Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Intraluminal Drug Delivery til Mouse arteriovenøs fistel endotelet

Published: March 4, 2016 doi: 10.3791/53905

Abstract

Levering av terapeutiske midler for å forbedre arteriovenøs fistel (AVF) modning kan administreres enten via intraluminale eller ytre ruter. Den enkle murine AVF modell ble kombinert med intraluminal administrering av medikamentløsning til vene endotelet samtidig som fistula oppretting. Tekniske aspektene ved denne modellen er diskutert. Under generell anestesi, er en abdominal snitt gjort og aorta og vena cava inferior (IVC) er utsatt. Den infra-renal aorta og IVC er dissekert for klemming. Etter proksimale og distale klem, er stikkstedet eksponert og en 25 G nål brukes til å punktere begge veggene i aorta og inn i IVC. Umiddelbart etter punktering, var en reporter gen-uttrykke viral vektor tilført i IVC via samme nål, etterfulgt av 15 min inkubasjon. Den intraluminal administrasjon metoden aktivert mer robust viral genet levering til vene endotelet i forhold til administrasjon av den eksterne ruten. dette novel metode for levering vil legge til rette for studier som utforsker rolle endotelet i AVF modning og gjør intraluminal levering av legemidler ved kirurgisk operasjon.

Introduction

Den murine aortovenous fistel (AVF) punktering modell mellom aorta og vena cava inferior (IVC) er nå en etablert teknikk. 1 I denne modellen, både vegger av infra-nyre aorta er punktert med en 25 G nål, avslutter inn i tilstøtende infra-renal vena cava; den fremre aorta inngangshullet er reparert med enkel kompresjon, og krever ikke sutur reparasjon. Serie oppfølgningen av høyoppløselig Doppler ultralyd og histologiske analyser viser AVF å ha en modningsfase og deretter en sviktende fase, rekapitulere den kjente patofysiologien av menneskelig AVF. 2

Å utforske mekanismer som modulerer AVF modning, er forbedrede metoder for levering av terapeutiske midler til modning AVF endotelet nødvendig. Levering av terapeutiske midler for å fartøy kan være enten via endovaskulær levering til lumen, eller via ekstern levering til adventitia. Et eksempel på ekstern levering er comvanlig benyttes adventitia anvendelse av Pluronic gel. Denne kopolymer er termo-reverserbar og omdannet fra flytende til fast gel når det oppvarmes til kroppstemperatur. Tidligere studier har vist vedvarende medikamentavgivelse oppnås når stoffet blandes i Pluronic gel påføres topisk in vivo. 3,4 adventitia anvendelse av virale vektorer eller siRNA med Pluronic gelen har blitt rapportert å være effektiv som et perivaskulær leveringssystem. 5,6 Vi har også rapportert at behandling av eksplanterte humane saphenous vener med adventitia stimulering av peptider førte til fosforylering av endotel-reseptorproteiner. 7

På den annen side, har forskere også brukt intraluminal levering av både virale og ikke-virale vektorer i canine 8-10 og kanin 11,12 modeller av venetransplantater. I disse rapportene, ble genoverføring utført ex vivo etter vene innhøsting. Eslami et al. Rapporterte endovaskulær virale gen leverey til carotis årer i situ uten å lage en bypass. 13 Gloverman et al. rapportert intraluminal og adventitia levering av nakent DNA i rotte lårarterie-overflate epigastriet vene fistler. 14 The Mayo gruppen rapporterte adventitia levering av legemidler i mus arteria carotis-halspulsåren fistler. 15,16 Men disse tidligere rapporterte modellene kreves en sutureres anastomose å skape den AVF. I denne rapporten er intraluminal levering av legemidler med samtidig AVF skapningen i mus beskrevet, ved hjelp av en sutur-mindre modell av AVF skapelsen. Ved å bruke denne modifiserte modell murine AVF en enkel metode for intraluminal legemiddelavlevering til vene lem av fistelen kan utføres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkjenning av vedkommende Institutional Animal Care og bruk komité oppnås.

1. Anestesi og Pre-operative prosedyrer

  1. Anesthetize mannlige C57Bl / 6 is, i alderen 8 uker, med fordampet 3% isofluran og 0,8 l / min oksygen administreres inn en akryl induksjonskammeret.
  2. Bekreft tilstrekkelig anestesi ved manglende reaksjon på tå klype. Før musen liggende på operasjonsbordet, og plasser en silikonmaske for å levere fordampet 2-3% isofluran ved kontinuerlig innånding.
  3. Fjern ventral hår fra nakken til nedre del av magen ved hjelp av en kjemisk Hårfjerningskrem.
  4. Utfør Doppler ultralydundersøkelse før AVF kirurgi for å spille inn baseline karakteristikker av arteriell og venøs flyt og fartøy diameter på områder av interesse. 1,2
  5. Fest en 1 ml sprøyte til en 25 G nål og laste sprøyten med det ønskede medikamentet. Bøy nål til en 60 graders vinkel ca 4 mm fra behovetle tips. Ta tak i 25 G nål med en buet nål holder.

2. Operative prosedyrer

  1. Forbered innsnitt området med en aktuell antiseptisk og påfør et kirurgisk drapere. Bruk sterile hansker og instrumenter for å opprettholde aseptisk teknikk gjennom hele operasjonen.
  2. Foreta en midtlinjen abdominal innsnitt med en skalpell som strekker seg fra nivået for den nedre kant leveren til like over pubis.
  3. Sett inn en retractor og eviscerate alle innvoller fra bukhulen mot høyre side. Pakk tarmer i gasbind fuktet med saltvann. Skjær membranen kobler retro-bukhinnen og nedre kolon for å få full oversikt over aorta og IVC.
  4. Dissekere infra-nyre aorta og IVC fra omkringliggende vev, forbereder proksimale og distale klem.
  5. Plasser en enkelt mikro klips på tvers av både den proksimale aorta og den proksimale IVC i nivå like under den venstre nyrevene. Plasser en andre mikro klippet tvers av både distal aorta og den distale IVC.
  6. Tak i bindevevet som omgir aorta og rotere medialt, slik at den dorsale overflate av aorta er litt utsatt for den arterielle punktering, som beskrevet tidligere. 1
  7. Raskt utsett stikkstedet. Stikkstedet vil være på hale aspekt av skipene, omtrent tre fjerdedeler av avstanden fra venstre nyrevene til aortabifurkasjonen. Holde aorta i en rotert posisjon med venstre hånd, dissekere den venstre laterale kanten av aorta, slik at det er rikelig for å tillate eksponering punktering med den høyre hånd. Vær forsiktig med å dissekere mellom aorta og IVC.
  8. Opprettholde aorta i en rotert posisjon og punktering aorta gjennom i IVC ved hjelp av en 25 G nål med et vedlagt en ml sprøyte som inneholder narkotika løsning. (Figur 1A)
  9. Sette mot medikamentløsningen (100-200 pl) ved hjelp av venstre hånd. Nålen kan ses gjennom dilatert og tynnIVC vegg når den transparente medikamentoppløsningen fortrenger venøst ​​blod ut av den IVC (figur 1 B, C). Forbli stille og vedlikeholde nålen i posisjon i 15 min.
  10. Fjern distal mikro klippet til de-klemme bare den distale aorta og den distale IVC.
  11. Fjern kanylen og dekker deretter stikkstedet av aorta ved å trekke opp grenser retro-peritoneal vev.
  12. Fjern den proksimale mikro klippet til de-klemme den proksimale aorta og den proksimale IVC. Ved de-klem er arterielt blod observert strømmer inn IVC i stedet for mørk veneblodstrømmen. Hold dekker punktering hull i 1 min.
  13. Etter bekreftelse av hemostase ved observasjon i 30 sek uten komprimering, returnere tarmer til deres naturlige posisjon og lukk magen med en løpende sutur i henhold til godkjent dyr protokollen.

3. Post-operative prosedyrer

  1. Etter nedleggelsen av magen, slutte ANESThesia. Påfør postoperativ behandling inkludert analgesi og sårpleie i samsvar med instruksjoner som er anbefalt av Institutional Animal Care og bruk komité. For analgesi bruker vi buprenorfin ved 0,1 mg / kg intrasmuscularly hver 12. time i 24 timer etter den kirurgiske prosedyrer.
  2. På den første dagen etter operasjonen, utføre Doppler ultralyd for å bekrefte åpenheten til det AVF. I tillegg måle annet fartøy og strømningsegenskaper serielt og sammenligne for endringer fra pre-operative baseline-verdier. 1,2

Figur 1
Figur 1. (A) Operativ Photo Viser Intraluminal Levering i løpet av AVF Surgery. Klem proksimale og distale aorta, samt IVC ved å bruke mikrokirurgi klips. Punktere aorta gjennom i IVC ved anvendelse av en 25 G nål med vedlagte sprøyte inneholdende medikamentløsning. (B) En HigHennes makt Picture (4X forstørrelse) av punktert IVC før infusjon. Nålespissen er skjult av mørk farget veneblod. Gule pilspisser betegne vegg-til-vegg diameteren på IVC. (C) En høyere makt bilde (4X forstørrelse) av punktert IVC etter infusjon. Nålespissen (svart pil) kan ses gjennom forsiktig oppblåst og tynn IVC vegg (gul pilspisser) som den gjennomsiktige stoffet løsning fortrenger den venøse blod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en serie på 33 mus, overlevelse på den første postoperative dagen var 97,0%; AVF åpenhet, som bestemmes av ultralyd, var 84,9%.

Gene transduksjon effektiviteten av dette endovaskulær levering rute med den tradisjonelle ytre ruten ble sammenlignet. For intraluminal levering (ILD), umiddelbart etter punktering, 200 ul Adenovirus-GFP (Ad-GFP) vektor-løsning (1 x 10 9 PFU / ml) ble infusert i IVC via punkterings nålen, etterfulgt av 15 min inkubasjonstid . Kontrollmus mottok adventitia levering (AD) av Ad-GFP (1 x 10 9 PFU / ml) til IVC ved hjelp av Pluronic gel. Prøvene ble eksplantert etter 24 timer etter eksponering for adenovirusvektorer. Ekspresjon av GFP i IVC vegg og fistelen ble bedømt ved en-face observasjon fra intima ved fluorescens mikroskopi, i tillegg til histologisk undersøkelse i seksjoner ved bruk av et anti-GFPantistoff.

En face observasjon viste sterkere uttrykk for GFP i IVC veggen i mus behandlet med ILD sammenlignet med AD, med karakteristisk styrking rundt fistel på 24 timer (figur 2A). GFP-ekspresjon ble vedvarende i begge grupper ved 72 timer etter transfeksjon (data ikke vist). Histologisk analyse med anti-GFP-antistoff viste mer robust og setespesifikke GFP-ekspresjon i intima av IVC i mus behandlet med ILD sammenlignet med AD. (Figur 2B). For å bekrefte disse resultatene, ble infra-renal IVCs behandlet med adenovirus-GFP av AD eller ILD høstes for Western blot. GFP proteinekspresjon var tilstrekkelig for deteksjon bare etter ILD, noe som tyder på overlegen viral medikamentavgivelse til den IVC vegg via intraluminal rute ved 24 timer etter transfeksjon.

Figur 2
Figur 2. Levering av Adenovirus-GFP til AVF Lumen Forbedrer GFP uttrykk. (A) Representative immunfluorescens viser en face riss av AVF endotel (24 timer) i mus som mottok adenovirus-GFP påført ved adventitia levering (øverst) eller ved intraluminal levering (nederst). Linjen indikerer 25 um. (B) Representative immunfluorescens som viser seksjoner av AVF endotelet (24 timer) i mus som mottok adenovirus-GFP påført ved adventitia levering (øverst) eller ved intraluminal levering (nederst). * Angir lumen i IVC; linjen viser 25 mikrometer. (C) Representant Western blot viser påvisning av GFP i AVF behandlet med adenovirus-GFP søkt via adventitia eller intraluminal ruten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne modifikasjon av den murine modellen AVF inkorporerer intraluminal medikamentavgivelse til den venøse endotelet ved tidspunktet for opprettelse AVF. En AVF ble skapt ved punktering av infra-renal aorta med en 25 G nål og forlenge punktering gjennom den motsatte aortaveggen inn i IVC, etterfulgt av injeksjon av medikamentløsning gjennom den samme kanyle. Oppløsningen holdes intra-cava, altså., I veneslangen AVF, inntil de-klem. Det som skiller denne modellen fra andre murine modeller AVF 17-19 er mangelen på sting eller lim som kan forårsake stenose, akutt trombose, og mulig interferens med molekylær analyse. Muligheten til å bruke samme nål som punkterer aorta og IVC å skape AVF å også levere narkotika til AVF lumen gir enklere levering med minimal fartøy manipulasjon.

Det er noen viktige skritt og poeng for å bedre suksessrate og konsistens av prosedyren. PRoximal klemme av aorta og IVC er plassert under venstre nyrevene. Hvis det er store lumbale årer i den øvre del av den infra-nyre IVC, blir så modifikasjon av klem området til under disse fartøyene anbefalt å tillate effektiv inkubering av medikament uten fortynning av retrograd tilbake-blødning fra lumbale årer. Den distale klemme av aorta og IVC er plassert på nivå med iliaca delinger, for at det kan forstyrre nålen punktering av det distale aorta og IVC. Holder 25 G nål med en buet nål holder muliggjør optimal retning av nålen under fartøyet punktering. Hemostase er oppnådd ved å dekke den arterielle inngangshullet med den tilstøtende retro peritoneum. Spesiell oppmerksomhet er betalt for å gi forsiktig kompresjon samtidig unngå AVF okklusjon og trombose som tidligere beskrevet. 1

Utviklingen av genoverføring teknologi gir mulighet for å modifisere kirurgiske resultater på molekylært nivå. Rapporter som beskriver itraluminal genet levering til en vene har i hovedsak fokusert på målrettet behandling av blodåre graft svikt. I kontrast, gir denne modellen for levering av legemidler for modulering av AVF modning. Fordelene ved denne modellen inkluderer bruk av en murin modell som tillater undersøkelse av varierende mus genetiske stammer. I tillegg er en 15-min intraluminal eksponering protokoll lett overførbar til kliniske intra-operative innstillinger og kan bidra til å vurdere peri-prosessuelle tiltak for å forebygge juxta-anastomotic stenose som ofte kompliserer menneskelig AVF kirurgi. Fra disse første resultater, viser vi at denne metode gir mer setespesifikk genekspresjon i endotelet i forhold til den tradisjonelle ytre rute.

En potensiell begrensning av denne studien er effekten av variabel utspilt press på IVC. Isolasjon av IVC-segmentet er ikke perfekt i denne musemodell, altså., Sidegreiner (lumbar vener) ikke ble ligert. Derfor er det vanskelig å nøyaktig Vedlikhain en konsistent nivå av distensjon trykk under inkubasjon. Selv om IVC er forsiktig oppblåst ved manuell infusjon, kan høyere distending trykk forårsake neointimal hyperplasi 20,21 og direkte glatt muskulatur celleskader, 11 som fører til forstyrrelser i analysen. Det er også vanskelig å fullstendig kvantifisere effektiviteten av medikamentavgivelse, som noen medikament kan gå tapt under levering gjennom lende årer, så vel som etter fjernelse klemme gjennom den proksimale IVC og potensielt gjennom AVF inn i aorta. Til slutt, gir denne metoden noe av stoffet for å bli utgitt systemisk etter klemme fjerning; evakuering av stoffet, og spyling av området kan hindre systemisk utgivelsen, men kvantifisering av graden av stoffet utvasking ville trenge å bli bekreftet.

Som konklusjon, er dette teknisk endring i murine AVF modellen relativt enkel og reproduserbar og muliggjør målrettet endothelial levering av legemidler til muse AVF. intraluminal ijection på tidspunktet for AVF opprettelse er teknisk mulig, og kan med hell forbedre viral genekspresjon i endotelet i forhold til adventitia levering. Dette AVF-levering av legemidler modellen vil være en nyttig modalitet ikke bare for disseksjon av mekanismene som regulerer vene AVF lem modning, men også for terapeutisk modulering av AVF modning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G Used as 30% solution in d-water
GFP antibody NOVUS BIOLOGICALS INC NB100-1770
Ad-CMV-GFP VECTOR BIOLABS 1060
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP Baxter 2F7122
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 BD 305122
BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip BD 309659
Scalpel Surgical Design Inc 22079707
6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting ETHICON INC 697G
Vevo 770 ultrasound machine  Visualsonics  20 - 60 Mhz scan head; RMV-704
Vascular clamp  Roboz Surgical Instrument Co. RS-5424
Clamp applying forceps  Roboz Surgical Instrument Co. RS-5410

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamamoto, K., Li, X., Shu, C., Miyata, T., Dardik, A. Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula. J. Vis. Exp. (77), e50449 (2013).
  2. Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. Am. J. Physiol.: Heart Circ. Physiol. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
  3. Escobar-Chávez, J. J., Lòpez-Cervantes, M., Naïk, A., Kalia, Y. N., Quintanar-Guerrero, D., Ganem-Quintanar, A. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Pharm. Sci. 9 (3), 339-358 (2006).
  4. Almeida, H., Amaral, M. H., Lobão, P., Lobo, J. M. S. Pluronic® F-127 and Pluronic Lecithin Organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 15 (4), 592-605 (2012).
  5. Karper, J. C., et al. Toll-like receptor 4 is involved in human and mouse vein graft remodeling, and local gene silencing reduces vein graft disease in hypercholesterolemic APOE*3Leiden mice. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 31 (5), 1033-1040 (2011).
  6. Redmond, E. M., Hamm, K., Cullen, J. P., Hatch, E., Cahill, P. A., Morrow, D. Inhibition of patched-1 prevents injury-induced neointimal hyperplasia. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 33 (8), 1960-1964 (2013).
  7. Wong, D. J., et al. Ephrin type-B receptor 4 activation reduces neointimal hyperplasia in human saphenous vein in vitro. J. Vasc. Surg. , (2014).
  8. Matsumoto, T., et al. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J. Vasc. Surg. 27 (1), 135-144 (1998).
  9. Petrofski, J. A., et al. Gene delivery to aortocoronary saphenous vein grafts in a large animal model of intimal hyperplasia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127 (1), 27-33 (2004).
  10. Hata, J. A., et al. Modulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129 (6), 1405-1413 (2005).
  11. Ohta, S., et al. Intraluminal gene transfer of endothelial cell-nitric oxide synthase suppresses intimal hyperplasia of vein grafts in cholesterol-fed rabbit: a limited biological effect as a result of the loss of medial smooth muscle cells. Surg. 131 (6), 644-653 (2002).
  12. Baldwin, Z. K., et al. Modulation of vascular remodeling induced by a brief intraluminal exposure to the recombinant R7020 strain of Herpes simplex-1. J. Vasc. Surg. 41 (1), 115-121 (2005).
  13. Eslami, M. H., et al. Gene delivery to in situ veins: differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors. J. Vasc. Surg. 31 (6), 1149-1159 (2000).
  14. Globerman, A. S., et al. Efficient transgene expression from naked DNA delivered into an arterio-venous fistula model for kidney dialysis. J. Gene Med. 13 (11), 611-621 (2011).
  15. Yang, B., et al. Adventitial transduction of lentivirus-shRNA-VEGF-A in arteriovenous fistula reduces venous stenosis formation. Kidney Int. 85 (2), 289-306 (2014).
  16. Brahmbhatt, A., et al. The role of Iex-1 in the pathogenesis of venous neointimal hyperplasia associated with hemodialysis arteriovenous fistula. PLoS ONE. 9 (7), e102542 (2014).
  17. Karram, T., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. J. Investig. Surg. 18 (6), 325-334 (2005).
  18. Perry, G. J., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circ. 103 (7), 1012-1016 (2001).
  19. Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. J. Surg. Res. 108 (1), 112-121 (2002).
  20. Alexander, J. H., et al. Efficacy and safety of edifoligide, an E2F transcription factor decoy, for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery: PREVENT IV: a randomized controlled trial. JAMA. 294 (19), 2446-2454 (2005).
  21. Khaleel, M. S., et al. High-pressure distention of the saphenous vein during preparation results in increased markers of inflammation: a potential mechanism for graft failure. Ann. thorac. surg. 93 (2), 552-558 (2012).

Tags

Medisin vaskulær biologi medisin arteriovenøs fistel aorta vena cava inferior aorto-cava fistel mus dyremodell levering av legemidler kirurgiske teknikker
Intraluminal Drug Delivery til Mouse arteriovenøs fistel endotelet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hashimoto, T., Yamamoto, K., Foster, More

Hashimoto, T., Yamamoto, K., Foster, T., Bai, H., Shigematsu, K., Dardik, A. Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium. J. Vis. Exp. (109), e53905, doi:10.3791/53905 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter