş zamanlı FLI glikoz (% 8), fruktoz (% 8) ya da mısır yağı (% 3.5) sakarin (% 0.2), su ve diğer kontrol çözümleri çözeltiler nisbetle yeni alımını et. Mısır yağı, glikoz ve fruktoz, ama VTA, prelimbic ve infralimbic MP alımı üretilen önemli ve ayırıcı Fli aktivasyonunu sakarin değilFC, çekirdek ve NAC, bazolateral ve orta-kortiko-medial AMY kabuk ve dorsal striatum. c-fos tekniğine ilave olarak, şeker, yağ ve yapay tatlandırıcı alımının davranış ölçümleri kullanılmıştır.

Bir kritik adım ve böylece sitelerinde, c-fos aktivasyonunda herhangi bir fark çözüm yerine alımının desen veya büyüklüğü her iki tüketilen nedeniyle olduğu sağlanması, bu nispeten eşit olacaktır şekilde alımı zamanında örnekleme dahildir. Bazal sakarin alımının dört gün yiyecek kısıtlaması hayvanlar hızla çözümler örneklenmiş ve böylece spesifik olmayan etkileri en aza sağlamıştır. İkinci kritik bir adım alımı Çeşidi duygusal değerlik bağımsız değişiklikler de c-fos aktivasyonu üretmek olabilir prosedür hayvanlara en az stres ya da yenilik neden oldu. Bu nedenle, bulgular ile ilgili bu yaklaşım ve protokoller etkinliği için inandırıcı bir "kavram kanıtı" sağlamakAkut yağ maruz (örneğin, mısır yağı), şeker (glikoz ve fruktoz) ve non-besleyici tatlandırıcı (sakarin) çözümleri aynı anda koordine dağıtılan beyin sisteminin 24-27 düşündüren bir biçimde DA-aracılı ROI aktive olup olmadığını belirlemek.

Optimal c-Fos aktivasyon zamana duyarlı tepkiler gerektirdiğinden önce 1 saatlik testinde kısa gecikme ile daha önce onaylanmış prosedürler, 42,44 maksimize çözüm örnekleme 51,52 kurban. Bu nedenle, gıda yoktur fareler 4 gün boyunca% 0.2 sakarin çözümleri ile (10 mi, 1 saat) eğitimli ve beşinci gününde test solüsyonu verildi. Baseline sakarin alımı anlamlı ve giderek artmış ve beşinci gününde fruktoz ve glikoz değil, mısır yağı veya sakarin alımı dördüncü gün sakarin alımının anlamlı olarak yüksek bulundu. Bu nedenle, yüksek FLI önemli ölçüde artmıştır (glükoz, fruktoz) ile ilişkili ya da (mısır yağı) emme yeniden etkilemede başarısız oldu çözümlerÖnceki sakkarin eğitim yasama, ve bir ödül-ilgili davranışsal teşvik mekanizması yoluyla aracılık ettiği ortaya çıkmıştır. Dikkatli bir göz örnekleme ve davranış eşitliğini sağlamak için alınması gereken. Diğer araştırmacılar etkin bir uyum ve öğrenme ile ilgili mekanizmaları anlamak için paradigma değişimleri yeni çözümler diğer türleri incelemek veya tanıtmak için bu yordamı kullanabilirsiniz.

Mevcut protokolün avantajı, iyi çalışılmış şeker (fruktoz, glikoz) ve yağ etkilerinin karşılaştırılması (mısır yağı) ve (önemli kontrollerin daha olmayan besleyici tatlandırıcı, sakarin efektleri aktive onların c-fos karşılaştırmak yeteneği bir kontrol emülgatör, sonra ksantan sakızı ve su) ve altı ilişkili beyin siteler arasında bu etkilerini incelemek. Bu yaklaşım, farklı lezzetli maddelerin beyin siteler arasında eşzamanlı inceleme izin belirgin yararları olmasına rağmen, potansiyel astronomik veri kümesi üretme dezavantajı vardırnöronal ifade gösteren hücre. Bu daha yönetilebilir hale getirmek için, test koşulları bütün olarak hayvanlara ortak site başına üç temsilci koronal dilim analiz yaklaşımını aldı. Bu tabii ki bu üç bölümlerde her ROI uygun seviyede seçme ihtar eşlik ediyor. AMY, NAC, MPFC, dorsal striatum ve VTA geniş postero-kaudal ölçüde göz önüne alındığında, bu uyarı hafife alınmamalıdır. Dahası, daha sonra araştırmacılar görevidir doğru tüm siteler arasında tüm hayvanlar arasında üç temsilci bölümlerin her biri seçilerek tutarlı olmaktır. Bu seçim ufak hatalar "yanlış pozitif" ve "yanlış negatif" yol açabilir. sayımının verimliliği aynı zamanda, ilgili bir değişkendir. bu potansiyel şaşırtmak için çözüm, her ROI her bölüm için iki bilgisiz raters atayın ve sonra (sayımlarının korelasyonu kullanarak) bu hakemlerarası güvenilirliği her zaman 0,8 aştı sağlamaktı. Bu yaklaşım, ise duplgörüşmeciler arası güvenirlik kolayca bu asgari kriter aştı icative, bize doğruluğu hakkında çok daha fazla güvence verdi. NAC alt bölgeler (kabuk vs çekirdek), AMY (merkezi-kortiko-medial vs Baso-lateral) ve MPFC (perilimbic vs infralimbic) analiz edildi. Bu bölgeler, daha özellikle bireysel AMY çekirdekleri, dorsal striatum yama ve matris bölmeleri ve NAC kabuk (köşe, kemer, koni, ara bölge) bölünebilir. NAC kabuk sürekli mısır yağı, glikoz veya fruktoz aşağıdaki FLI değişiklikleri göstermek için başarısız olduğu, bu yapının daha alt analizler yapılmamıştır. dorsal striatum yama ve matris bölgeleri kesin muayene Bu çalışmada kullanılan değildi ayrıca immünohistokimyasal teknikleri zorunlu değildir, ancak önemli bir izlem çalışmasında olacaktır. Her bir alt bölge içinde bireysel AMY çekirdeklerinin Analizleri ayrıca bir gelecek çalışma olacaktır.

Önceki çalışmalar, suc gösterdigül alımı NAC, VTA yanı sıra kabuk değil, çekirdek, merkez AMY çekirdeğinde FLI artmış, ancak sözlü veya IG sakarin infüzyon 55-57, 60-62 ölçüde etkisiz kalmaktadır. Central-kortiko-medyal AMY ve dorsal striatum, NAC çekirdek ve bazolateral AMY eski etkili etkili ve infralimbic MPFC ikincisi etkili hem de glikoz ve fruktoz emme FLI sonra şeker spesifik etkileri ortaya çıkarmıştır. Sakarin alımı suya herhangi bir site göreli FLI herhangi bir değişiklik ortaya çıkarmak için başarısız oldu. Yağ alımı da önceki çalışmalarda 65-67 yılında accumbal ve MPFC sitelerinde FLI artmış ve VTA, infralimbic ve prelimbic MPFC, dorsal striatum, NAC çekirdek eşzamanlı önemli aktivasyonu üretilen ve bazolateral ve merkez kortiko-medial AMY.

Önceki çalışmalar, şeker ve yağ alımı sistematik, mevcut çalışma ön beyin mezo-kortikolimbik ve nigro-striatal DA sistemlerinde FLI kaynaklı olduğunu göstermesine rağmenmısır yağı, fruktoz, glukoz veya sakarin akut alımı ardından değerlendirilir eş zamanlı FLI bazolateral VTA aktivasyon ve merkezi-kortiko-medial AMY dorsal striatum prelimbic ve infralimbic MPFC, NAC çekirdek ve kabuk. Önemli FLI artışlar son derece şeker ve yağ alımını aracılık dağıtılmış beyin ağ aktivasyon fikrini desteklemektedir, ön beyin siteler arasında birbiriyle ilişkili bulundu. Çoklu beyin loci eş zamanlı değişikliklerin belirlenmesi Bu protokoller, kronik ve binging koşullarda hem de klima ve tercihlerine göre kullanılabilir. Bu çalışmalar, güçlü bir anatomik korelasyon (c-fos) etkin bir şekilde birden fazla beyin sitelerinde kullanılabilir anda obezite, diyabet ilgili insan tıbbi koşullar ve diğer yeme bozuklukları içgörüler sağlayabilir hayvanlarda lezzetli alımını ve tercihlerini aracılık adaylarını belirlemek için olduğunu göstermektedir .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Acknowledgments

Bu proje üzerinde yaptıkları yoğun çalışmalardan dolayı Diana Icaza-Culaki Cristal Sampson ve Theologia Karagiorgis teşekkürler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koob, G. F. Neural mechanisms of drug reinforcement. Ann. N.Y. Acad. Sci. 654, 171-191 (1992).
  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
  4. Horvitz, J. C., Choi, W. Y., Morvan, C., Eyny, Y., Balsam, P. D. A "good parent" function of dopamine: transient modulation of learning and performance during early stages of training. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1104, 270-288 (2007).
  5. Wickens, J. R., Horvitz, J. C., Costa, R. M., Killcross, S. Dopaminergic mechanisms in actions and habits. J. Neurosci. 27, 8181-8183 (2007).
  6. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  7. Swanson, L. W. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res. Bull. 9, 321-353 (1982).
  8. Cacciapaglia, F., Wrightman, R. M., Careli, R. M. Rapid dopamine signaling differentially modulates distinct microcircuits within the nucleus accumbens during sucrose-directed behavior. J. Neurosci. 31, 13860-13869 (2011).
  9. Martinez-Hernandez, J., Lanuza, E., Martinez-Garcia, F. Selective dopaminergic lesions of the ventral tegmental area impair preference for sucrose but not for male sex pheromones in female mice. Eur. J. Neurosci. 24, 885-893 (2006).
  10. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential influence of associative and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. J. Neurosci. 17, 851-861 (1997).
  11. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential responsiveness of dopamine transmission to food-stimuli in nucleus accumbens shell/core compartments. Neurosci. 89, 637-641 (1999).
  12. Cheng, J., Feenstra, M. G. Individual differences in dopamine efflux in nucleus accumbens shell and core during instrumental conditioning. Learn. Mem. 13, 168-177 (2006).
  13. Genn, R. F., Ahn, S., Phillips, A. G. Attenuated dopamine efflux in the rat nucleus accumbens during successive negative contrast. Behav. Neurosci. 118, 869-873 (2004).
  14. Hajnal, A., Norgren, R. Accumbens dopamine mechanisms in sucrose intake. Brain Res. 904, 76-84 (2001).
  15. Hajnal, A., Smith, G. P., Norgren, R. Oral sucrose stimulation increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. 286, R31-R37 (2003).
  16. Bassareo, V., Di Chiara, G. Modulation of feeding-induced activation of mesolimbic dopamine transmission by appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neurosci. 11, 4389-4397 (1999).
  17. Hajnal, A., Lenard, L. Feeding-related dopamine in the amygdala of freely moving rats. Neuroreport. 8, 2817-2820 (1997).
  18. Bassareo, V., De Luca, M. A., Di Chiara, G. Differential expression of motivational stimulus properties by dopamine in nucleus accumbens shell versus core and prefrontal cortex. J. Neurosci. 22, 4709-4719 (2002).
  19. Feenstra, M., Botterblom, M. Rapid sampling of extracellular dopamine in the rat prefrontal cortex during food consumption, handling, and exposure to novelty. Brain Res. 742, 17-24 (1996).
  20. Hernandez, L., Hoebel, B. G. Feeding can enhance dopamine turnover in the prefrontal cortex. Brain Res. Bull. 25, 975-979 (1990).
  21. Liang, N. C., Hajnal, A., Norgren, R. Sham feeding corn oil increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291, R1236-R1239 (2006).
  22. Dunnett, S. B., Iversen, S. D. Regulatory impairments following selective kainic acid lesions of the neostriatum. Behav. Brain Res. 1, 497-506 (1980).
  23. Salamone, J. D., Zigmond, M. J., Stricker, E. M. Characterization of the impaired feeding behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions. Neurosci. 39, 17-24 (1990).
  24. Kelley, A. E. Ventral striatal control of appetitive motivation: role in ingestive behavior and reward-related learning. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 765-776 (2004).
  25. Kelley, A. E. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms. Neuron. 44, 161-179 (2004).
  26. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E. A proposed hypothalamic-thalamic-striatal axis for the integration of energy balance, arousal and food reward. J. Comp. Neurol. 493, 72-85 (2005).
  27. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E., Will, M. J. Corticostriatal-hypothalamic circuitry and food motivation: integration of energy, action and reward. Physiol. Behav. 86, 773-795 (2005).
  28. Berendse, H. W., Galis-de-Graaf, Y., Groenewegen, H. J. Topographical organization and relationship with ventral striatal compartments of prefrontal corticostriatal projections in the rat. J. Comp. Neurol. 316, 314-347 (1992).
  29. Brog, J. S., Salyapongse, A., Deutch, A. Y., Zahm, D. S. The patterns of afferent innervation of the core and shell in the "accumbens" part of rat ventral striatum: immunohistochemical detection of retrogradely transported fluoro-gold. J. Comp. Neurol. 338, 255-278 (1993).
  30. McDonald, A. J. Organization of amygdaloid projections to the prefrontal cortex and associated stritum in the rat. Neurosci. 44, 1-14 (1991).
  31. McGeorge, A. J., Faull, R. L. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat. Neurosci. 29, 503-537 (1989).
  32. Sesack, S. R., Deutch, A. Y., Roth, R. H., Bunney, B. S. Topographical organization of the efferent projections of the medial prefrontal cortex in the rat: an anterograde tract-tracing study with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J. Comp. Neurol. 290, 213-242 (1989).
  33. Wright, C. I., Beijer, A. V., Groenewegen, H. J. Basal amygdaloid complex afferents to the rat nucleus accumbens are compartmentally organized. J. Neurosci. 16, 1877-1893 (1996).
  34. Wright, C. I., Groenewegen, H. J. Patterns of convergence and segregation in the medial nucleus accumbens of the rat: relationships of prefrontal cortical, midline thalamic and basal amygdaloid afferents. J. Comp. Neurol. 361, 383-403 (1995).
  35. Geary, N., Smith, G. P. Pimozide decreases the positive reinforcing effect of sham fed sucrose in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav. 22, 787-790 (1985).
  36. Muscat, R., Willner, P. Effects of selective dopamine receptor antagonists on sucrose consumption and preference. Psychopharmacol. 99, 98-102 (1989).
  37. Schneider, L. H., Gibbs, J., Smith, G. P. D-2 selective receptor antagonists suppress sucrose sham feeding in the rat. Brain Res. Bull. 17, 605-611 (1986).
  38. Baker, R. W., Osman, J., Bodnar, R. J. Differential actions of dopamine receptor antagonism in rats upon food intake elicited by mercaptoacetate or exposure to a palatable high-fat diet. Pharmacol. Biochem. Behav. 69, 201-208 (2001).
  39. Rao, R. E., Wojnicki, F. H., Coupland, J., Ghosh, S., Corwin, R. L. Baclofen, raclopride and naltrexone differentially reduce solid fat emulsion intake under limited access conditions. Pharmacol. Biochem. Behav. 89, 581-590 (2008).
  40. Weatherford, S. C., Smith, G. P., Melville, L. D. D-1 and D-2 receptor antagonists decrease corn oil sham feeding in rats. Physiol. Behav. 44, 569-572 (1988).
  41. Azzara, A. V., Bodnar, R. J., Delamater, A. R., Sclafani, A. D1 but not D2 dopamine receptor antagonism blocks the acquisition of a flavor preference conditioned by intragastric carbohydrate infusions. Pharmacol. Biochem. Behav. 68, 709-720 (2001).
  42. Baker, R. M., Shah, M. J., Sclafani, A., Bodnar, R. J. Dopamine D1 and D2 antagonists reduce the acquisition and expression of flavor-preferences conditioned by fructose in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 75, 55-65 (2003).
  43. Dela Cruz, J. A., Coke, T., Icaza-Cukali, D., Khalifa, N., Bodnar, R. J. Roles of NMDA and dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of flavor preferences conditioned by oral glucose in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 114, 223-230 (2014).
  44. Dela Cruz, J. A., et al. Roles of dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fat-conditioned flavor preferences in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 332-337 (2012).
  45. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Pharmacology of flavor preference conditioning in sham-feeding rats: effects of dopamine receptor antagonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 65, 635-647 (2000).
  46. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Role of D(1) and D(2) dopamine receptors in the acquisition and expression of flavor-preference conditioning in sham-feeding rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, (1), 537-544 (2000).
  47. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Activation of dopamine D1-like receptors in nucleus accumbens is critical for the acquisition, but not the expression, of nutrient-conditioned flavor preferences in rats. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
  48. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Dopamine D1-like receptor antagonism in amygdala impairs the acquisition of glucose-conditioned flavor preference in rats. Eur. J. Neurosci. 30, 289-298 (2009).
  49. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Acquisition of glucose-conditioned flavor preference requires the activation of dopamine D1-like receptors within the medial prefrontal cortex in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 214-219 (2010).
  50. Malkusz, D. C., et al. Dopamine signaling in the medial prefrontal cortex and amygdala is required for the acquisition of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 233, 500-507 (2012).
  51. Bernal, S. Y., et al. Role of dopamine D1 and D2 receptors in the nucleus accumbens shell on the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor-flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 190, 59-66 (2008).
  52. Bernal, S. Y., et al. Role of amygdala dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 205, 183-190 (2009).
  53. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J. Neurosci. Methods. 29, 261-265 (1989).
  54. VanElzakker, M., Fevurly, R. D., Breindel, T., Spencer, R. L. Environmental novelty is associated with a selective increase in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex. Learn. Mem. 15, 899-908 (2008).
  55. Norgren, R., Hajnal, A., Mungarndee, S. S. Gustatory reward and the nucleus accumbens. Physiol. Behav. 89, 531-535 (2006).
  56. Park, T. H., Carr, K. D. Neuroanatomical patterns of fos-like immunoreactivity induced by a palatable meal and meal-paired environment in saline- and naltrexone-treated rats. Brain Res. 805, 169-180 (1998).
  57. Zhao, X. L., Yan, J. Q., Chen, K., Yang, X. J., Li, J. R., Zhang, Y. Glutaminergic neurons expressing c-Fos in the brainstem and amygdala participate in signal transmission and integration of sweet taste. Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 31, 1138-1142 (2011).
  58. Mungarndee, S. S., Lundy, R. F., Norgren, R. Expression of Fos during sham sucrose intake in rats with central gustatory lesions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R751-R763 (2008).
  59. Otsubo, H., Kondoh, T., Shibata, M., Torii, K., Ueta, Y. Induction of Fos expression in the rat forebrain after intragastric administration of monosodium L-glutamate, glucose and NaCl. Neurosci. 196, 97-103 (2011).
  60. Yamamoto, T., Sako, N., Sakai, N., Iwafune, A. Gustatory and visceral inputs to the amygdala of the rat: conditioned taste aversion and induction of c-fos-like immunoreactivity. Neurosci. Lett. 226, 127-130 (1997).
  61. Mitra, A., Lenglos, C., Martin, J., Mbende, N., Gagne, A., Timofeeva, E. Sucrose modifies c-fos mRNA expression in the brain of rats maintained on feeding schedules. Neurosci. 192, 459-474 (2011).
  62. Pecoraro, N., Dallman, M. F. c-Fos after incentive shifts: expectancy, incredulity, and recovery. Behav. Neurosci. 119, 366-387 (2005).
  63. Hamlin, A. S., Blatchford, K. E., McNally, G. P. Renewal of an extinguished instrumental response: Neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neurosci. 143, 25-38 (2006).
  64. Kerfoot, E. C., Agarwal, I., Lee, H. J., Holland, P. C. Control of appetitive and aversive taste-reactivity responses by an auditory conditioned stimulus in a devaluation task: A FOS and behavioral analysis. Learn. Mem. 14, 581-589 (2007).
  65. Zhang, M., Kelley, A. E. Enhanced intake of high-fat food following striatal mu-opioid stimulation: microinjection mapping and fos expression. Neurosci. 99, 267-277 (2000).
  66. Teegarden, S. L., Scott, A. N., Bale, T. L. Early life exposure to a high fat diet promotes long-term changes in dietary preferences and central reward signaling. Neurosci. 162, 924-932 (2009).
  67. Del Rio, D., et al. Involvement of the dorsomedial prefrontal cortex in high-fat food conditioning in adolescent mice. Behav. Brain Res. 283, 227-232 (2015).
  68. Knapska, E., Radwanska, K., Werka, T., Kaczmarek, L. Functional internal complexity of amygdala: focus on gene activity mapping after behavioral training and drugs of abuse. Physiol. Rev. 87, 1113-1173 (2007).
  69. Dela Cruz, J. A. D., et al. c-Fos induction in mesotelencephalic dopamine pathway projection targets and dorsal striatum following oral intake of sugars and fats in rats. Brain Res. Bull. 111, 9-19 (2015).
  70. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Elsevier. (2006).
  71. Ranaldi, R., et al. The effects of VTA NMDA receptor antagonism on reward-related learning and associated c-fos expression in forebrain. Behav. Brain Res. 216, 424-432 (2011).
Sıçanlar Naif Şeker ve Yağ Yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal Dopamin Ödül Siteleri c-Fos Aktivasyon Eşzamanlı Algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter