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Exosomal Análise miRNA em não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) dos pacientes Plasma Através qPCR: Um Líquido Biópsia ferramenta viável

Published: May 27, 2016 doi: 10.3791/53900
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*1,2, *2,3, 4, 3, 5,6, 7,3, 8,3, 2,3
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)
* These authors contributed equally

Introduction

A baixa taxa de sobrevivência em NSCLC (cancro do pulmão de células não pequenas) pacientes é devido principalmente à eficácia limitada dos tratamentos na doença avançada e pobres detecção precoce 1. Mutações de activação no gene de EGFR, que foram descobertos numa subpopulação de doentes com NSCLC, são conhecidos para conferir sensibilidade a tirosina cinase (TKI inibidores). Infelizmente, a maioria dos doentes com NSCLC EGFR mutantes desenvolver resistência TKI 2. Especialmente neste contexto, um diagnóstico correcto é obrigatória. Em geral, devido a localização de tumores, a obtenção de tecidos de biopsia em NSCLC nem sempre é viável. Portanto, vários estudos estão em curso que usa métodos não invasivos para obter estes dados biológicos. Os exossomas são descritos como componentes de biópsia líquidos que poderiam ser investigados de modo a obter valores de diagnóstico e de prognóstico com técnicas não-invasivas 3.

Exossomos são nanovesículas (40-100 nm de diâmetro) de Eorigem ndocytic que são liberadas por diferentes tipos de células, tanto em condições fisiológicas e patológicas 4. Eles podem transportar proteínas, lipídios, mRNA e microRNAs. Além disso, diversos estudos sugerem um papel pleiotrópico de exossomas provenientes de tumores, que podem influenciar o crescimento e a sobrevivência de células de tumor, angiogénese, estromal e remodelação da matriz extracelular e a resistência aos medicamentos 5.

MicroRNAs (miRNAs) são curtos ARN não codificante que estão envolvidos na regulação pós-transcricional, a ligação 3'-UTR dos ARNm alvo e que conduz o ARNm para a degradação ou a um não-tradução 6. separação selectiva dos miRNAs em exossomos tem sido descrita. Neste contexto, foi recentemente demonstrado, in vitro e in vivo, um empacotamento selectivo de miR-21 (um miARN bem conhecido com os efeitos oncogénicos) em exossomas divulgados pela linhas de células de leucemia mielóide crónica, após o tratamento de curcumina 7.

operfil exosomal miARN é semelhante ao perfil de miARN do tumor primário e esta característica pode ser explorada no diagnóstico precoce e prognóstico 3. Especificamente, existe a possibilidade de caracterizar, por PCR em tempo real, miARNs seleccionados correlacionados com o perfil molecular da doença, por ex., Mutações de EGFR, entre outros 8.

Aqui, a análise de um painel seleccionado de NSCLC-correlacionada miARNs 8-9 é descrito que foram isolados a partir de exossomas libertados no sangue de doentes com NSCLC. Após a obtenção do consentimento relatório de informar os pacientes, o plasma de 12 pacientes com NSCLC e 6 controlos saudáveis, foram analisados. O isolamento exossomo foi realizada com o kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Antes de isolamento exossomo, as amostras de plasma foram tratadas com RNase, a fim de degradar contaminantes circulam miARNs. Decidimos realizar esta análise com um kit comercial, devido à padronização limitado de outra techniques (por ex., ultracentrifugação) que é especialmente importante quando se trabalha com amostras clínicas. Este kit inclui um tratamento de proteinase K, que irá degradar o RNAse, e, assim, diminui o risco de degradar miARNs exosomal após lise exossoma. análise MicroRNA foi realizada por Real Time-análise sensível e específico PCR; Mir-1228-3p foi usado como um controle endógeno e os dados foram normalizados de acordo com a fórmula 2 - ΔΔct. Os valores de controlo são utilizados como linha de base e os resultados são mostrados em escala logarítmica.

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Protocol

1. exossomo Isolamento

Nota: O isolamento de exossomas a partir de amostras de plasma, foi realizado com um kit comercial, de acordo com o protocolo do fabricante e por adição de tratamento com RNase: (todos estes passos têm de ser realizados com os equipamentos de protecção pessoal e o ambiente e seguindo o processo legal específica para a manipulação de amostras biológicas ).

  1. Tomar 1 ml de plasma de cada amostra, armazenados a -80 ° C, e colocá-lo em gelo.
  2. Centrifugar a amostra a 2000 × g durante 20 min à temperatura ambiente; esta passagem é obrigatória, a fim de remover as células e detritos.
  3. Transferir o sobrenadante contendo o plasma limpo para um novo tubo de 1,5 mL.
  4. Centrifuga-se o tubo novo a 10000 × g durante 20 min à temperatura ambiente.
  5. Transferir o sobrenadante contendo o plasma limpo para um novo tubo de 1,5 mL.
  6. Adiciona-se 100 ng / ml de ARNase ao sobrenadante e incuba-se o tubo a 37 ° C durante 10 min ema fim de degradar os ARN circulante.
  7. Transferir todo o plasma tratado para um novo tubo de 2 mL e adicionar 0,5 volume de PBS 1x.
  8. Agitar as amostras a fim de misturar as soluções.
  9. Adicionar 0,05 volumes de solução de proteinase K (incluir no kit) para a amostra.
  10. Vortex e, em seguida, a amostra incubar a 37 ° C durante 10 min.
  11. Adicionar 0,2 volume de tampão de precipitação exossomo à amostra e misturar as soluções por inversão.
  12. Incubar a amostra a 2 ° C a 8 ° C durante 30 min e depois centrifugar a amostra a 10000 x g durante 5 min à TA.
  13. Aspirar e desprezar o sobrenadante. O sedimento contem os exossomas isolado.
  14. Adicionar tampão selecionado para o pellet exosome, a fim de voltar a suspender as exossomos. A selecção do tampão depende da análise a jusante previsto, neste caso:
    1. Adicionar 100 ul de 1x PBS, a fim de executar a análise TEM.
    2. Adicionar 346,5 mL de buf lise específicafer para extração de RNA (do kit comercial) (ATENÇÃO: Perigo de química).
    3. Adicionar 100 ul de tampão de lise para a extracção de proteínas (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl a 300 mM - Triton X-100 0,5% - 1 mM de PMSF - Leupeptina / aprotinina 10 ug / ml), a fim de executar a análise Western Blotting. (ATENÇÃO: riscos químicos).
  15. Armazenar os exossomas ressuspensas a -20 ° C.

2. Caracterização exossomo por análise por Western blot

Nota: A fim de caracterizar as nanovesículas isolados, western blot com anticorpos contra ALIX e TSG101 (marcadores exosomal bem conhecidos) é recomendado.

  1. Após ressuspensão do sedimento em tampão de lise exossomo, colocá-lo em gelo durante 1 hora, a fim de dissolver a membrana exosomal.
  2. Centrifuga-se o lisado a 12.000 g durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo, sem perturbar o sedimento.
  3. Quantificar o conten de proteína total exosomalt por Ensaio de Bradford ou outros métodos e carga de 50 ^ g de proteínas por poço em tampão Tris / Glicina SDS - gel de poliacrilamida a 8%. (ATENÇÃO: riscos químicos).
  4. Separaram-se as proteínas (e um marcador de peso molecular apropriado) em electroforese em gel de SDS-PAGE a 8% com tampão de corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS a 0,1%) durante 1 h e 30 min a 120 V. (Cuidado: os riscos químicos ).
  5. Transferir a proteína para uma membrana de nitrocelulose por electrotransferência com tampão C 4 ° transferência de frio (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol a 20%) durante 1 h a constante de 50 V. (CUIDADO: riscos químicos).
  6. Bloquear a membrana durante 1 h em agitação lenta com 5% de leite seco não gordo em 1x TBS Tween 0,1%.
  7. Lava-se a membrana 4 vezes durante 5 minutos em agitação rápida com 1x TBS - Tween 0,1%.
  8. Adicionar os anticorpos primários contra David e TSG101 (por uma membrana) em tampão apropriado (de acordo com o anticorpo folha de dados do fabricante) e incubar a membrana de O / N; Em agitação lenta.
  9. Lava-se a membrana 5 vezes durante 5 min com agitação rápida com 1x TBS - Tween a 0,1%, a fim de remover anticorpo excessiva.
  10. Adicionar o anticorpo secundário adequado em tampão apropriado (de acordo com o anticorpo folha de dados do fabricante) e incuba-se a membrana durante 1 h em agitação lenta.
  11. Lava-se a membrana 5 vezes durante 5 min com agitação rápida com 1x TBS - Tween a 0,1%, a fim de remover anticorpo excessiva.
  12. Detectar a proteína seleccionada por análise de quimioluminescência 11.

3. exossomo caracterização por análise TEM

Nota: Para visualizar os exossomos isolados, foi realizada TEM análise (Transmission Electron Microscopy).

  1. Lugar ~ 10 pg (previamente quantificada por ensaio de Bradford) da amostra de exossomos intacta novamente suspensas em 1x PBS em um filme plástico e colocar a amostra cair uma grade de níquel revestido de carbono formvar durante 1 h.
    2. <li> Lave a grade 3 vezes, posicionando-o em três 40 mL 1x PBS cai.
  2. Lave a grade 5 vezes, posicionando-se em cinco gotas de água ultrapura 30 ul.
  3. Fixar a amostra por adição de uma gota de glutaraldeído a 2,5% (CUIDADO: perigo químico) durante 10 min.
  4. Lava-se a grelha de 3 vezes, posicionando-o em três 40 ul de 1x PBS gotas.
  5. Adicionar uma gota de 2% acetato de uranilo (ATENÇÃO: riscos químicos) e colocar a grade em cima dela durante 15 minutos, a fim de contrastar a amostra.
  6. Incorporar a amostra sobre uma gota de 0,13% de metilcelulose (CUIDADO: riscos químicos) e 0,4% de acetato de uranilo e incubar a grelha por cima da gota durante 10 min.
  7. Suavemente remover o líquido em excesso com um papel absorvente e secar a grelha durante 5 min com o lado revestido para cima.
  8. Examine a rede pela transmissão microscópio eletrônico 12.

4. Exosomal Extração de RNA e quantificação

Nota: Nós decidimos perform a extração de RNA total a partir de amostras exosomal usando um kit comercial, de acordo com o protocolo do fabricante: (ATENÇÃO: riscos químicos, rever o protocolo e as orientações do fabricante).

  1. Após ressuspensão do sedimento exosome em 346,5 mL de tampão de lise, adicionar 3,5 mL de β-mercaptoetanol (ATENÇÃO: riscos químicos) e vortex vigorosamente; esta passagem é obrigatória, a fim de destruir as membranas lipídicas.
  2. Adicionar o lisado para a coluna de lavagem em um tubo de recolha e centrifugar a 11000 x g durante 1 min. Após centrifugação, descartar a coluna e transferir o filtrado para um novo tubo de 1,5 ml de RNase isenta de.
  3. Adicionar 350 mL de 70% de etanol (ATENÇÃO: riscos químicos) e misturar em vortex durante 5 segundos.
  4. Carregar o lisado na coluna de resolução e centrifugar durante 30 segundos a 8000 x g. Após centrifugação, o descartar flowthrough e transferir a coluna para um novo tubo de recolha.
  5. Coloque 350 mL de buffe dessalinizaçãoR e centrifugar a 11000 x g durante 1 min. Após centrifugação, o descartar flowthrough e regresso da coluna para o mesmo tubo de recolha.
  6. Adicionar 95 ul de ADNase I mistura reaccional (10 ul de ADNase I reconstituído + 90 ul de tampão de ADNase, para cada amostra) na membrana de sílica da coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 15 min à temperatura ambiente. (ATENÇÃO: perigo químico)
  7. Adicionar 200 ul de tampão de lavagem (CUIDADO: perigo químico) para a coluna e centrifugar a 11000 x g durante 1 min. Colocar a coluna para um novo tubo de recolha.
  8. Adicionar 600 ul de tampão de lavagem para a coluna e centrifugar a 11000 x g durante 1 min. Após centrifugação, descartar flowthrough e colocar a coluna para o mesmo tubo de recolha.
  9. Adicionar 250 ul de tampão de lavagem para a coluna e centrifugar a 11000 x g durante 2 min. Colocar a coluna para um tubo de ARNase isento de 1,5 ml.
  10. Elui-se o ARN em 40 uL de água sem RNase e centrifugar a 11.000 5; g durante 1 min, de modo a ter uma concentração elevada de ARN neste pequeno volume.
  11. Imediatamente coloque RNA eluído em gelo para evitar potencial de degradação ou armazenar a -80 ° C.
  12. Quantificar o teor de RNA. Nota: Aqui, a quantização RNA foi realizada usando 1 ml de amostra através de espectrofotómetro.

5. Retrotrascription de miRNAs Exosomal

Nota: devido à quantidade limitada de conteúdo miARNs descrito em exossomas, decidiu-se realizar a transcrição reversa de miARNs seleccionados por meio de um kit comercial utilizando um ensaio individual para cada miARN, de acordo com o protocolo do fabricante. Para cada amostra, 8 miARNs correlacionados com o estado NSCLC foram seleccionado (miR-30b; miR-30c; miR-103; miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222 e miR-1228- 3p como controle endógeno).

  1. Prepare a transcrição mistura principal reversa (RT mix). Para cada reacção preparar 7 uL de mistura de RT, tal como descrito emhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (clique aqui para baixar) (ATENÇÃO: Perigo de química).
    Nota: Neste experimento, 9 mix RT diferentes foram preparadas para cada amostra.
  2. Misture delicadamente e armazenar a mistura RT no gelo. Adicionar 7 ul de RT mistura por tubo de reacção.
  3. Adicionar 5 mL de RNA da amostra (10 mg de RNA total) por tubo de reação e misture delicadamente.
  4. Adicione 3 mL de os iniciadores de transcrição reversa 5x (ATENÇÃO: perigo químico) de cada ensaio definido para dentro do tubo de reação correspondente.
  5. Misture lentamente, fechar o tubo e incubar em gelo durante 5 min.
  6. Carregar o tubo de reacção, para dentro do termociclador e iniciar a reacção de transcrição inversa utilizando os seguintes valores de parâmetros (HOLD a 16 ° C durante 30 min, segure a 42 ° C durante 30 min, segure a 85 ° C durante 5 min; fixe ∞ 4 ° C).

6. Tempo real Análise por PCR de Exosomal miRNAs

Nota: Esta análise foirealizada utilizando um kit comercial para a PCR em Tempo Real (qPCR), com três réplicas biológicas e técnicas por amostra.

  1. Para cada reação, prepare-se 17,67 mL de mistura de PCR em Tempo Real (10 ul de PCR Mix Master + 7,67 l de água Nuclease-free), misturá-lo e colocar no gelo. (ATENÇÃO: perigo químico)
  2. Adicionar 1 ml, para cada tubo de PCR, de 20x iniciadores de qPCR (ATENÇÃO: perigo químico).
  3. Coloque 18,67 ul da mistura de qPCR em cada poço de placa.
  4. Adicionar 1,33 mL do produto de transcrição reversa para o correspondente poço de placa.
  5. Feche a placa e girá-lo (300 gx 5 seg).
  6. Insira a placa em um sistema de PCR em tempo real e começar a corrida usando as seguintes condições de PCR: MANTER a 95 ° C durante 10 min; 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 60 segundos a 60 ° C. Processo e normalizar os dados de acordo com a fórmula 2 - ΔΔct 13.

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Representative Results

Um total de 12 de plasma de doentes com NSCLC e 6 controlos saudáveis ​​foram processadas com um kit comercial para o isolamento de exossoma a partir do plasma. Cada amostra foi processada por meio de análise de Western Blot, a fim de avaliar a marcadores exosomal ALIX (96 kDa) e TSG101 (43 kDa). Um exemplo destes resultados é mostrado para as amostras 3 na Figura 1, indicando que o isolamento exossoma a partir de amostras de plasma é possível com este protocolo.

A fim de caracterizar amostras exosomal biofísico, foi realizada análise de TEM. TEM mostraram que os nanovesulas obtidos por este protocolo de isolamento têm um tamanho médio na gama de tamanho exosomal, entre 40-100 nm (Figura 2).

Após o isolamento e caracterização exosome, investigamos o seu conteúdo miRNAs. Foram selecionados 8 miRNAs específicos, conhecidos como deregulated em NSCLC. Como controlo interno, foi utilizado o miR-1228 que tenha sido previamente validado como um controlo endógeno estável e eficaz em diferentes tipos de tumores 10. De acordo com estes resultados de miR-1228 é um controlo fiável e estável endógena. Quando o nível da miARN 8 seleccionado entre dadores saudáveis ​​e de doentes com cancro de pulmão foram comparados expressão, verificou-se que estes são fortemente miARNs desregulado nas amostras clínicas analisadas. Na Figura 3, o padrão das 8 miARNs seleccionados expressão é mostrada numa escala logarítmica para as 12 amostras analisadas (PAD1-12). Nem todos os miARNs eram detectáveis ​​em cada amostra e, devido à quantidade limitada de amostras que não pode realizar a análise estatística.

figura 1
Figura 1. Western Blot Análise em 3 amostras Exosomal para David e TSG101. O Western Blot mostra a presença deos marcadores exosomal bem conhecidas, David e TSG-101, nas amostras analisadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Análise de Amostras TEM Exosomal Estes resultados demonstram que os nanovesículas isoladas têm um diâmetro médio, entre 40 -.. 100 nm, dentro da faixa exosomal Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Expressão perfil de 8 miRNAs selecionados em amostras Exosomal. Estes dados, apresentados na escala logarítmica, demonstram que through este protocolo é viável para ver para cima ou para baixo-regulação dos miRNAs exosomal selecionados de pacientes NSCLC plasmáticos clínicos (PAD1-12), levando a uma potencial descoberta de biomarcadores exosomal de NSCLC. Os dados são mostrados como dobra de expressão relativa aos controles saudáveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Com este protocolo combinado era possível realizar uma análise de miARN exosomal a partir de plasma de doentes com NSCLC. Esses dados podem refletir o estado da doença, mas isso precisa ser confirmado por um estudo mais aprofundado.

O protocolo utilizado neste artigo foi baseado em um kit comercial para o isolamento de exossoma. A razão foi que os outros processos de isolamento conhecidos (por exemplo., A densidade de ultracentrifugação de gradiente) requerem procedimentos mais manual, que conduz a uma normalização limitada. No entanto, uma das limitações do presente protocolo é que, em comparação com a ultracentrifugação em gradiente de densidade para o isolamento exossomo, ultracentrifugação em gradiente de densidade mantém-se uma técnica muito útil no isolamento exossomo que explora a densidade específica de exossomas (entre 1,13-1,19 g / ml). Uma modificação em potencial é uma mistura de ambos os procedimentos, que pode ser um padrão de ouro neste campo.

A possibilidade de processar sampl clínicaes com o tratamento RNase nos deu amostras puras sem contaminação de circulação de miRNAs. No entanto, a presença de enzimas de ARNase nas amostras pode afectar a quantidade de exosomal miARN após lise exossoma. Por esta razão, nós escolhemos um kit de tratamento com proteinase K, a fim de eliminar as proteínas contaminantes circulam e enzimas para degradar RNase.

Após a padronização de todos os procedimentos de isolamento, a caracterização futuro e análise de miRNA destes dados pode formar uma ferramenta útil para detectar biomarcadores de uma forma não-invasiva durante o diagnóstico inicial e de acompanhamento.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total exosome isolation kit (from plasma)  Invitrogen 4484450 Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9) Cell Signaling 2171S
TSG-101 Antibody (C-2) SantaCruz Biotecnology SC-7964 
Anti-Mouse HRP 1 ml   Cell Signaling 7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50 GE HealthCare 25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Life Technologies 4440043

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References

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Giallombardo, M., Chacártegui Borrás, J., Castiglia, M., Van Der Steen, N., Mertens, I., Pauwels, P., Peeters, M., Rolfo, C. Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool. J. Vis. Exp. (111), e53900, doi:10.3791/53900 (2016).

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