Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Intraluminal Drug Delivery till musen arteriovenös fistel endotelet

Published: March 4, 2016 doi: 10.3791/53905

Abstract

Leverans av terapeutiska medel för att förbättra arteriovenös fistel (AVF) mognad kan administreras antingen via intraluminala eller externa linjer. Den enkla murina AVF modell kombinerades med intraluminal administrering av läkemedelslösningen till den venösa endotelet samtidigt som fistel skapelse. Tekniska aspekter av denna modell diskuteras. Under narkos är ett buksnitt görs och aorta och nedre hålvenen (IVC) exponeras. Den infranjur aorta och IVC dissekeras för fastspänning. Efter proximala och distala fastspänning, är punkteringsstället exponerades och en 25 G nål används för att punktera båda väggar aortan och in i IVC. Omedelbart efter det att punktering, var en reportergen-uttryckande virala vektorn infunderas i IVC via samma nål, följt av 15 min inkubation. Intraluminal administreringssätt aktiverat mer robust viral gen leverans till venösa endotelet jämfört med administrering av den externa rutten. denna novel leveranssätt kommer att underlätta studier som undersöker rollen av endotel i AVF mognad och möjliggör intraluminal läkemedelsadministrering vid tidpunkten för kirurgisk operation.

Introduction

Den murina aortovenous fistel (AVF) punktering modell mellan aorta och nedre hålvenen (IVC) är nu en etablerad teknik. 1 I denna modell, både väggar av infranjur aorta punkteras med en 25 G nål, avslutas i angränsande infra-njur hålvenen; den anteriora aorta ingångshål repareras med enkel kompression, och kräver inte att suturen reparation. Serial undersökning med högupplösande Doppler ultraljud och histologisk analys uppföljning visar AVF att ha en mognadsfasen och sedan en sviktande fas, rekapitulera den kända patofysiologi av humant AVF. 2

För att undersöka mekanismerna som modulerar AVF mognad, behövs förbättrade metoder för leverans av terapeutiska medel till den mognande AVF endotel. Avgivning av terapeutiska medel till fartyg kan vara antingen via endovaskulär leverans till lumen, eller med en extern leverans till adventitia. Ett exempel på externa leveranser är commonly används adventitial applicering av Pluronic gel. Denna sampolymer är termoreversibla och omvandlas från flytande till fast gel vid uppvärmning till kroppstemperatur. Tidigare studier har visat ihållande läkemedelstillförsel uppnås när drogen blandas i Pluronic gel appliceras topiskt in vivo. 3,4 adventitial tillämpning av virala vektorer eller siRNA med Pluronic gel har rapporterats vara effektivt som en perivaskulär leveranssystem. 5,6 Vi har också rapporterats att behandling av explanterade humana vena vener med adventitial stimulering med peptider resulterade i fosforylering av endoteliala receptorproteiner. 7

Å andra sidan, har utredarna också intraluminal leverans av både virala och icke-virala vektorer i hund 8-10 och kanin 11,12 modeller av ventransplantat. I dessa rapporter var genöverföring utfördes ex vivo efter ven skörd. Eslami et al. Rapporterade endovaskulär viral gen levereray att Carotid vener in situ utan att skapa en bypass. 13 Gloverman et al. rapporterade intraluminal och adventitial leverans av naket DNA hos råtta lårbensartären-ytliga epigastrisk ven fistlar. 14 Mayo gruppen rapporterade adventitial drug delivery i mus halspulsådern-halsvenen fistlar. 15,16 Dessa tidigare redovisade modeller krävs en sys anastomos att skapa den AVF. I denna rapport intraluminal drug delivery med samtidig AVF skapelse i möss som beskrivs med hjälp av en modell av AVF skapande sutur mindre. Genom att använda denna modifierade murina AVF modell kan utföras en enkel metod för intraluminal läkemedelstillförsel till den venösa delen av fisteln.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkännande av lämpliga Institutional Animal Care och användning kommittén erhålls.

1. Anestesi och Pre-operativa procedurer

  1. Söva C57BL / 6 is, åldern 8 veckor, med förångad 3% isofluran och 0,8 l / min syre administreras till en akryl induktionskammare.
  2. Bekräfta tillräcklig bedövning av bristande reaktion på tå nypa. Placera musen på rygg på operationsbordet och placera en silikonmask att leverera förångas 2-3% isofluran genom kontinuerlig inandning.
  3. Avlägsna ventral hår från halsen till nedre delen av magen med användning av en kemisk hårborttagningskräm.
  4. Utför Doppler ultraljudsundersökning före AVF kirurgi för att spela in baslinjedata för arteriell och venös flöde och kärldiametern på intresseområden. 1,2
  5. Bifoga en 1 ml spruta till en 25 G-nål och ladda sprutan med det önskade läkemedlet. Böj nålen till en 60 graders vinkel ungefär 4 mm från behovetle spets. Ta tag i 25 G-nål med en böjd nål hållare.

2. Operativa procedurer

  1. Förbereda snittet platsen med en topisk antiseptisk och tillämpa en operationslakan. Använd sterila handskar och instrument för att upprätthålla aseptisk teknik genom hela operationen.
  2. Göra en mittlinje buksnitt med en skalpell som sträcker sig från nivån hos den nedre leverkanten till strax ovanför pubis.
  3. Sätt ett upprullningsdon och rensning alla tarmar från bukhålan mot höger sida. Wrap tarmarna i gasväv indränkt med koksaltlösning. Dissekera membranet förbinder retro bukhinnan och lägre kolon för att erhålla fullständig bild av aortan och IVC.
  4. Dissekera infranjur aorta och IVC från omgivande vävnader, förbereder sig för proximala och distala kläm.
  5. Placera en enda mikro klipp över både den proximala aorta och den proximala IVC vid nivån strax under vänstra njur ven. Placera en andra mikro klipp över både distal aorta och distala IVC.
  6. Ta tag i bindväven som omger aortan och rotera medialt så att den dorsala ytan av aorta är något exponeras för det arteriella punktions, såsom beskrivits tidigare. 1
  7. Snabbt exponera injektionsstället. Injektionsstället kommer att vara på den bakre aspekten av fartygen, ungefär tre fjärdedelar av avståndet från den vänstra njur ven till aortabifurkationen. Att hålla aorta i en roterad position med vänster hand, dissekera den vänstra sidomarginal aorta så att det finns gott om exponering för att möjliggöra punktering med höger hand. Var noga med att inte dissekera mellan aortan och IVC.
  8. Bibehålla aorta i en roterad position och punktera aorta igenom i IVC med hjälp av en 25 G-nål med en bifogad 1 ml spruta innehållande läkemedelslösning. (Figur 1 A)
  9. Ingjuta läkemedelslösningen (100-200 | il) med användning av den vänstra handen. Nålen kan ses genom utvidgade och tunnaIVC väggen när den transparenta läkemedelslösningen förskjuter venöst blod ut från IVC (Figur 1B, C). Förbli stilla och bibehålla nålen i läge för 15 min.
  10. Ta bort den bortre mikro klippet de-klämma endast distala aorta och distala IVC.
  11. Ta bort nålen och sedan täcka punkteringsstället aorta genom att dra upp intilliggande retro-peritoneal vävnad.
  12. Ta bort den proximala mikro klippet de-klämma den proximala aorta och den proximala IVC. Vid de-kläm är artärblod observeras strömmar in IVC i stället för mörka venösa blodflödet. Hålla täcker punktionshålet i 1 min.
  13. Efter bekräftelse av hemostas genom observation under 30 sekunder utan komprimering, åter tarmarna i sin naturliga position och stänga buken med en löpande sutur enligt din godkända djur protokollet.

3. Post-operativa procedurer

  1. Efter stängningen av buken, avbryta Anesthesia. Applicera postoperativ vård inklusive smärtlindring och sårvård i enlighet med instruktioner som rekommenderas av Institutional Animal Care och användning kommittén. För analgesi använder vi buprenorfin vid 0,1 mg / kg intrasmuscularly varje 12 h under 24 h efter det kirurgiska procedurer.
  2. På den första dagen efter operationen, utföra Doppler ultraljud för att bekräfta öppenhet i AVF. Dessutom mäter annat fartyg och flödesegenskaper i serie och jämföra förändringar från preoperativa utgångsvärden. 1,2

Figur 1
Figur 1. (A) Operativ fotovisning Intraluminal leverans under AVF kirurgi. Kläm fast proximala och distala aorta, liksom IVC genom att applicera mikrokirurgiska klämmor. Punktera aorta igenom i IVC med hjälp av en 25 G-nål med tillhörande spruta innehållande läkemedelslösning. (B) En Highennes Ström Bild (4X förstoring) av den punkterade IVC före infusion. Nålspetsen skyms av mörkt färgade venöst blod. Gula pilspetsar betecknar vägg till vägg diameter IVC. (C) en högre makt Bild (4X förstoring) av den punkterade IVC efter Infusion. Nålspetsen (svart pil) kan ses genom försiktigt utspänd och tunn IVC vägg (gula pilar) som den transparenta läkemedelslösningen förskjuter venöst blod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en serie av 33 möss, överlevnad på den första postoperativa dagen var 97,0%; AVF öppenhet, som bestäms av ultraljud, var 84,9%.

Gentransduktion effektiviteten i denna endovaskulära leveransrutt med den traditionella yttre vägen jämfördes. För intraluminär införsel (ILD), omedelbart efter punkteringen, 200 pl adenovirus-GFP (Ad-GFP) vektor-lösning (1 x 10 9 PFU / ml) infunderades i IVC via punkteringsnålen, följt av 15 min inkubationstid . Kontrollmöss fick adventitial leverans (AD) av Ad-GFP (1 x 10 9 PFU / ml) till IVC med användning Pluronic gel. Prover explanterades vid 24 h efter exponering för adenovirusvektorer. Uttryck av GFP vid IVC väggen och fisteln bedömdes genom en-face observationen från intiman genom fluorescensmikroskopi, samt histologisk undersökning i sektioner med hjälp av en anti-GFPantikropp.

En face observation visade starkare uttryck av GFP i IVC väggen i de möss som behandlats med ILD jämfört med AD, med karakteristisk augmentation runt fisteln vid 24 h (figur 2A). GFP-uttryck var ihållande i båda grupperna vid 72 h efter transfektion (data visas ej). Histologisk analys med anti-GFP-antikropp visade mer robust och platsspecifik GFP uttryck i intima av IVC i möss som behandlats med ILD jämfört med AD. (Figur 2B). För att bekräfta dessa resultat var infranjur IVCs behandlade med adenovirus-GFP från AD eller ILD skördas för Western blot. GFP proteinuttryck var tillräcklig för detektion endast efter ILD, vilket tyder på överlägsen viral drug delivery till IVC väggen via intraluminal vägen vid 24 timmar efter transfektion.

figur 2
Figur 2. Leverans av adenovirus-GFP till AVF Lumen Förbättrar GFP uttryck. (A) Representativa immunfluorescens som visar en face vy av AVF endotelet (24 tim) i möss som fick adenovirus-GFP appliceras genom adventitial leverans (överst) eller genom intraluminal leverans (botten). Stapel anger 25 um. (B) representant immunofluorescens visar delar av AVF endotel (24 tim) hos möss som fick adenovirus-GFP tillämpas av adventitial leverans (överst) eller genom intraluminal leverans (botten). * Betecknar lumen IVC; stapel anger 25 um. (C) representant Western blöt som visar detektion av GFP i AVF behandlades med adenovirus-GFP appliceras via adventitia eller intraluminal väg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna modifiering av den murina AVF modellen inkorporerar intraluminal läkemedelstillförsel till den venösa endotelet vid tidpunkten för AVF skapelse. En AVF skapades genom att punktera den infrarenal aorta med en 25 G-nål och förlängning av punktering genom den motsatta aortaväggen i IVC, följt av injektion av läkemedelslösning genom samma nål. Lösningen hålles intra-caval, dvs., I den venösa delen av AVF, tills de-fastspänning. Vad som skiljer denna modell från andra murina AVF modeller 17-19 är bristen på suturer eller lim som kan orsaka stenos, akut trombos, och eventuella störningar med molekylär analys. Möjligheten att använda samma nål som punkterar aorta och IVC att skapa AVF också leverera läkemedel till AVF lumen medger enklare leverans med minimal fartyg manipulation.

Det finns några viktiga steg och punkter för att förbättra andelen framgångsrika och konsekvens av förfarandet. proximal klämma av aorta och IVC är placerad under den vänstra njurvenen. Om det finns stora lumbala vener i den övre delen av det infra renala IVC, därefter modifiering av kläm webbplats till under dessa fartyg rekommenderas att möjliggöra en effektiv inkubation av läkemedlet utan utspädning genom retrograd back-blödning från lumbala vener. Den distala klämman i aorta och IVC är placerad vid nivån för höftbifurkationen, så att det kan störa den nålstick av den distala aortan och IVC. Håll 25 G-nål med en böjd nål hållare möjliggör optimal riktning av nålen under punkterade kärl. Hemostas uppnås genom att täcka den arteriella ingångshål med intilliggande retro-bukhinnan. Är ägnat särskild uppmärksamhet för att ge noggrann kompression samtidigt undvika AVF ocklusion och trombos som beskrivits tidigare. 1

Utvecklingen av genöverföring teknik ger möjlighet att modifiera operationsresultat på molekylär nivå. Rapporter som beskriver itraluminal genleverans till en ven har främst fokuserat på målinriktad behandling av ven transplantat misslyckande. Däremot medger läkemedelstillförsel för modulering av AVF mognad denna modell. Fördelar med denna modell innefattar användning av en murin modell, som ger undersökning av varierande mus genetiska stammar. Dessutom är lätt att överföra till kliniska intraoperativa inställningar 15 min intraluminal exponering protokoll och kan hjälpa till att bedöma peri-procedur insatser för att förhindra juxta-anastomotisk stenos som vanligtvis försvårar människors AVF kirurgi. Från dessa inledande resultat visar vi att denna metod ger mer platsspecifik genexpression inom endotelet jämfört med de traditionella externa rutten.

En potentiell begränsning av denna studie är effekten av varierande buk tryck på IVC. Isolering av IVC segmentet är inte perfekt i denna musmodell, dvs., Var sidogrenar (ländryggen vener) inte ligeras. Därför är det svårt att exakt maintain en jämn buk tryck under inkubation. Även IVC försiktigt utspänd genom manuell infusion, kan högre distending tryck orsaka neointimal hyperplasi 20,21 och direkt glatta muskelceller skada, 11 som leder till störningar i analysen. Det är också svårt att fullständigt kvantifiera effektiviteten av läkemedelstillförsel, eftersom vissa läkemedel kan gå förlorad under leveransen genom de lumbala vener, liksom efter kläm avlägsnande genom den proximala IVC och potentiellt genom AVF i aorta. Slutligen ger denna metod en del av drogen att släppas systemiskt efter klämma bort; evakuering av läkemedlet och spolning av webbplats kan förhindra systemisk release, men kvantifiering av graden av läkemedels washout skulle behöva bekräftas.

Sammanfattningsvis är relativt enkel och reproducerbar denna tekniska ändring av mus AVF modellen och möjliggör riktade endotel läkemedelstillförsel till musen AVF. intraluminal iprojicerings vid tidpunkten för AVF skapelse är tekniskt genomförbart och framgångsrikt kan förbättra viral genuttryck i endotel jämfört med adventitial leverans. Detta AVF-läkemedel leveransmodell kommer att bli en användbar modalitet inte bara för dissekering av de mekanismer som reglerar venös AVF lem mognad, men också för terapeutisk modulering av AVF mognad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G Used as 30% solution in d-water
GFP antibody NOVUS BIOLOGICALS INC NB100-1770
Ad-CMV-GFP VECTOR BIOLABS 1060
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP Baxter 2F7122
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 BD 305122
BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip BD 309659
Scalpel Surgical Design Inc 22079707
6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting ETHICON INC 697G
Vevo 770 ultrasound machine  Visualsonics  20 - 60 Mhz scan head; RMV-704
Vascular clamp  Roboz Surgical Instrument Co. RS-5424
Clamp applying forceps  Roboz Surgical Instrument Co. RS-5410

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamamoto, K., Li, X., Shu, C., Miyata, T., Dardik, A. Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula. J. Vis. Exp. (77), e50449 (2013).
  2. Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. Am. J. Physiol.: Heart Circ. Physiol. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
  3. Escobar-Chávez, J. J., Lòpez-Cervantes, M., Naïk, A., Kalia, Y. N., Quintanar-Guerrero, D., Ganem-Quintanar, A. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Pharm. Sci. 9 (3), 339-358 (2006).
  4. Almeida, H., Amaral, M. H., Lobão, P., Lobo, J. M. S. Pluronic® F-127 and Pluronic Lecithin Organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 15 (4), 592-605 (2012).
  5. Karper, J. C., et al. Toll-like receptor 4 is involved in human and mouse vein graft remodeling, and local gene silencing reduces vein graft disease in hypercholesterolemic APOE*3Leiden mice. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 31 (5), 1033-1040 (2011).
  6. Redmond, E. M., Hamm, K., Cullen, J. P., Hatch, E., Cahill, P. A., Morrow, D. Inhibition of patched-1 prevents injury-induced neointimal hyperplasia. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 33 (8), 1960-1964 (2013).
  7. Wong, D. J., et al. Ephrin type-B receptor 4 activation reduces neointimal hyperplasia in human saphenous vein in vitro. J. Vasc. Surg. , (2014).
  8. Matsumoto, T., et al. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J. Vasc. Surg. 27 (1), 135-144 (1998).
  9. Petrofski, J. A., et al. Gene delivery to aortocoronary saphenous vein grafts in a large animal model of intimal hyperplasia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127 (1), 27-33 (2004).
  10. Hata, J. A., et al. Modulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129 (6), 1405-1413 (2005).
  11. Ohta, S., et al. Intraluminal gene transfer of endothelial cell-nitric oxide synthase suppresses intimal hyperplasia of vein grafts in cholesterol-fed rabbit: a limited biological effect as a result of the loss of medial smooth muscle cells. Surg. 131 (6), 644-653 (2002).
  12. Baldwin, Z. K., et al. Modulation of vascular remodeling induced by a brief intraluminal exposure to the recombinant R7020 strain of Herpes simplex-1. J. Vasc. Surg. 41 (1), 115-121 (2005).
  13. Eslami, M. H., et al. Gene delivery to in situ veins: differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors. J. Vasc. Surg. 31 (6), 1149-1159 (2000).
  14. Globerman, A. S., et al. Efficient transgene expression from naked DNA delivered into an arterio-venous fistula model for kidney dialysis. J. Gene Med. 13 (11), 611-621 (2011).
  15. Yang, B., et al. Adventitial transduction of lentivirus-shRNA-VEGF-A in arteriovenous fistula reduces venous stenosis formation. Kidney Int. 85 (2), 289-306 (2014).
  16. Brahmbhatt, A., et al. The role of Iex-1 in the pathogenesis of venous neointimal hyperplasia associated with hemodialysis arteriovenous fistula. PLoS ONE. 9 (7), e102542 (2014).
  17. Karram, T., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. J. Investig. Surg. 18 (6), 325-334 (2005).
  18. Perry, G. J., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circ. 103 (7), 1012-1016 (2001).
  19. Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. J. Surg. Res. 108 (1), 112-121 (2002).
  20. Alexander, J. H., et al. Efficacy and safety of edifoligide, an E2F transcription factor decoy, for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery: PREVENT IV: a randomized controlled trial. JAMA. 294 (19), 2446-2454 (2005).
  21. Khaleel, M. S., et al. High-pressure distention of the saphenous vein during preparation results in increased markers of inflammation: a potential mechanism for graft failure. Ann. thorac. surg. 93 (2), 552-558 (2012).

Tags

Medicin vaskulär biologi medicin arteriovenös fistel aorta nedre hålvenen aorta-caval fistel mus djurmodell drug delivery kirurgiska tekniker
Intraluminal Drug Delivery till musen arteriovenös fistel endotelet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hashimoto, T., Yamamoto, K., Foster, More

Hashimoto, T., Yamamoto, K., Foster, T., Bai, H., Shigematsu, K., Dardik, A. Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium. J. Vis. Exp. (109), e53905, doi:10.3791/53905 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter