Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool

Published: May 27, 2016 doi: 10.3791/53900
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 4, 3, 5,6, 7,3, 8,3, 2,3
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)
* These authors contributed equally

Introduction

De lage overlevingskans in NSCLC (niet-kleincellige longkanker) van de patiënten is voornamelijk te wijten aan de beperkte effectiviteit van behandelingen in gevorderde ziekte en slechte vroege opsporing 1. Activerende mutaties in het EGFR-gen, die zijn ontdekt in een subpopulatie van NSCLC patiënten is bekend dat gevoeligheid voor kinaseremmers (TKI) tyrosine verlenen. Helaas zijn de meeste EGFR NSCLC gemuteerd patiënten ontwikkelen resistentie TKI 2. Vooral in dit verband een juiste diagnose is verplicht. In het algemeen, door lokalisatie van tumoren, verkregen biopsie weefsel in NSCLC is niet altijd uitvoerbaar. Daarom verscheidene studies worden uitgevoerd dat de niet-invasieve methoden om deze biologische gegevens te verkrijgen. Exosomes beschreven als vloeibare biopsie componenten die kunnen worden onderzocht om diagnostische en prognostische waarden met niet-invasieve technieken 3 te verkrijgen.

Exosomes zijn nanovesicles (40-100 nm diameter) van de endocytic oorsprong die zijn uitgebracht door verschillende celtypes, zowel in fysiologische en pathologische omstandigheden 4. Ze kunnen dragen eiwitten, vetten, mRNA en microRNAs. Bovendien suggereren verscheidene studies een pleiotrope rol van tumor afgeleide exosomes, die de groei en overleving van tumorcellen, angiogenese, en stromale extracellulaire matrix remodeling en geneesmiddelresistentie 5 kunnen beïnvloeden.

MicroRNAs (miRNAs) kort niet-coderende RNA die betrokken zijn bij post-transcriptionele regulatie, binding van het 3'-UTR van het doelwit mRNA en leidt het mRNA afbraak of een niet-vertaling 6. Selectief sorteren van miRNAs in exosomes is beschreven. In dit verband onlangs aangetoond in vitro en in vivo, een selectieve verpakking van miR-21 (een bekende miRNA met oncogene effecten) in exosomes vrijgegeven door chronische myeloïde leukemie cellijnen na behandeling curcumin 7.

Deexosomaal miRNA profiel is vergelijkbaar met het miRNA profiel van de primaire tumor en deze functie kan worden benut vroege diagnose en prognose 3. Concreet bestaat de mogelijkheid te karakteriseren door real-time PCR, geselecteerd miRNAs gecorreleerd met de moleculaire profiel van de ziekte, bijv., EGFR mutaties oa 8.

Hier is de analyse van een panel van geselecteerde NSCLC-gecorreleerde miRNAs 8-9 beschreven die zijn geïsoleerd uit exosomes vrijgegeven in het bloed van patiënten met NSCLC. Na het verkrijgen van de toestemming rapport op de hoogte van de patiënten, plasma van 12 NSCLC patiënten en 6 gezonde controles, werden geanalyseerd. De exosoom isolatie werd uitgevoerd met commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Voordat exosoom isolatie, werden plasmamonsters behandeld met RNAse, teneinde verontreiniging circulerende miRNAs degraderen. We besloten om deze analyse met een commerciële kit voeren vanwege de beperkte normalisatie van andere tech-wachtrijen (bv., ultracentrifugatie) wat vooral van belang bij het ​​werken met klinische monsters. Deze kit bevat een Proteinase K behandeling, die de RNAse zal degraderen, en vermindert zo het risico op exosomaal miRNAs degraderen na exosome lysis. MicroRNA analyse werd uitgevoerd door gevoelige en specifieke real-time PCR-analyse; mir-1228-3p werd gebruikt als endogene controle en de gegevens werden genormaliseerd volgens de formule 2 - ΔΔct. Controlewaarden worden als basislijn en resultaten worden getoond in een logaritmische schaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. exosome Isolation

Opmerking: De isolatie van exosomes uit het plasma monsters werd uitgevoerd met een commerciële kit, volgens het protocol van de fabrikant en door toevoeging van RNAse behandeling: (al deze stappen moeten worden uitgevoerd met een persoonlijke en milieu beschermingsmiddelen en volgende specifieke juridische procedure voor het manipuleren van biologische monsters ).

  1. Neem 1 ml plasma van elk monster, opgeslagen bij -80 ° C, en plaats het op ijs.
  2. Centrifugeer het monster bij 2000 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur; Deze passage is verplicht om de cellen en resten te verwijderen.
  3. Breng de supernatant dat het schone plasma naar een nieuwe 1,5 ml buis.
  4. Centrifugeer de nieuwe buis bij 10.000 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Breng de supernatant dat het schone plasma naar een nieuwe 1,5 ml buis.
  6. Voeg 100 ng / ml RNAse aan het supernatant en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 10 min inOm degraderen circulerende RNAs.
  7. Transfer alle behandelde plasma naar een nieuwe 2 ml buis en voeg 0,5 volume van 1x PBS.
  8. Vortex het monster om de oplossingen te mengen.
  9. Voeg 0,05 hoeveelheden proteïnase K oplossing (omsluiten in de kit) aan het monster.
  10. Vortex het monster en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
  11. Voeg 0,2 volume van exosome neerslag buffer om het monster en de oplossingen te mengen door inversie.
  12. Incubeer het monster bij 2 ° C tot 8 ° C gedurende 30 minuten en centrifugeer het monster bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Zuig en gooi de supernatant. De pellet bevat het geïsoleerde exosomes.
  14. Voeg geselecteerde buffer de exosome pellet om de exosomes resuspenderen. De keuze van de buffer afhankelijk van de stroomafwaartse analyse geplande, in dit geval:
    1. Voeg 100 ul 1X PBS om TEM analyse.
    2. Voeg 346,5 ul specifieke lysis buffer voor RNA-extractie (uit commerciële kit) (LET OP: chemische gevaar).
    3. Voeg 100 ul lysisbuffer voor eiwitextractie (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - 300 mM NaCl - Triton X-100 0,5% - 1 mM PMSF - leupeptine / aprotinine 10 ug / ml) teneinde Western Blotting analyse. (LET OP: chemische risico's).
  15. Bewaar de geresuspendeerde exosomes bij -20 ° C.

2. exosome karakterisering door Western Blot Analyse

Let op: Met het oog op de geïsoleerde nanovesicles karakteriseren, is western blotting met antilichamen tegen ALIX en Tsg101 (bekende exosomaal markers) aanbevolen.

  1. Na resuspenderen van de pellet in exosome lysisbuffer, plaats het op ijs gedurende 1 uur om de exosomaal membraan oplossen.
  2. Centrifugeer het lysaat bij 12.000 g gedurende 10 min en breng het supernatant naar een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren.
  3. Kwantificeren van de totale exosomaal eiwit content door Bradford Assay of andere methoden en de belasting 50 ug van eiwitten per putje in een Tris / Glycine SDS - 8% Polyacrylamide gel. (LET OP: chemische risico's).
  4. Scheid de eiwitten (en een geschikt moleculair gewicht marker) in 8% SDS-PAGE gelelektroforese met loopbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS) gedurende 1 uur en 30 minuten bij 120 V. (NB: chemische gevaren ).
  5. Breng het eiwit aan een nitrocellulose membraan door elektroblotting bij 4 ° C koude overdracht buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol) gedurende 1 uur bij een constante 50 V (NB: chemische gevaren).
  6. Blokkeer de membraan 1 uur bij langzaam roeren met 5% vetvrije droge melk in 1 x TBS -Tween 0,1%.
  7. Was het membraan 4 keer gedurende 5 minuten in een snelle beweging met 1x TBS - Tween 0,1%.
  8. Voeg de primaire antilichamen tegen ALIX en Tsg101 (één per membraan) in geschikte buffer (dienovereenkomstig aan het antilichaam datasheet van de fabrikant) en incubeer het membraan O / N; In langzaam roeren.
  9. Was het membraan 5 keer voor 5 min in een snelle beweging met 1x TBS - Tween 0,1% om overmatige antilichaam te verwijderen.
  10. Voeg de juiste secundaire antilichaam in geschikte buffer (dienovereenkomstig aan het antilichaam datasheet van de fabrikant) en incubeer het membraan gedurende 1 uur in langzaam roeren.
  11. Was het membraan 5 keer voor 5 min in een snelle beweging met 1x TBS - Tween 0,1% om overmatige antilichaam te verwijderen.
  12. Detecteren de geselecteerde eiwit door chemiluminescentie analyse 11.

3. exosome Karakterisering door TEM Analyse

Let op: Met het oog op de geïsoleerde exosomes visualiseren, werd TEM analyse (Transmission Electron Microscopy) uitgevoerd.

  1. Plaats ~ 10 ug (voorheen gekwantificeerd door Bradford test) monster van intacte exosomes geresuspendeerd in 1 x PBS op een parafilm en op het monster vallen een Formvar koolstof beklede nikkelen net voor 1 uur.
    2. <li> Was het rooster 3 maal door het plaatsen van het op drie 40 ul 1x PBS daalt.
  2. Was het net 5 keer door het plaatsen van het op vijf 30 ul ultrapuur water druppels.
  3. Bevestig het monster door het toevoegen van een daling van 2,5% glutaraldehyde (LET OP: chemische gevaar) gedurende 10 min.
  4. Was het rooster 3 maal door het plaatsen van het op drie 40 ul 1x PBS daalt.
  5. Voeg een druppel 2% uranyl acetaat (WAARSCHUWING: chemische risico) en zet het rooster bovenop het voor 15 minuten om het monster contrast.
  6. Insluiten het monster op een daling van 0,13% methylcellulose (NB: chemische risico) en 0,4% uranyl acetaat en incubeer het rooster bovenop de druppel gedurende 10 minuten.
  7. Verwijder voorzichtig vloeibare overtollige met een absorberend papier en droog de grid voor 5 min met de gecoate kant naar boven.
  8. Bestudeer het rooster door de transmissie-elektronenmicroscoop 12.

4. exosomaal RNA-extractie en kwantificering

Let op: We hebben besloten om perfORM de totale RNA-extractie uit exosomaal monsters met behulp van een commerciële kit, volgens het protocol van de fabrikant: (LET OP: chemische gevaren, protocolbindingen en richtlijnen van de fabrikant).

  1. Na resuspensie van de exosome pellet in 346,5 ul lysisbuffer, voeg 3,5 ul van β-Mercaptoethanol (LET OP: chemische risico's) en vortex krachtig; Deze passage is verplicht om de lipide membranen te vernietigen.
  2. Voeg het lysaat aan de waskolom in een verzamelbuis en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Na centrifugeren gooi de kolom en breng het filtraat over in een nieuwe 1,5 ml RNase-vrije buis.
  3. Voeg 350 ul van 70% ethanol (LET OP: chemische risico's) en meng door vortexen gedurende 5 sec.
  4. Plaats het lysaat in het oplossend kolom en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 8000 x g. Na centrifugeren, gooi de doorstroom en de overdracht van de kolom om een ​​nieuwe collectie buis.
  5. Plaats 350 pl van ontzouten buffer en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Na centrifugeren, gooi de doorstroom en de terugkeer van de kolom in dezelfde collectie buis.
  6. Voeg 95 ul DNase I reactiemengsel (10 pi gereconstitueerde DNase I + 90 gl DNase buffer voor elk monster) op het silica membraan van de kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. (LET OP: chemische gevaar)
  7. Voeg 200 pl wasbuffer (LET chemisch gevaar) aan de kolom en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Plaats de kolom in een nieuwe collectie buis.
  8. Voeg 600 pl wasbuffer aan de kolom en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Na centrifugeren, gooi doorstroom en plaats de kolom in dezelfde collectie buis.
  9. Voeg 250 pl wasbuffer aan de kolom en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 2 minuten. Plaats de kolom in een 1,5 ml RNAse-vrij buis.
  10. Elueer het RNA in 40 ul RNAse-vrij water en centrifugeer bij 11.000 5; g gedurende 1 min, teneinde een hoog RNA-concentratie in het klein volume hebben.
  11. Plaats onmiddellijk geëlueerde RNA op ijs mogelijke afbraak of bewaar bij -80 ° C te voorkomen.
  12. Kwantificeren van de RNA inhoud. Opmerking: Hier werd het RNA kwantisatie uitgevoerd met 1 pl monster door spectrofotometer.

5. Retrotrascription van exosomaal miRNAs

Opmerking: Door de beschreven beperkte hoeveelheid miRNAs inhoud exosomes, werd besloten om de reverse transcriptie van geselecteerde miRNAs voeren een commerciële kit assay gebruikmakend van een individueel voor elke miRNA, volgens het protocol van de fabrikant. Voor elk monster werden 8 miRNAs gecorreleerd met NSCLC-status geselecteerd (miR-30b, miR-30c, miR-103, miR-122, miR-195, miR-203, miR-221, miR-222 en miR-1228- 3p als endogene controle).

  1. Bereid de Reverse transcriptie master mix (RT mix). Voor elke reactie bereiden 7 pl RT mix, zoals beschreven inhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (klik hier om te downloaden) (LET OP: chemische gevaar).
    Opmerking: In dit experiment werden 9 verschillende RT mix Voor elk monster.
  2. Meng voorzichtig en bewaar de RT mix op ijs. Voeg 7 ul van RT mix per reactie buis.
  3. Voeg 5 ul van het monster RNA (10 ug totaal RNA) per reageerbuisje en meng voorzichtig.
  4. Voeg 3 ul van de 5x reverse transcriptie primers (LET OP: chemische gevaar) van elke set in de overeenkomstige reactie buis test.
  5. Meng langzaam, sluit de buis en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
  6. Laad de reactiebuis in de thermische cycler en start de reverse transcriptiereactie met het volgende parameterwaarden (HOLD bij 16 ° C gedurende 30 min, houden op 42 ° C gedurende 30 min, houden op 85 ° C gedurende 5 min; HOLD ∞ 4 ° C).

6. Real Time PCR analyse van exosomaal miRNAs

Opmerking: Deze analyse wasuitgevoerd met een commerciële kit voor Real Time PCR (qPCR), drie biologische en technische replicaten per monster.

  1. Voor elke reactie, voor te bereiden 17,67 pi Real Time PCR-mix (10 pi PCR Master Mix + 7,67 pi van Nuclease-vrij water), meng het en op ijs gezet. (LET OP: chemische gevaar)
  2. Voeg 1 ui, voor elke PCR-buis, van 20x qPCR primers (LET OP: chemische gevaar).
  3. Plaats 18.67 ul van de qPCR mix in elk putje-plaat.
  4. Voeg 1,33 ul van de reverse transcriptie product in de correspondent goed plaat.
  5. Sluit de plaat en draai het (300 GX 5 sec).
  6. Plaats de plaat in een real-time PCR-systeem en start de run met behulp van de volgende PCR voorwaarden: HOLD bij 95 ° C gedurende 10 min; 40 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 60 sec bij 60 ° C. Werkwijze en gegevens normaliseren volgens de formule 2 - 13 ΔΔct.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een totaal van 12 plasma van NSCLC patiënten en 6 gezonde controles werden verwerkt met commerciële kit voor exosome isolatie uit plasma. Elk monster werd verwerkt door Western Blot analyse om de exosomaal markers ALIX (96 kDa) en Tsg101 (43 kDa) te evalueren. Een voorbeeld van deze resultaten getoond voor monsters 3 in figuur 1, wat aangeeft dat exosome isolatie van plasmamonsters haalbaar met dit protocol.

Om biofysisch karakteriseren exosomaal monsters werd TEM analyse uitgevoerd. TEM blijkt dat de daarbij verkregen isolatieprotocol nanovesicles een gemiddelde grootte in het traject van exosomaal grootte tussen 40-100 nm (figuur 2).

Na exosome isolatie en karakterisering, onderzochten we de miRNAs content. Wij selecteerden 8 specifieke miRNAs, bekend te worden deregulated in NSCLC. Interne controle gebruikten we miR-1228 die eerder is gevalideerd als een stabiele en efficiënte endogene controle in verschillende tumortypen 10. Volgens deze resultaten miR-1228 is een betrouwbare en stabiele endogene controle. Wanneer het expressieniveau van de 8 geselecteerde miRNA tussen gezonde donoren en longkanker patiënten werden vergeleken, werd gevonden dat deze miRNAs sterk gedereguleerd in de geanalyseerde klinische monsters. In figuur 3 van de expressie patroon van de 8 geselecteerde miRNAs wordt getoond op een logaritmische schaal voor de 12 geanalyseerde monsters (PAD1-12). Niet alle miRNAs detecteerbaar in elk monster en vanwege de beperkte hoeveelheid monsters kunnen we geen statistische analyse.

Figuur 1
Figuur 1. Western Blot Analyse in 3 exosomaal Monsters voor ALIX en Tsg101. De Western Blot toont de aanwezigheid vande bekende exosomaal markers, ALIX en TSG-101, in de geanalyseerde monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. TEM Analyse van exosomaal Monsters Deze resultaten tonen aan dat de geïsoleerde nanovesicles hebben een gemiddelde diameter tussen 40 -.. 100 nm, binnen het bereik exosomaal Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Expressie Profiel van 8 Geselecteerde miRNAs in exosomaal monsters. Deze gegevens, weergegeven in logaritmische schaal, tonen aan dat through dit protocol haalbaar is om up- zien of down-regulatie van geselecteerde exosomaal miRNAs uit klinische NSCLC plasma patiënten (PAD1-12), wat leidt tot mogelijke ontdekking van biomarkers exosomaal van NSCLC. De gegevens worden weergegeven als een factor van meningsuiting ten opzichte van gezonde controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met deze gecombineerde protocol was het mogelijk om een ​​analyse uit te voeren exosomaal miRNA in plasma van patiënten met NSCLC. Deze gegevens kunnen de ziekte status weer te geven, maar dit dient te worden bevestigd door verdere studie.

Het protocol in dit artikel is gebaseerd op een commerciële kit voor exosome isolatie. De reden was dat de andere bekende isolatieprocedures (bv., Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie) vereist manuele procedures, wat leidt tot een beperkte standaardisatie. Toch is een van de beperkingen van dit protocol is dat vergeleken met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor exosome isolatie, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie blijft een zeer bruikbare techniek exosoom isolement de soortelijke massa exosomes exploiteert (tussen 1,13-1,19 g / ml). Een mogelijke modificatie een combinatie van beide procedures, waarbij een gouden standaard op dit gebied zou kunnen zijn.

De mogelijkheid om klinische sampl verwerkenes met RNase behandeling heeft ons pure monsters gegeven zonder verontreiniging van circulerende miRNAs. De aanwezigheid van RNase enzymen in de monsters kan na lysis exosome de hoeveelheid exosomaal miRNA bewerkstelligen. Daarom kozen we een kit met proteïnase K behandeling om circulerende verontreinigende eiwitten heffen en RNase enzymen breken.

Na de standaardisering van alle isolatie procedures, kan de toekomst karakterisering en miRNA analyse van deze gegevens een nuttig instrument om biomarkers in een niet-invasieve manier te detecteren tijdens de initiële diagnose en follow-up vormen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total exosome isolation kit (from plasma)  Invitrogen 4484450 Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9) Cell Signaling 2171S
TSG-101 Antibody (C-2) SantaCruz Biotecnology SC-7964 
Anti-Mouse HRP 1 ml   Cell Signaling 7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50 GE HealthCare 25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Life Technologies 4440043

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

Tags

Geneeskunde exosomes miRNAs NSCLC Liquid biopsie Kreeft Biomarker
Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giallombardo, M., Chacártegui… More

Giallombardo, M., Chacártegui Borrás, J., Castiglia, M., Van Der Steen, N., Mertens, I., Pauwels, P., Peeters, M., Rolfo, C. Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool. J. Vis. Exp. (111), e53900, doi:10.3791/53900 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter