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qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 '플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

Published: May 27, 2016 doi: 10.3791/53900
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 4, 3, 5,6, 7,3, 8,3, 2,3
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)
* These authors contributed equally

Introduction

NSCLC (비 소 세포 폐암) 환자에서 낮은 생존율 고급 질환 불량을 조기에 발견 치료 1의 제한된 효능에 주로 기인한다. NSCLC 환자의 개체군에서 발견 된 EGFR 유전자의 활성화 돌연변이, 키나제 억제제 (TKIs)를 티로신 민감성을 부여하는 것으로 알려져있다. 불행히도, EGFR 돌연변이 NSCLC 환자의 대부분은 TKI 저항이 개발. 특히 이러한 상황에서, 정확한 진단이 필수적이다. 때문에 종양의 현지화에, 일반적으로 비소 세포 폐암에서 생검 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않습니다. 따라서, 몇몇 연구는이 생체 데이터를 획득하는 비 침습적 방법을 사용하는 것을 계속한다. 엑소 좀은 비 침습적 방법 (3) 진단 및 예후 값을 얻기 위해 조사 할 수있는 액체 생검 컴포넌트로서 기술되어있다.

전자의 - ​​(100 나노 미터 직경 40) 엑소 좀은 nanovesicles 있습니다생리적, 병리 적 상태로 4 모두 다른 세포 유형으로 출시 ndocytic 기원. 그들은 단백질, 지질,의 mRNA 및 마이크로 RNA를 수행 할 수 있습니다. 또한, 몇몇 연구는 종양 세포, 혈관, 간질 및 세포 외 기질 리모델링 및 약제 내성 (5)의 성장과 생존에 영향을 미칠 수있는 종양 유래 엑소 좀의다면 발현 성 역할을 제안한다.

마이크로 RNA (miRNA가)는 대상의 mRNA의 3'- UTR 결합 열화 또는 비 번역 (6) mRNA의 선두, 전사 후 조절에 관여하는 짧은 비 코딩 RNA이다. 엑소 좀에의 miRNAs의 선택적 정렬 설명 하였다. 이러한 맥락에서 최근 관내 및 생체 내에서, 커큐민 처리 후 7 만성 골수성 백혈병 세포주에 의해 방출 엑소 좀 미르-21 (종양 효과를 갖는 공지의 miRNA)의 선택적 포장 입증되었다.

그만큼exosomal miRNA의 프로필은 기본 종양의 miRNA의 프로파일과 유사하며이 기능은 조기 진단 및 예후 3에서 악용 될 수 있습니다. 구체적으로, 실시간 PCR에 의해 특성화 할 수있는 가능성이있는 질병의 분자 프로파일과 상관 선택의 miRNAs 등. 다른 8 중에서 EGFR 돌연변이.

여기서, NSCLC 상관의 miRNAs 8-9 선택된 패널 분석 NSCLC 환자의 혈액에 방출 엑소 좀으로부터 분리 된 것이 기재되어있다. (가) 환자의 동의 보고서를 통보받은 후, 12 비소 세포 폐암 환자 6 건강한 대조군의 플라즈마, 분석 하였다. 엑소 좀 분리는 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트 하였다. 엑소 좀을 분리하기 전에 혈장 샘플은 오염물의 miRNAs 순환을 저하시키기 위해, RNAse가 처리 하였다. 우리는 때문에 다른 TECHNI의 제한된 표준화에 상용 키트이 분석을 수행하기로 결정임상 샘플로 작업 할 때 특히 중요하다 QUES (예., 초 원심 분리). 이 키트는 RNAse가 저하하고, 따라서 엑소 좀 용해 후 exosomal의의 miRNAs을 저하 할 위험을 감소하는 테 K 처리를 포함한다. 마이크로 RNA 분석은 민감하고 특이 리얼 타임 PCR 분석에 의해 수행 하였다; 미르 1228-3p는 화학식 2에 따른 내인성 대조군으로 사용하고, 데이터는 정규화 된 - ΔΔct. 제어 값을 기준으로 사용되며, 그 결과를 대수 눈금으로 나타나있다.

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Protocol

1. 엑소 좀 격리

참고 : 혈장 샘플에서 엑소 좀의 분리는, 제조 업체의 프로토콜에 따라 및 추가의 RNAse 처리에 의해, 상용 키트와 함께 수행 하였다 : (모든 단계는 생물학적 시료의 조작에 대한 구체적인 법적 절차에 따라 개인 및 환경 보호 장비와 함께 수행해야합니다 ).

  1. -80 ° C에 저장된 각 샘플의 플라즈마 1 ㎖를 타고, 얼음에 놓습니다.
  2. RT에서 20 분 동안 2000 × g에서 샘플을 원심 분리기; 이 구절은 세포와 파편을 제거하기 위해 필수입니다.
  3. 새로운 1.5 ML 튜브에 깨끗한 플라즈마를 포함 뜨는을 전송합니다.
  4. 실온에서 20 분 동안 10,000 × g에서 새 튜브를 원심 분리기.
  5. 새로운 1.5 ML 튜브에 깨끗한 플라즈마를 포함 뜨는을 전송합니다.
  6. 10 분에서 37 ° C에서 튜브를 뜨는에 RNAse가 100 ng를 / ㎖를 추가하고 배양순서는 RNA를 순환이 저하 될 수 있습니다.
  7. 새로운 2 ML 튜브에 모든 플라즈마 처리를 전송하고 1X PBS의 0.5 볼륨을 추가합니다.
  8. 용액을 혼합하기 위해 샘플을 소용돌이.
  9. 샘플에 테 K 용액 (키트에 묶)의 0.05 볼륨을 추가합니다.
  10. 소용돌이 샘플 후 10 분 동안 37 ° C에서 품어.
  11. 샘플에 엑소 좀 침전 버퍼의 0.2 볼륨을 추가하고 반전하여 솔루션을 섞는다.
  12. 30 분 동안 8 ° C에 2 ° C에서 샘플을 품어 후 실온에서 5 분간 10,000 × g에서 샘플을 원심 분리기.
  13. 기음과 상층 액을 버린다. 펠렛은 고립 된 엑소 좀이 포함되어 있습니다.
  14. 엑소 좀을 재현 탁하기 위해 엑소 좀 펠렛을 선택한 버퍼를 추가합니다. 버퍼의 선택은이 경우, 계획 하류 분석에 의존
    1. TEM 분석을 수행하기 위해 1X PBS 100 ㎕를 추가한다.
    2. 특정 용해 버피의 346.5 μl를 추가(상업 키트) RNA 추출 (: 화학 위험주의)에 대한 FER.
    3. 단백질 추출 용해 완충액 100 ㎕를 추가 (트리스 -HCl 50 mM의 pH를 7.6 - 염화나트륨 300 mM의 - 트리톤 X-100 0.5 % - PMSF 1mM의 - 펩틴 / 아프로 티닌 10 μg의 / mL)로 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 위해서이다. (주의 : 화학적 유해성).
  15. -20 ° C에서 재현 탁 엑소 좀을 저장합니다.

웨스턴 블롯 분석 2. 엑소 좀 특성

참고 : 격리 nanovesicles을 특성화하기 위해,로 Alix와 TSG101 (잘 알려진 exosomal 마커)에 대한 항체와 웨스턴 블로 팅을 권장합니다.

  1. 용해 완충액의 엑소 좀 펠릿 재 부유 한 후, exosomal 막을 용해하기 위해 1 시간 동안 얼음에 배치.
  2. 10 분 동안 12,000g에서 해물을 원심 분리기와 펠렛을 방해하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
  3. 총 exosomal 단백질 conten를 정량화브래드 포드 분석 또는 다른 방법으로 t 및로드 트리스 / 글리신 SDS가 잘되는 당 단백질의 50 μg의 - 8 % 폴리 아크릴 아미드 젤. (주의 : 화학적 유해성).
  4. 화학적 유해성 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS)에서 1 시간 동안 120 V. 30 분 (주 버퍼 실행 8 % SDS-PAGE 겔 전기 영동에서 단백질 (적절한 분자량 마커)를 별개 ).
  5. (: 화학적 유해성주의) 일정 50 V.에서 1 시간 동안 4 ° C 저온 전송 버퍼 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 20 % 메탄올)로 electroblotting에 의해 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송합니다.
  6. 1 배 TBS -Tween 0.1 %에서 5 % 무 지방 건조 우유와 느린 교반 1 시간 동안 멤브레인을 차단합니다.
  7. 트윈 0.1 % - 1 배 TBS 빠른 교반에 5 분 동안 막 4 회 반복한다.
  8. 로 Alix 적절한 버퍼에 TSG101 (막 당 하나)에 대한 일차 항체를 추가 (이에 따라 제조업체의 항체 데이터 시트에)와 막 O / N 품다; 천천히 교반한다.
  9. 과도한 항체를 제거하기 위해 트윈 0.1 % - 멤브레인에게 1 배 TBS 빠른 교반 5 분 동안 5 회 반복한다.
  10. 적절한 버퍼 (이에 따라 제조업체의 항체 데이터 시트에) 적절한 이차 항체를 추가하고 천천히 교반 1 시간 동안 멤브레인을 품어.
  11. 과도한 항체를 제거하기 위해 트윈 0.1 % - 멤브레인에게 1 배 TBS 빠른 교반 5 분 동안 5 회 반복한다.
  12. 화학 발광 분석 (11)에 의해 선택된 단백질을 감지합니다.

TEM 분석 3. 엑소 좀 특성

주 : 절연 엑소 좀을 시각화하기 위해서, TEM (투과 전자 현미경) 분석을 실시 하였다.

  1. 장소 ~ 10 μg의이 파라 필름에 1X PBS에 재현 탁 그대로 엑소 좀 샘플의 (이전 브래드 포드 분석에 의해 정량) 시료에 넣어 1 시간의 formvar 탄소 코팅 니켈 격자를 놓습니다.
    2. <리> PBS 방울 1X 세 40 μL에 위치하여 그리드를 3 회 반복한다.
  2. 오 30 μl의 초순수 방울에 위치하여 그리드 5 회 반복한다.
  3. 10 분 동안 2.5 % 글루 타르 알데히드 (화학 위험주의) 한 방울을 첨가하여 샘플을 고정한다.
  4. PBS 방울 1X 세 40 μL에 위치하여 그리드를 3 회 반복한다.
  5. 2 % 우라 닐 아세테이트 한 방울 추가 (주의 : 화학 위험) 및 샘플을 대비하기 위해 15 분 동안 그 위에 격자를 넣어.
  6. 0.13 % 메틸 셀룰로오스 방울에 샘플을 삽입 (주의 : 화학적 유해성) 및 0.4 % 우라 닐 아세테이트와 10 분 동안 방울 위에 그리드를 배양한다.
  7. 부드럽게 흡수 종이로 액체 과잉을 제거하고 코팅 된면을 위로하여 5 분 동안 그리드를 건조.
  8. 투과형 전자 현미경 (12)에 의한 격자를 조사한다.

4. Exosomal RNA 추출 및 정량

참고 : 우리는 PERF하기로 결정제조 업체의 프로토콜에 따라, 상용 키트를 사용하여 exosomal 샘플에서 총 RNA 추출을 ORM : (주의 : 화학 물질의 유해성, 제조 업체의 프로토콜과 가이드 라인을 검토합니다).

  1. 용해 버퍼의 346.5 μL의 엑소 좀 펠릿의 재 부유 한 후, β-머 캅토 에탄올 3.5 μl를 추가 적극적으로 (주의 화학적 유해성)와 소용돌이를; 이 구절은 지질 세포막을 파괴하기 위해 필수입니다.
  2. 1 분 동안 11,000 × g에서 수집 튜브와 원심 분리기의 세정 탑에 해물을 추가합니다. 원심 분리 후, 열을 폐기하고 새로운 1.5 ml의의 RNase없는 튜브에 여과 액을 전송합니다.
  3. 70 % 에탄올 350 μl를 추가 (주의 : 화학적 유해성)을 5 초 동안 볼 텍싱하여 혼합한다.
  4. 8,000 × g에서 30 초 동안 해결 열 및 원심 분리기의 해물을 넣습니다. 원심 분리 후, 유체 통과를 버리고 새 컬렉션 튜브에 열을 전송합니다.
  5. 탈염 buffe 350 μl를로드1 분 동안 11,000 × g에서 연구 및 원심 분리기. 원심 분리 후, 유체 통과를 무시하고 동일한 수집 튜브에 열을 반환합니다.
  6. 컬럼의 실리카 막에의 DNase I 반응 혼합물 95 μL (재구성 DNase를 10 μL I는 각 샘플에 대해, DNase의 완충액 90 μl를 +)를 첨가하고 RT에서 15 분 동안 RT에서 배양한다. (주의 : 화학 위험)
  7. 1 분 동안 11,000 × g에서 열 원심 분리기에 : (화학 위험주의) 세척 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 새 컬렉션 튜브에 열을 놓습니다.
  8. 1 분 동안 11,000 × g에서 열 원심 분리기로 세척 버퍼의 600 μl를 추가합니다. 원심 분리 후, 유체 통과 무시하고 동일한 수집 튜브에 열을 배치합니다.
  9. 2 분 동안 11,000 × g에서 열 원심 분리기로 세척 버퍼의 250 μl를 추가합니다. 1.5 ml의 RNA 분해 효소가없는 튜브에 열을 놓습니다.
  10. 11000에서의 RNA 분해 효소가없는 물을 40 μL의 RNA 원심을 용출 5; 순서로 1 분 g이 작은 볼륨에서 높은 R​​NA 농도를 가지고 있습니다.
  11. 즉시 -80 ° C에서 잠재력 저하 또는 저장을 방지하기 위해 얼음에 용출 RNA를 놓습니다.
  12. RNA의 내용을 정량화. 주 : 여기에서, RNA 양자화는 분광 광도계를 통하여 시료 1 μl를 이용하여 수행 하였다.

Exosomal의의 miRNAs의 5 Retrotrascription

주 : 엑소 좀의 miRNAs의 내용의 설명 수량 한정하기 위해서는 각 miRNA에 대한 개별 분석을 이용하여 시판 키트를 통해 선택의 miRNAs의 역전사를 수행하기로 결정 하였다 인해 제조사의 프로토콜에 따라. 각 샘플의 경우, 비소 세포 폐암의 상태에 상관 관계 (8)의 miRNAs는 (은 miR-30B를 선택 하였다은 miR-103;은 miR-122은 miR-195,은 miR-203은 miR-221,은 miR-222, 미르-1228-은 miR-30C를 3P) 내생 제어와 같은.

  1. 역전사 마스터 믹스 (RT 믹스)를 준비한다. 에 기재된 각 반응의 경우, RT 믹스 7 ㎕를 준비https://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (다운로드하려면 여기를 클릭) (주의 : 화학 위험).
    주 :이 실험에서, 9 개의 다른 RT 혼합물은 각 시료를 준비 하였다.
  2. 부드럽게 혼합하고 얼음에 RT 믹스를 저장합니다. 반응 관 당 RT 믹스의 7 μl를 추가합니다.
  3. 반응 관 당 샘플 RNA (총 RNA의 10 μg의) 5 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다.
  4. 해당 반응 관에 설정 한 각 분석에서 (화학 위험주의)이 5 배 역전사 프라이머의 3 μl를 추가합니다.
  5. 천천히 혼합 튜브를 닫고 5 분 동안 얼음에 품어.
  6. 열 사이 클러에 반응 튜브를 넣고 30 분 동안 16 ° C에서 다음 파라미터 값 (HOLD를 사용하여 역전사 반응을 개시 30 분 동안 42 ° C에서 캔슬 5 분 동안 85 ° C에서 HOLD 및 HOLD ∞ 4 기음).

Exosomal의 miRNAs 6. 실시간 PCR 분석

참고 :이 분석했다샘플 당 세 생물학적 및 기술 복제와 실시간 PCR (qPCR에)에 대한 상용 키트를 사용하여 수행.

  1. 각 반응의 경우, 리얼 타임 PCR 믹스의 17.67 μL (PCR 마스터 믹스 + 뉴 클레아없는 물 7.67 μl를 10 μl를) 준비를 혼합하고 얼음에 넣어. (주의 : 화학 위험)
  2. (: 화학 위험주의) 20 배 qPCR에 프라이머의 각 PCR 튜브에 대해, 1 μl를 추가합니다.
  3. 각 웰 플레이트에 qPCR에 믹스의 18.67 μl를 놓습니다.
  4. 상대 잘 플레이트로 역전사 제품의 1.33 μl를 추가합니다.
  5. 판을 닫고 (300 GX 5 초) 스핀.
  6. 리얼 타임 PCR 시스템의 플레이트를 삽입하고 다음 PCR 조건을 사용하여 실행을 시작 : 10 분 동안 95 ° C에서 HOLD; 95 ° C에서 15 초, 60 ° C에서 60 초 40주기. ΔΔct 13 - 처리는 식 2에 따라 데이터를 정상화.

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Representative Results

비소 세포 폐암 환자의 12 플라즈마 및 6 건강한 대조군의 총 플라즈마에서 엑소 좀 격리를위한 상업 키트와 함께 처리했다. 각 샘플은 exosomal 마커로 Alix (96 kDa 이상) 및 TSG101 (43 kDa 이상)을 평가하기 위해서 웨스턴 블롯 분석에 의해 처리 하였다. 이러한 결과의 일례는 혈장 샘플로부터 엑소 절연이 가능한 프로토콜 인 것을 나타내는,도 1과 3의 샘플에 대해 도시된다.

biophysically exosomal 샘플을 특성화하기 위해, TEM 분석을 수행 하였다. 100 나노 미터 (도 2) - TEM (40) 사이에,이 분리 프로토콜에 의해 얻어진 nanovesicles exosomal이 크기 범위의 평균 크기를 가지고 있음을 보여 주었다.

엑소 분리 및 특성화 후, 자신의 miRNAs 함량을 조사 하였다. 우리 deregulat 것으로 알려진 특정 miRNAs의 팔을 선택한비소 세포 폐암에서 에드. 내부 통제, 우리는 이전에 다른 종양의 종류 (10)의 안정적이고 효율적인 내생 컨트롤로 검증되었습니다은 miR-1228을 사용했다. 이 결과에 따르면 미르 1228 신뢰성 있고 안정적​​인 내인성 제어이다. 건강한 공여자 및 폐암 환자 사이의 miRNA 선택된 8의 발현 수준과 비교했을 때, 이들의 miRNAs 강하게 분석 임상 샘플에서 규제가 완화되는 것을 알 수 있었다. 그림 3에서 8 선택의 miRNAs의 발현 패턴 분석 12 샘플 (PAD1-12)에 대한 로그 스케일에 표시됩니다. 모든의 miRNAs은 모든 시료에서 검출되었다 인해 샘플의 제한된 양에 우리는 통계 분석을 수행 할 수 없습니다.

그림 1
그림로 Alix와 TSG101 3 Exosomal 샘플 1. 웨스턴 블롯 분석. 서양의 얼룩은의 존재를 보여줍니다잘 알려진 exosomal 마커로 Alix와 TSG-101, 분석 된 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
Exosomal 샘플 그림 2. TEM 분석 이러한 결과는 (40) 사이에 절연 nanovesicles는 직경 평균이 있음을 입증 -.. 100 나노 미터의 exosomal 범위 내에서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
Exosomal 샘플 8 선택의 miRNAs의 그림 3. 식 프로필. 로그 스케일에 표시된 이러한 데이터, 그 통해 서을 보여시간이 프로토콜은 비소 세포 폐암의 exosomal 바이오 마커의 잠재력 발견으로 이어지는, 위쪽 참조하거나 아래로 조절 임상 NSCLC 플라즈마 명 (PAD1-12)에서 선택 exosomal의 miRNA에의 할 가능하다. 데이터는 정상 대조군에 비해 표현의 배로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 조합 된 프로토콜로는 NSCLC 환자의 혈장에서의 miRNA exosomal 분석을 수행 할 수 있었다. 이러한 데이터는 질병 상태를 반영 할 수 있지만, 추가 연구에 의해 확인되어야한다.

이 문서에서 사용되는 프로토콜은 엑소 좀 격리를위한 상업 키트를 기반으로했다. 그 이유는 다른 공지 된 분리 절차 (예., 밀도 구배 초 원심 분리) 제한된 표준화 선도 이상의 수동 절차를 필요이었다. 그럼에도 불구하고,이 프로토콜의 제한 중 하나는 엑소 격리를위한 밀도 구배 초 원심 분리에 비하여, 밀도 구배 초 원심 분리는 (- 1.19 g / ㎖ 1.13 사이) 엑소 좀의 특정 밀도를 활용 엑소 분리에 매우 유용한 기술로 남아 있다는 것이다. 잠재적 인 수정이 분야에서 골드 표준이 될 수있는 두 절차의 혼합이다.

가능성은 임상 SAMPL를 처리하는의 RNase 처리와 ES는의 miRNAs 순환의 오염없이 우리에게 순수한 샘플을 부여하고있다. 그러나의 RNase의 존재 엑소 용해 후 exosomal miRNA의 양에 영향을 수 시료 효소. 이러한 이유 때문에, 순환 오염 단백질을 제거하고 효소의 RNase를 저하시키기 위해, 프로 테이나 제 K 처리와 세트를 선택했다.

모든 분리 절차를 표준화하면,이 데이터의 미래 특성화 miRNA의 분석은 초기 진단 중에 비 침습적 방식으로 바이오 마커를 검출 및 추적을 위해 유용한 도구를 형성 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total exosome isolation kit (from plasma)  Invitrogen 4484450 Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9) Cell Signaling 2171S
TSG-101 Antibody (C-2) SantaCruz Biotecnology SC-7964 
Anti-Mouse HRP 1 ml   Cell Signaling 7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50 GE HealthCare 25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Life Technologies 4440043

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References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

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Giallombardo, M., Chacártegui… More

Giallombardo, M., Chacártegui Borrás, J., Castiglia, M., Van Der Steen, N., Mertens, I., Pauwels, P., Peeters, M., Rolfo, C. Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool. J. Vis. Exp. (111), e53900, doi:10.3791/53900 (2016).

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