Summary
שימוש עכברי כתב מצמידים את ההר שלם וסעיף מכתים, מיקרוסקופיה מבחני vivo מקל על הניתוח של המנגנונים העומדים בבסיס הדפוסים הנורמלים של דרך הנשימה. כאן אנו מתארים כיצד טכניקות אלה תרמו ניתוח איתות Wnt במהלך התפתחות קנה נשימה.
Introduction
פיתוח דרך נשימה הוא שיזם עוברי היום 9 (E9) עם הופעתו של תאים חיוביים Nkx2.1 ב endodermal גחון 1,2 במעי קדמי. הפרדת צינור ושט-קנה נשימה תפתור ידי E11.5 כשהצינורות ניתן להבחין כישויות נפרדות, כל אחת מוקף mesenchymal רקמות 3. איתות Wnt ממלא תפקיד מרכזי במפרט של דרכי הנשימה כמו מחיקת Wnt2 ו Wnt2b, שהביעו mesenchyme ומחיקה של β-קטנין splanchnic מן האפיתל הנשימה endodermal תגרום agenesis ריאות 4,5. המחקרים הקודמים שלנו נקבע כי מחיקה של WLS, הפרשה בתיווך רצפטור המטען של כל הליגנדים Wnt, מתוצאות בדרכי הנשימה endodermal ב hypoplasia ריאות, פגמים בהתפתחות כלי דם ריאתי דפוסים mis של mesenchyme קנה הנשימה 6,7. נתונים אלה תומכים בחשיבות של הקרו אפיתל mesenchymalss לדבר התמיינות תאים מפרט, כפי שהוא גם הוכח במחקרים אחרים 8,9.
המחקר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות הריאות מסתמך על גנטיים, במבחנה טכניקות vivo לשעבר כי אפשרו לנו להבין מנגנונים טובים יותר נהיגה זהות הנשימה 10-16. תרבויות ריאות explant כולו על שלבי נוזלי אוויר כבר נוצלו נרחב כדי לחקור את ההשפעות של גורמי גדילה בשלבים המוקדמים של ריאתי הסתעפות morphogenesis 10,17,18. אמנם שיטה זו משמשת ההודעה של שינויים מורפולוגיים, כגון המורפוגנזה הסתעפות, אפנון ביטוי גנים, היא מוגבלת ללימוד בשלבים המוקדמים של תהליך התפתחותי, כמו התרבות עצמה אינה תומכת בפיתוח כלי הדם 17. פיתוח של סחוס קנה נשימה דורש פעמי דגירה כבר שעשויה להיות לא תואמים עם טכניקת תרבות זו.
כדי analyzדואר התפקיד של איתות Wnt במהלך היווצרות בדרכי נשימה, מתאמנים בטכניקות מקובלות כדי לענות על הצרכים של המחקרים העובריים שלנו. יש לנו שונה כרכים, פעמים מכתימות, רכיבת עיבוד להטבעת פרפין ועיתוי לסליקה של רקמות קנו נשימה וריאות. המטרה העיקרית של אופטימיזציה של הטכניקות המתוארות במחקר הנוכחי הייתה לנתח את השלבים המוקדמים של פיתוח קנה הנשימה אצל עכברים המתרחשים מ E11 ל E14.5. שימוש Axin2LacZ קו העכברים כתב לנו האתרים לקביעה מדויקת של פעילות Wnt / β-קטנין ב mesenchyme קנה הנשימה מתפתח. גם אנחנו צריכים להתאים לקטינים ההליך מכתים עבור רקמות קנה הנשימה הר שלם. לפיכך, הצלחנו לחזות condensations mesenchymal ולחזות אתרים שבהם chondrogenesis יתקיים. הכתמה של הר שלם וחתכים של רקמה עוברית שהתקבלה בעכברי WlsShhCre, בשילוב עם שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות, אפשרה לנו לחשוף את התפקיד של הליגנדים Wnt המיוצרים על ידי traהאפיתל Cheal ב דפוסים קנה הנשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בעלי חיים שוכנו בתנאים הפתוגן חינם. עכברים שטופלו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים CCHMC ועדת שימוש (סינסינטי, אוהיו ארה"ב). עכברים מנוצלים ברחבי המחקרים הללו נשמרו רקע מעורב.
1. הר שלם X-galactosidase מכתים
- להרדים הנשי בהריון E11.5 כדי E14.5, משאיפת CO 2. מניחים חיות בתא 2 CO, לחייב את החדר עם CO 2. לשמור על חיות בתא עבור מינימום של 5 דק '. ישם שיטה משנית של המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם.
- באזור הבטן נקי עם אתנול (EtOH) 70% ולבצע laparotomy עם חתך קו האמצע בטן אחת. לנצל מספריים כירורגיות דפוס סטנדרטי (ישר מסורית) מלקחיים.
- לבודד קרני הרחם באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר ומכניסים מיד רקמות בצלחת פטרי המכילות מקורר פתרון PBS. לשמור על רקמות על הקרח עד הליךלבידוד של עוברים.
- לבודד עובר מן קרן רחם. לנתח רקמת ריאה קנה נשימה עוברית באמצעות מיקרוסקופ לנתח. לנצל מלקחי טיפ נאים ומספריים להחזיק לנקב את רקמת רחם concepti משחרר את העוברים.
- סר הנותרים ממברנות עובריים. עם להבי סיוע של מחט לחתוך ראש עובר וחלק גוף תחתון מתחת לסרעפת. אתר כבד כציון דרך.
- לאחר הבידוד של אזור החזה של העובר, להמשיך להסיר צדדים לרוחב קיר גוף, עמוד השדרה ולהבי מחט באמצעות לב. תשמור על עצמך תוך הסרת הלב כדי למנוע פציעת רקמות קנו נשימה. לבסוף, בזהירות, להפריד בין הוושט מקנה הנשימה על ידי משיכת הוושט עם סיוע של להבי מחט. לשמור על רקמה בתמיסת PBS על קרח.
- מקום רקמת 4 מיליליטר בורג בקבוקוני כובע באמצעות טפטפות זכוכית או העברה. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS למשך 30 דקות. לאחר קיבוע,לשטוף רקמה עם PBS. בעוד שטיפה, להכין פתרון מכתים X-gal (להוסיף 5 מ"מ K 3 Fe (CN) 6, (100 μl 0.5 M לני"ע) 5 מ"מ K 4 Fe (CN) 6 (100 μl 0.5 M המניות) 2 מ"מ MgCl 2, ( 20 μl 1 M לני"ע) 0.01% NaDOC (50 המניות μl 2%), 0.02% NP 4 O (100 μl 2% מניות), 1 מ"ג / מ"ל X-gal (500 μl של 20 מ"ג / ml המלאי) ו 9.13 מ"ל של מים מזוקקים להביא לנפח סופי של 10 מ"ל).
- הסר את כל PBS הנותרים ומוסיפים 2 מ"ל של תמיסת מכתים X-gal בקבוקון זכוכית. מניחים צלוחיות במגש על שייקר. כתם רקמות 1 עד 2 שעות בתמיסה מכתימה X-gal. דגירת הרקמה בתמיסת X-gal במשך 4 שעות לעיבוד והטבעה נוספים.
- עצור את התגובה על ידי רקמות כביסה ב-PBS sulfoxide דימתיל 3%. יש לשטוף ב- PBS, 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד לשטוף ולאחסן באתנול 70%.
- מלאו צלחות פטרי עם פתרון 1% agarose / PBS. אפשר agarose כדי לחזק. באמצעות טפטפות העברת זכוכית, למקם את הרקמה על שיתוף agaroseצלחות ated מלאים פתרון PBS. לצלם mounts כל באמצעות מיקרוסקופ לנתח. בחר מסנן מתאים brightfield.
- כדי להבחין טוב יותר את האתרים של דגימות תהליך מכתים X-gal להטבעת פרפין חתך. דגימות מקום קלטות מסך בסדר.
- כדי לעבד דגימות להטבעת פרפין ושימוש במעבד אוטומטי להגדיר מחזור קצר כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול: שינוי ראשון 5 דקות ו -3 דקות לכל שינוי נותר. שלושה שינויים של קסילן: 5 שינוי הראשון דקות ו -3 דקות הבאים שני שינויים. השלבים הקודמים מבוצעים על 30 מעלות צלזיוס. לבסוף, לבצע שלושה שינויים של פרפין ב 62 ° C: 25 דקות, 8 דקות ו -5 דקות.
- דגימות אוריינט להטבעה עם הרקמה שוכבת על הקרקעית של הטבעת סירה. בזהירות להוסיף פרפין למלא את סירת ההטבעה. מגניב מיד על צלחת קרה של הטבעת תחנה עד מתמצק פרפין. סור בלוק מן הטבעת סירה. באמצעות microtome, ליצור 6 מיקרומטר sections. סעיפי הר בשקופיות-pretreated ומגלשות יבשות על סט חם שקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- אופים מחליקים לילה בתנור ב 56 ºC. מניח שקופיות מתלות. Deparaffinize מחליק עם שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות כל אחד. השתמש מכתים מנות מלאות 200 מ"ל של קסילן.
- רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגים (100%, 70%, 50% ו -30%, 1 דקות לכל שלב) כדי PBS לפני counterstaining עם אדום מהיר גרעיני במשך 10 עד 30 שניות. יש לשטוף שקופיות עם ברז מים שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם כדי להסיר עודפים של Red הגרעיני המהיר.
- מייבשי שקופיות בסדרת EtOH מדורגת (50%, 70% ו -100% EtOH) לפני הכביסה בשלושה שינויים של קסילן (20 מטבלים כל שינוי) ומכסים מחליקים עם תקשורת הרכבה מבוססת קסילן.
2. לקטינים מכתימים
- לנתח רקמת הריאה E13.5 ו E14.5 קנה הנשימה כמתואר בשלבים 1.1 כדי 1.4. באמצעות טפטפות העברת זכוכית רקמות מקום בקבוקונים מתברג. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה עם 2 מ"ל של2% פתרון PFA לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר קיבוע, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לשטוף.
- הכין חיץ חסימה, בדרך כלל נפח סופי של 10 מיליליטר של תמיסה. להוסיף 0.1 גרם של BSA (1%) ל -8 מ"ל של PBS. אפשר BSA לפזר. להוסיף 0.2 מ"ל של סרום עיזים (2%) 0.03ml של טריטון X-100 (0.3%). תביאו נפח סופי 10 מ"ל עם PBS. דגימות בלוק עבור שעה 1 ב 0.5 מ"ל של חיץ חסימת בטמפרטורת החדר.
- הסר חוצץ חסימה בעזרת פיפטה העביר ולהחליף עם פתרון לקטינים המורכב של 50 מיקרוגרם / μl של לקטינים, 10% בסרום עיזים PBS. השתמש 250 μl של פתרון לקטינים לדגימה. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד לכסות את בקבוקון זכוכית המכיל רקמות ברדיד אלומיניום. לאחר הדגרה עם פתרון לקטינים, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות.
- explants מקום בצלחות פטרי מצופה agarose המכילים מספיק PBS לכסות דגימות. לצלם mounts כולו באמצעות מיקרוסקופ לנתח קרינה. בחר את appropמסנן riate לזהות קרינה. לקטינים PNA בדרך כלל מצמידים GFP.
3. הר שלם Immunofluorescence מכתים מיקרוסקופית Confocal
- לבודד רקמת ריאה קנה נשימה, להעביר 4 מיליליטר בקבוקוני כובע זכוכית בורג ולתקן לילה PFA 4%. רקמת E11.5 יכולה להיות קבועה 2% PFA. חנות מתנול 100%. דוגמאות ניתן לאחסן עד מספר חודשים ב -20 ° C.
- הסר מתנול באמצעות פיפטה העברת permeabilize דגימות באמצעות האקונומיקה של דנט (4 חלקים מתנול, 1 חלק DMSO ו 1 חלק 30% H 2 O 2) עבור 2 שעות. רקמת סודה בסדרה של מתנול מדורגים מדולל PBS כדלקמן: 100 מתנול%, 75% מתנול, 50% מתנול, 25% מתנול, 100% PBS. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר במהלך כל שלב של הידרציה.
- רקמת הבלוק מגיב חסימת 0.5% בדילול מלא PBS (ראה חומרים לפרטים נוספים) למשך שעות בטמפרטורת חדר עם תסיסה.
- לדלל נוגדן עיקרי חסימהפתרון (Sox9 1: 100, 1 Nkx2.1: 200, 1 αSMA: 250) דגירה דגימות לילה בשעה 4 ° C.. לשטוף דגימות עם PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר. בצע כל שטיפה במשך שעה 1.
- החל נוגדנים משני ביחס של 1: דילול 500 בתמיסת חסימת 0.5%. בחר בקפידה נוגדנים משני למנוע מחייב בין נוגדנים משני. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר חשוך. לשטוף דגימות שלוש פעמים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מייבשי דגימות בסדרה של מתנול מדורגת מדולל PBS כדלקמן: מתנול 25%, 50% מתנול 75% מתנול, מתנול 100%, 10 דקות כל אחד צעד.
הערה: ודא כי דגימות להישאר מכוסה בנייר אלומיניום ולצמצם את החשיפה לאור. רקמות כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות עד להצטלם. - דגימות העברה מחוייט צלחות הבמה, להסיר מתנול וברור עם כ 200 μl של פתרון ברור של מוריי 19,20 (2 חלקים בנזיל בנזואט, 1 חלק בנזיל אלכוהול) מיד BEFהדמית עפרות. לצלם באמצעות מיקרוסקופ confocal. לעבד ולנתח תמונה באמצעות תוכנת הדמיה.
התפשטות תאים 4.
- להזריק עכברי E11.5 בהריון תוך peritoneally עם תמיסה של BrdU בריכוז של 100 מיקרוגרם BrdU / גרם של משקל גוף. הקורבן נקבה כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול ולבודד העוברים E12.5 או E13.5. שימוש להבי סכין, ראשי בלו החלק התחתון של הגוף מתחת חלל בית החזה.
- מניחים רקמות החזה ב 4 מ"ל בורג בקבוקונים כובע ולתקן ב 1 מ"ל של 4% PFA לילה. לשטוף דגימות עם PBS פעמים במשך 5 דקות ו מייבשות דגימות באמצעות סדרת אתנול מדוללת מים מזוקקים אתנול 70% כדלקמן: 30%, 50% ו -70% אתנול, במשך 5 דקות כל אחד צעד.
- מקום דגימות קלטות מסך בגודל בינוני. תהליך רקמה והטבעה פרפין באמצעות מעבד אוטומטי. הגדרת מחזור כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול במשך 8 דקות כל אחד, שלושה שינויים של קסילן במשך 6 דקות כל אחד, שלושה גhanges של פרפין, במשך 25 דקות, 9 דקות ו -8 דקות.
- להטביע פרפין המכוונת את הרקמה המיקום הרצוי כדי ליצור 6 רוחבי מיקרומטר או סעיפים האורך כמפורט בסעיפים מקום בסעיף 1. בשקופיות ולאפשר רקמות לדבוק להחליק על הסט חם השקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- מגלשות אופות, על צדם, הלילה בתנור ב 56 ° C. מניח שקופיות מתלות פלסטיק. שקופיות דה-paraffinize ידי טבילה שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות לכל שינוי. השתמש 200 מ"ל של קסילן להטביע שקופיות לחלוטין. רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגת (100%, 70%, 50% ו -30%, 5 דקות לכל שלב עם תסיסה) כדי PBS (5 דקות).
- בצע אחזור אנטיגן באמצעות 10 מ"מ חיץ ציטראט, pH 6. כדי להכין 100 מ"ל של תערובת חיץ ציטראט 18 מ"ל של 0.1 מ חומצת לימון monohydrated ו -82 מ"ל של 0.1 מ 'נתרן ציטרט.
- מקום דגימות בצנצנות coplin פלסטיק מלא פתרון יחזור אנטיגן ומיקרוגל עבור 6.5 דקות בהספק גבוה. להוסיף דיסtilled מים בצנצנת coplin כדי לפצות על חיץ לחמם ציטראט-התאדה בהספק 40% במשך 6 דקות.
- מלאו צנצנת coplin לראש עם מים, לחמם שוב בהספק 40% במשך 6 דקות. פעמי מיקרוגל עשויים להשתנות בהתאם מיקרוגל בשימוש.
- אפשר שקופיות להתקרר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שקופיות כביסה במים מזוקקים במשך 1 דקות, ואחריו PBS במשך 5 דקות. לאחר PBS לשטוף, מגלשות בלוק עבור שעה 2 בתמיסה המכילה חוסם TBS (2.425 גרם של בסיס טריס ו 8.765 גרם של NaCl מדולל 1 ליטר של מים מזוקקים) 10% בסרום חמור 1% BSA.
- הוספת נוגדנים עיקריים מדוללי חסימת הפתרון (TBS המכיל סרום 10% חמורים 1% BSA). BrdU (סמן מיטוזה), Nkx2.1 (אפיתל דרכי הנשימה), Sox9 (תאים יהיה להצמיח סחוס) ו αSMA (תאי שריר חלק). דגירת שקופיות הלילה, ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בשיטת כיסוי כדי לשמר נוגדנים. החל 180 μl של נוגדני אטם ולאחר מכן לצרף שקופית כאילו כיסוי להחליקפינג.
- ניתוק אטם ידי טבילת שקופיות לתוך מים מזוקקים. לאחר הסרת האטם, לשטוף נוגדן ראשוני מאוגד על ידי ביצוע שש 5 שטיפות דקות עם כפות המכילות 0.1% Tween-20.
- דגירה שקופיות עם נוגדנים משני מדולל חסימת פתרון בדילול של 1: 200, 1 שעות בטמפרטורת החדר. בחר נוגדנים משני בזהירות כדי למנוע רצויים מחייב ביניהם. סור נוגדנים משני מאוגד על ידי ביצוע שלושה חמישה שוטף דקות עם כפות המכילות Tween 0.1%.
- לשטוף שקופיות 0.1 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן 0.05 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות. שקופיות ניתן להשאיר 0.05 מ 'טריס בסיס תוך coversliping באמצעות התקשורת הרכבה עם או בלי DAPI (1.5 מיקרוגרם / מ"ל). שקופיות חנות בתיקיית שקופיות ב 4 ° C ולהגן מפני אור על ידי כיסוי תיקייה עם רדיד אלומיניום.
- דמיין מכתים ולצלם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. רוזן שכותרתו תאי תאים הכוללים לכל שדה מצולם20X ו 40X לקבוע יחסים של מתרבי תאים לתאים כוללים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt / פעילות β-קטנין
מכתים ההר שלם Lac-Z זוהה רקמות קנו נשימה וריאות של עוברים מבודדים כתב Axin2 Lac -Z עכברי 11. אתרים של מכתים לציין פעילות Wnt / β-catenin. ניתוח סעיפים של מכתים הר שלם נקבע כי פעילות Wnt / β-קטנין נכח mesenchyme של קנה הנשימה ב mesenchyme של אזורי הפריפריה של הריאות מתפתחות. בעוברים WlsShhCre (שבו הפרשת ligands Wnt מן האפיתל של דרכי הנשימה בוטל) מכתים Lac-Z היה כמעט נעדר (איור 1).
condensations מזנכימה mesenchyme קנה הנשימה
שלב קריטי chondrogenesis הוא תהליך שבו תאים mesenchymal נגזר לתת rISE סחוסים לרכז. מצבורים חזקים אלה של תאים ידועים כמו condensations mesenchymal. כדי לבדוק אם חוסר סחוס נצפתה בעכברים WlsShhCre נבע העדר condensations mesenchymal, רקמות הריאה קנה הנשימה מן E12.5 הגילאים הריונית כדי E14.5 הוכתמו לקטינים PNA. בשעת E13.5 ו E14.5, קרינה זוהתה כפסים תקופתיים mesenchyme קנה הנשימה באתרים בם סחוס יוקם. חוסר הקרינה לגילוי ברקמת קנה הנשימה של עבר WlsShhCre עולה כי endodermal Wnt איתות אל mesenchyme קנה הנשימה היא הכרחית condensations mesenchymal (איור 2).
מפרט תא בדרכי הנשימה
immunofluorescence הר שלם של רקמות הריאה קנה הנשימה נקבע דפוס הביטוי של Sox9, Nkx2.1 ו αSMA ב E11.5. בתוך הרקמה קנה נשימה, ביטוי Sox9 הוא גבולעורך אל mesenchyme של קנה הנשימה בצורת פס רציף (החץ באיור 3 א 'וב') ואילו Sox9 ריאות פיתוח הוא ציין בשולי האפיתל בדרכי הנשימה (ראשי חץ באיור 3 א, B ו- C). Nkx2.1 מציג דפוס ביטוי ברור מוגבל האפיתל של קנה הנשימה של הריאות. הפרשת מניעת הליגנדים Wnt אפיתל גורם הביטוי פחתה של Sox9 ב mesenchyme קנה הנשימה אך אינה משפיעה על הביטוי Sox9 ב האפיתל ריאות הפריפריה. הביטוי של αSMA אינו מזוהה בקלות mesenchyme קנה הנשימה, אולם מכתים זוהה ברמה של הגרון (חץ צהוב, איור 3) והקיבה (איור 3).
תא התפשטות בקנה הנשימה פיתוח
הפצת נשק ב האפיתל וגם mesenchymeשל קנה הנשימה אותרה לאחר in vivo תיוג של רקמות עם BrdU. קטעי רקמות קנה הנשימה הוכתמו נוגדנים הכרה BrdU, Sox9 ו αSMA. פרופיל ההתפשטות ב mesenchyme קנה הנשימה עולה כי הרמות של התפשטות עוברת תאים מוכתמים Sox9 גבוהה מהרמה של תאים מוכתמים αSMA עוברים התפשטות. דפוס התפשטות זה נראה לגרסה הקודמת tracheas WlsShhCre (איור 4).
איור 1: Wnt / β-קטנין הפעילות האופרטיבית mesenchyme קנה הנשימה רקמת הריאה E13.5 קנה הנשימה, מבודד Axin2-LacZ ו WlsShhCre:. עכברים Axin2-LacZ, הוכתמו X-gal (A ו- B). קטעי רקמת הריאה קנה הנשימה היו counterstained עם אדום מהיר (א ', ב'). הערת חוסר X-galמכתים ב WlsShhCre; עכברים Axin2-Lac-Z הוכחת היעדר פעילות Wnt / β-קטנין (ב '). E14.5 רקמות מעכברי Axin2 LacZ מוכתמים X-gal מתארות אתרים של טבעות סחוסים בעתיד (C); עם זאת, פעילות Axin2 הוגבל בפריפריה (ראש חץ) של condensations mesenchymal (חץ) (D). סרגל קנה-מידה, B ו- C = 500 מיקרומטר; ב ', ד' ו-ד '= 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. עיבוי mesenchymal בפיתוח רקמות קנה הנשימה קנה הנשימה explants-ריאה E13.5 הוכתמו לקטינים PNA. בקרת רקמות קנו נשימה המתארות את האזורים היו תאי mesenchymal המרוכזים מוצג (א חיצים C). אין condensations mesenchymal אותרה בעכברי WlsShhCre (B ו- חץ D). C ו- D מתארים בהגדלה נמוכה של רקמות קנו נשימה וריאות מוצגות A ו- B. סרגל קנה-מידה ו- B = 1 מ"מ; C ו- D = 2 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דפוס הביטוי כולו prechondrogenic הר קנה הנשימה Nkx2.1 ו Sox9 מכתים זוהה explants E11.5.. לוח א 'מתארת תמונה של רקמות מלאות, בעוד לוח ב' מראה את חלק אופטי של רקמות מלאות 20 מיקרומטר. הערת חוסר ביטוי mesenchymal של Sox9 ברקמת WlsShhCre (חץ ב- C), but תחזוקת ביטוי ההיקפי של Sox9 (Arrowhead ב- C). מכתים αSMA זוהה ברמות נמוכות trachealmesenchyme של רקמות E11.5 אך ציין באזור הגרון (חץ צהוב D ו- E), בטן (S) ו ברקמת לב נותרת (CT) (E). Nkx2.1 מתבטא אפיתל לפתח קנה הנשימה והריאות (D, E). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. דפוס התפשטות תאים ב mesenchyme prechondrogenic סעיפים של עוברים E13.5 הוכתמו אנטי BrdU, Sox9 נוגדנים αSMA. לוחות C ו- D הוא בהגדלה גבוהה של A B בהתאמה. קווים מקווקווים מייצגים גבולות האפיתל קנה הנשימה. הערת תא שגשוג מוכתם Sox9 (C ראש החץ) ותא שגשוג מוכתם αSMA (חץ בר). T = קנה הנשימה, E = הוושט. סרגל קנה-מידה ו- B = 50 מיקרומטר, C ו- D = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אירועים שבבסיס morphogenesis של דרכי הנשימה אינם מובנים לחלוטין, במיוחד את ההליכים הנדרשים דפוסים של דרכי הנשימה ניצוח. מחקרים קודמים השתמשו בטכניקות vivo לשעבר שבו explants בפיתוח מתורבת על שלבי נוזלי אוויר או מוטבע matrigel 21,22. מחקרים אלה הראו כיצד גורמי גדילה להשפיע על הדפוסים של קנה הנשימה בפיתוח ויצירת סחוס קנה נשימה. מגבלה המחקרים הללו היא כי הארכיטקטורה של רקמות אינו מתוחזק כראוי ולכן, הם לא יכולים ממש לשחזר את in vivo תהליך chondrogenesis.
הגישה שאנחנו התחייבנו כדי ללמוד את התפקיד של איתות Wnt בתהליך של ביצוע איירווייז דפוסים שהשתתפה במחקרי vivo בשילוב עם טכניקות מכתים הר שלמות, immunofluorescence והדמיה. מכתים X-gal של רקמות הר שלמות ואחריו se ctioning שכנגד מכתים, מציג יתרונות על פני מכתים סעיפים פרפין. מכתים הר שלם מאפשר זיהוי ישיר של אתרים שבם Wnt / β-קטנין פעילות מבצעית. יתר על כן, חתך של explants מוכתם נקבע אתרים מדויקים mesenchyme שבו הפעילות הייתה ממוקמת שככל שהתפתחות התקדמה. זו האחרונה היא הודעה טובה יותר ומדויקת יותר זיהוי ביטוי של אנזים β-galactosidase בסעיפי פרפין. בעוד הפעילות האנזימטית ניתן היה לזהות בסעיפים, הליך זה ידרוש cryosections כי לא תמיד יהיה קל ליצור וייתכן שלא לשמר את הארכיטקטורה של דגימות קטנות. מגבלה בפרוטוקול המתואר במאמר זה, היא כי עיבוד של דגימות להטבעת פרפין לאחר מכתים הר שלם תגרום לאובדן של האות. לכן, דגימות צריכות להישאר עוד פתרון X-gal ומחזור קצר להטבעת פרפין צריך לשמש כדי להשיג אות טובה על סעיפים.
"Jove_content"> עיבוד של רקמה קטנה להטבעת פרפין יגרום להפחתת הגודל של הרקמה. זוהי תוצאה בלתי רצויה תוך כדי עבודה עם כמות הרקמה מופחתת. לכן, פתחנו מחזור עיבוד קצר המאפשר בו זמנית לשימור נאות של המבנה מבלי לגרום הפחתה בגודל של הרקמה.
מצד השני, הליך immunofluorescence הר שלם, שהשתנה לאחר הטכניקה המתוארת על ידי Ahnfelt-Ronne 23, מותר להדמית tridimensional לפתח קנה נשימה ורקמות ריאתי, עם דפוס ביטוי מוגדר של חלבונים המקודדים על ידי גורמי שעתוק מפתח כגון Nkx2.1 ו Sox9. כאשר רצוי, מכתים ההר השלם יכול להיות מוצג כמו ערימות z בעזרת confocal של תמונות, המתאר בעומקים שונים של רקמת הריאה קנה נשימה. בעוד הדמית explants הקטן, סליקת הרקמה צריכה להתבצע בתוך צלחת במה. ניצלנו מתכתי עבהבהתאמה אישית צלחות במה עם תחתית אופטית שבו דגימות נמחקות צלמו. הליך זה מונע אובדן של חומר בעת העברת רקמה קטנה לאחר ניקוי צעד. בעוד כל immunofluorescence ההר הוא טכניקה מתאימה מכתים של רקמה קטנה, אנחנו מכירים במגבלות לטכניקה. בפרט, צפינו הופעות שונות של נוגדנים שמזהים אנטיגן טוב יותר בסעיפים בניגוד ההר שלם. בעיה זו עלולה למנוע את הביצועים של הטכניקה אם אין נוגדנים חלופיים זמינים. אפשר גם כי השימוש מתנול וסליקה עם מאריי ברור עשוי להיות השפעה שלילית האות ציינה. בעתיד, נוכל לבדוק פתרונות סליקה שאינם אורגניים אחרים ולהתאים את פרוטוקול כראוי למטרה זו 24. שיקול סופי הוא כי הר שלם יאפשר המחקר של כמה חלבונים לידי ביטוי רקמות בבת אחת נתונה.
דיווחים קודמים הראו את התועלת שלמכתים לקטינים PNA לזהות condensations mesenchymal בסעיפים של קנה הנשימה רקמות 21,25. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על מתודולוגיה שבאמצעותו המכתים בוצע הר שלם, המאפשר הדמיה טובה יותר של האזורים של קנה הנשימה שבה הסחוס יוקם. בעת ביצוע טיפול מכתים לקטינים צריך להיות ממוקם באמצעות הריכוז המתאים של לקטינים כדי לא נגמר-כתם, כמו PNA-לקטינים זמינים מסחרית מצמידים GFP. Auto-קרינה של הרקמות עלולה לטשטש את תוצאות ביצוע קשה להבחין להקות המתאימות mesenchymal condensations.
לבסוף, in vivo תיוג של רקמות עם BrdU ואחריו חתך והכתים immunofluorescence היא טכניקה אפשרית כדי לקבוע התפשטות תאים המציגה יתרונות על פני מכתים טיפוסי סטטי כגון PPH3 או PCNA 26,27. הטכניקה האחרונה מציגה מגבלות, כמו מכתים ישתנה בהתאםשלב במחזור התא. בעיה זו מתבטלת על ידי הטכניקה המתוארת שלנו. שילוב תיוג in vivo ואחריו הטבעה, חתך immunofluorescence אפשרה לנו לקבוע כי Wnt אפיתל הליגנדים לאזן את התפשטות ההפרש של Sox9 ו α-SMA לבטא בתאי כי יהיה להצמיח סחוס קנה הנשימה ושרירים 7.
לסיכום, גישה מרובת טכניקה ללימוד דפוסים של דרכי הנשימה לפתח מאפשרת ניתוח עמוק של תפקיד איתות Wnt בניהול morphogenesis דרכי הנשימה. מחקרים אלה נקבעים באתרים המדויקים של Wnt / β-קטנין ברקמת קנה הנשימה, כמו גם איתות אינדוקטיביים והמאלפת שמספקת האפיתל קנה הנשימה דרושה מפרט, התפשטות הפרש של שושלות תאי mesenchyme קנה נשימה, כמו גם היווצרות סחוס. הכיוונים העתידיים שלנו כוללים אופטימיזציה של מכתים ההר השלם עבור WLS זיהה לאחרונהגני מטרה, כמו גם ביצוע immunofluorescence הר שלם בשילוב עם מכתים לקטינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"החוקרים אין לי מה לחשוף."
Acknowledgments
אנו מכירים את עזרתו של מייק Muntifering ומאט Kofron עם הדמיה confocal וגייל Macke לנהלים היסטולוגית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות-NHLBI (K01HL115447 כדי DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
