Abstract
La délivrance d'agents thérapeutiques pour améliorer la fistule artério-veineuse (FAV), la maturation peut être administré par des voies intraluminaux ou externes. Le modèle simple FAV murin a été combinée avec l'administration intraluminale de solution de médicament à l'endothélium veineux en même temps que la création de la fistule. Les aspects techniques de ce modèle sont discutées. Sous anesthésie générale, une incision abdominale est réalisée et l'aorte et la veine cave inférieure (VCI) sont exposés. L'aorte infra-rénale et IVC sont disséqués pour le serrage. Après serrage proximale et distale, le site de ponction est exposée et une aiguille G 25 est utilisé pour percer les parois de l'aorte et dans la veine cave inférieure. Immédiatement après la ponction, un gène exprimant journaliste vecteur viral a été perfusé dans la VCI par la même aiguille, suivi de 15 min d'incubation. Le procédé d'administration virale livraison intraluminale activée plus robuste du gène à l'endothélium veineux par rapport à l'administration par voie externe. Cette novel méthode de livraison facilitera les études qui explorent le rôle de l'endothélium dans FAV maturation et permettent l'administration de médicaments intraluminal au moment de l'intervention chirurgicale.
Introduction
La fistule aortovenous murin (FAV) modèle de ponction entre l'aorte et la veine cave inférieure (VCI) est maintenant une technique bien établie. 1 Dans ce modèle, les deux parois de l'aorte sous-rénale sont perforés avec une aiguille G 25, en sortant dans la attenante infra-rénale de la veine cave; le trou d'entrée aortique antérieure est réparé avec la compression simple, et ne nécessite pas de suture réparation. Serial suivi examen par haute résolution échographie Doppler et l' analyse histologique montre la FAV d'avoir une phase de maturation, puis une phase défaillante, récapitulant la physiopathologie connue de FAV humaine. 2
Pour explorer les mécanismes qui modulent FAV maturation, des méthodes améliorées pour l'administration d'agents thérapeutiques à l'endothélium FAV maturation sont nécessaires. La délivrance d'agents thérapeutiques à des récipients peut être remise par l'intermédiaire endovasculaire à la lumière ou par livraison externe à l'adventice. Un exemple de livraison externe est la comcouramment utilisé l'application adventice de gel Pluronic. Ce copolymère est thermoréversible et transformé de l'état liquide à un gel solide lorsqu'elle est chauffée à la température du corps. Délivrance de médicament prolongée d' études antérieures ont montré est obtenu lorsque médicament mélangé dans un gel Pluronic est appliqué par voie topique in vivo. 3,4 adventiciel demande de vecteurs viraux ou d' ARNsi avec un gel Pluronic a été rapporté pour être efficace en tant que système de délivrance périvasculaire 5,6 . Nous ont également rapporté que le traitement des explantées veines saphènes humaines avec la stimulation adventice par des peptides conduit à la phosphorylation des protéines réceptrices endothéliales. 7
D'un autre côté, les chercheurs ont également utilisé la livraison intraluminale de deux vecteurs viraux et non viraux dans la canine 10/08 et de lapin 11,12 modèles de greffons veineux. Dans ces rapports, le transfert de gènes a été réalisée ex vivo après veine récolte. Eslami et al. Rapporté gène viral endovasculaire livrery à la carotide veines in situ sans créer une dérivation. 13 Gloverman et al. rapporté intraluminale et adventice d'ADN nu chez le rat fémoral épigastrique fistules veine artère superficielle. 14 Le groupe Mayo a rapporté l' administration de médicaments adventice dans la carotide de souris artère-veine jugulaire fistules. 15,16 Cependant, ces modèles signalés précédemment requis une anastomose suturée pour créer la FAV. Dans ce rapport, l'administration de médicaments intraluminal avec simultanée création FAV chez la souris est décrite, en utilisant un modèle de création FAV suture moins. En utilisant ce modèle murin modifié FAV un procédé simple pour la délivrance de médicament intraluminal à la branche veineuse de la fistule peut être effectuée.
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Protocol
Approbation par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle animale appropriée est obtenue.
1. Anesthésie et procédures pré-opératoires
- Anesthetize mâle C57BL / 6 de la glace, âgé de 8 semaines, avec vaporisé 3% d'isoflurane et de 0,8 L / min d'oxygène administré dans une chambre d'induction acrylique.
- Confirmer une anesthésie adéquate par le manque de réaction au pincement de l'orteil. Positionner la supination de la souris sur la table d'opération et de positionner un masque de silicone pour fournir vaporisé 2 - 3% d'isoflurane par inhalation continue.
- Enlever les poils ventrale du cou au bas de l'abdomen en utilisant une crème dépilatoire chimique.
- Effectuer échographie Doppler avant la chirurgie FAV pour enregistrer les caractéristiques de base de artérielle et la circulation veineuse et le diamètre du vaisseau au niveau des zones d'intérêt. 1,2
- Fixer une seringue de 1 ml à une aiguille G 25 et de charger la seringue avec du médicament souhaité. Plier l'aiguille à un angle de 60 degrés environ 4 mm de la nécessitéle pourboire. Saisir l'aiguille 25 G avec un porte-aiguille courbe.
2. Procédures opératoires
- Préparer le site d'incision avec un antiseptique topique et appliquer un champ opératoire. Utiliser des gants et des instruments stériles pour maintenir une technique aseptique pendant la chirurgie.
- Faire une incision abdominale médiane avec un scalpel étendant à partir du niveau du bord inférieur du foie juste au-dessus du pubis.
- Insérez un écarteur et éviscérer tous les entrailles de la cavité abdominale vers le côté droit. Envelopper les entrailles de gaze imbibée de solution saline. Disséquer la membrane reliant le rétro-péritoine et inférieure du côlon pour obtenir la vue de l'aorte et IVC.
- Disséquer l'aorte sous-rénale et IVC à partir des tissus environnants, la préparation proximale et distale de serrage.
- Placez un clip microchirurgie unique à travers à la fois l'aorte proximale et proximale IVC au niveau juste en dessous de la veine rénale gauche. Placer un second clip de microchirurgie à travers à la fois le daorte istal et l'IVC distale.
- Saisir le tissu conjonctif entourant l'aorte et une rotation médiale de sorte que la surface dorsale de l'aorte est légèrement exposée pour la ponction artérielle, comme décrit précédemment. 1
- exposer rapidement le site de ponction. Le site de ponction sera à la partie caudale des navires, environ les trois quarts de la distance de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique. Garder l'aorte dans une position de rotation de la main gauche, disséquer la marge latérale gauche de l'aorte afin qu'il y ait suffisamment d'exposition pour permettre une ponction avec la main droite. Veillez à ne pas disséquer entre l'aorte et la veine cave inférieure.
- Maintenir l'aorte dans une position de rotation et à la perforation de l'aorte à travers dans la VCI en utilisant une aiguille G 25 avec une solution contenant de la drogue 1 ml de seringue fixée. (Figure 1A)
- Infuser la solution de médicament (100 - 200 pi) en utilisant la main gauche. L'aiguille peut être vu à travers le dilatée et minceCBF paroi transparente lorsque la solution médicamenteuse déplace le sang veineux de la veine cave inférieure (figure 1B, C). Rester immobile et maintenir l'aiguille en position pendant 15 min.
- Retirez le clip de microchirurgie distale de-clamp seulement l'aorte distale et l'IVC distale.
- Retirez l'aiguille puis recouvrir le site de ponction de l'aorte en tirant le tissu rétro-péritonéale adjacent.
- Retirez le clip de microchirurgie proximale de-serrer l'aorte proximale et proximale IVC. Lors de-serrage, le sang artériel est observée coule dans la VCI au lieu de sombre flux sanguin veineux. Maintenir recouvrant le trou de perforation pendant 1 min.
- Après confirmation de l'hémostase par l'observation pendant 30 s sans compression, retourner les entrailles dans leur position naturelle et fermer l'abdomen avec un surjet selon votre protocole animal approuvé.
Procédures 3. post-opératoires
- Après la fermeture de l'abdomen, cesser anesthesia. Appliquer les soins post-opératoires, y compris l'analgésie et les soins des plaies, conformément aux instructions recommandées par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels. Pour l'analgésie, nous utilisons la buprénorphine à 0,1 mg / kg intrasmuscularly toutes les 12 heures pendant 24 heures suivant les procédures chirurgicales.
- Le premier jour après l'opération, effectuer l'échographie Doppler pour confirmer la perméabilité de la FAV. En outre, la mesure autre navire et les caractéristiques d' écoulement en série et comparer les changements de valeurs de base pré-opératoires. 1,2
Figure 1. (A) photo Operative Affichage intraluminale Livraison lors de la chirurgie FAV. Serrer les extrémités proximale et distale de l'aorte, ainsi que la veine cave inférieure par l'application d'agrafes de microchirurgie. Piquer l'aorte à travers dans la VCI en utilisant une aiguille de 25 G à une seringue contenant la solution de médicament. (B) A Higson image de puissance (4X de grossissement) du Punctured IVC avant perfusion. La pointe de l'aiguille est obscurcie par le sang veineux de couleur sombre. Flèches jaunes indiquent le diamètre mur-à-mur de la VCI. (C) A Higher Power Image (grossissement 4X) du Punctured IVC après perfusion. La pointe de l'aiguille (flèche noire) peut être vu à travers la paroi IVC doucement distendu et mince (flèches jaunes) comme la solution transparente de la drogue déplace le sang veineux.
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Representative Results
Dans une série de 33 souris, la survie sur le premier jour post-opératoire était de 97,0%; AVF perméabilité, tel que déterminé par échographie, était de 84,9%.
Gene transduction efficacité de cette voie de livraison endovasculaire avec la voie extérieure traditionnelle a été comparée. Pour la livraison intraluminale (ILD), immédiatement après la ponction, 200 pi de Adenovirus-GFP (GFP Ad) vecteur solution (1 x 10 9 PFU / ml) a été perfusé dans la veine cave inférieure par l' intermédiaire de l'aiguille de ponction, suivi par 15 min d'incubation , . Les souris témoins ont reçu la livraison adventice (AD) de Ad-GFP (1 × 10 9 PFU / ml) à l'IVC en utilisant du gel Pluronic. Les spécimens ont été explantées à 24 h après une exposition à des vecteurs adénoviraux. Expression de la GFP à la paroi IVC et la fistule a été évaluée par l'observation en face de l'intima par microscopie à fluorescence, ainsi que l'examen histologique dans les sections en utilisant un anti-GFPanticorps.
En observation du visage a montré une expression plus forte de la GFP dans la paroi IVC chez les souris traitées avec ILD par rapport à AD, avec une augmentation caractéristique autour de la fistule à 24 h (figure 2A). expression de la GFP a persisté dans les deux groupes à 72 h après la transfection (données non présentées). L'analyse histologique avec un anticorps anti-GFP a montré une expression plus robuste et spécifique au site GFP dans l'intima de la VCI chez les souris traitées avec ILD par rapport à AD. (Figure 2B). Pour confirmer ces résultats, IVC infra-rénale traités par adénovirus-GFP par AD ou ILD ont été récoltés pour le Western Blot. expression de la protéine GFP a été suffisante pour la détection uniquement après ILD, ce qui suggère l'administration de médicaments virale supérieure à la paroi IVC par voie intraluminale à 24 h après la transfection.
Figure 2. Livraison de Adenovirus-GFP à la FAV Lumen Améliore GFP Expression. (A) immunofluorescence montrant représentant en vue de face de l'endothélium FAV (24 h) chez les souris recevant l' adénovirus-GFP appliquée par la livraison adventice (en haut) ou par la livraison intraluminale (en bas). Bar indique 25 um. (B) immunofluorescence Représentant montrant des sections de l'endothélium FAV (24 h) chez les souris recevant l' adénovirus-GFP appliquée par la livraison adventice (en haut) ou par la livraison intraluminale (en bas). * Indique lumen de la VCI; barre indique 25 um. (C) Western blot représentatif montrant la détection de la GFP dans FAV traitées avec l' adénovirus-GFP appliqué par l'adventice ou de la voie intraluminale.
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Discussion
Cette modification du modèle murin FAV incorpore l'administration de médicaments intraluminale à l'endothélium veineux, au moment de la création FAV. Une FAV a été réalisé par ponction de l'aorte sous-rénale avec une aiguille G 25 et se prolongeant à travers la perforation de la paroi aortique opposée dans la veine cave inférieure, suivie par l'injection de la solution médicamenteuse par la même aiguille. La solution est maintenue intra-caval, ie., Dans la branche veineuse FAV, jusqu'à ce que de-serrage. Ce qui distingue ce modèle des autres modèles murins FAV 17-19 est le manque de sutures ou des colles qui peuvent causer une sténose, thrombose aiguë, et les interférences possibles avec l' analyse moléculaire. La possibilité d'utiliser la même aiguille qui perfore l'aorte et IVC pour créer la FAV pour fournir également des médicaments à la lumière FAV permet la livraison plus simple avec la manipulation du vaisseau minimal.
Il y a quelques étapes et des points critiques pour améliorer le taux de réussite et la cohérence de la procédure. Le proximal serrage de l'aorte et VCI est placé sous la veine rénale gauche. S'il y a de grandes veines lombaires dans la partie supérieure de la sous-rénale IVC, puis la modification du site de serrage au-dessous de ces navires est recommandé pour permettre une incubation efficace de médicament sans dilution par rétrograde back-saignement des veines lombaires. La pince distale de l'aorte et IVC est placé au niveau de la bifurcation iliaque, de peur qu'il ne peut interférer avec la ponction de l'aorte distale et IVC. Tenir l'aiguille 25 G avec un porte-aiguille courbe permet direction optimale de l'aiguille lors de ponction vasculaire. Hémostase est obtenue en recouvrant le trou d'entrée artérielle avec le rétro péritoine adjacent. Une attention particulière est accordée à fournir une compression attention tout en évitant l' occlusion FAV et la thrombose comme décrit précédemment. 1
Le développement de la technologie de transfert de gènes offre la possibilité de modifier les résultats chirurgicaux au niveau moléculaire. Les rapports décrivant enla livraison de gènes traluminal à une veine ont principalement porté sur le traitement ciblé de l'échec de la greffe de veine. En revanche, ce modèle permet l'administration de médicaments pour la modulation de la maturation FAV. Les avantages de ce modèle comprennent l'utilisation d'un modèle murin permettant l'examen de la variation génétique des souches de souris. En outre, un protocole d'exposition intraluminal 15 min est facilement transférable aux paramètres intra-opératoires cliniques et peut aider à évaluer les interventions péri-procédurale pour empêcher juxta-anastomotique sténose qui complique souvent la chirurgie FAV humaine. A partir de ces résultats initiaux, on montre que cette méthode donne de plus l'expression du gène spécifique du site au sein de l'endothélium par rapport à la voie externe traditionnel.
Une limitation potentielle de cette étude est l'effet de la pression de distension variable sur la VCI. L' isolement du segment CBF est pas parfaite dans ce modèle de souris, à savoir., Les branches latérales (veines lombaires) ne sont pas ligaturés. Par conséquent, il est difficile de précision maintain un niveau de pression de distension pendant l'incubation. Bien que l'IVC est doucement distendu par perfusion manuelle, les pressions distension plus élevées peuvent provoquer une hyperplasie néointimale 20,21 et des dommages aux cellules du muscle lisse directe, 11 conduisant à une ingérence dans l' analyse. Il est également difficile de quantifier complètement l'efficacité de l'administration de médicaments, car certains médicaments peuvent être perdues pendant la délivrance à travers les veines lombaires, ainsi qu'après enlèvement de serrage à travers la veine cave inférieure proximale et éventuellement par la FAV dans l'aorte. Enfin, ce procédé permet une partie du médicament qui doit être libéré de manière systémique après le retrait de serrage; évacuation de la drogue et le rinçage du site pourrait empêcher la libération systémique, mais la quantification du degré de médicament lavage devrait être confirmée.
En conclusion, cette modification technique au modèle murin FAV est relativement simple et reproductible et permet l'administration de médicaments endothéliale à la FAV de la souris ciblée. intraluminale dansjection au moment de la création FAV est techniquement réalisable et peut réussir à améliorer l'expression des gènes viraux dans l'endothélium par rapport à la livraison adventice. Ce modèle de prestation FAV-médicament sera une modalité utile non seulement pour la dissection des mécanismes qui régulent veineuse FAV membre maturation, mais aussi pour la modulation thérapeutique de FAV maturation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
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