Summary
El uso de ratones reportero acoplados a todo el montaje y la sección de tinción, microscopía y ensayos in vivo facilita el análisis de los mecanismos que subyacen en el patrón normal de las vías respiratorias. A continuación se describe cómo estas técnicas contribuyeron al análisis de la señalización de Wnt durante el desarrollo traqueal.
Introduction
El desarrollo del tracto respiratorio es iniciado por día embrionario 9 (E9) con la aparición de células positivas en el Nkx2.1 endodérmico ventral del intestino anterior 1,2. Separación del tubo esofágico-traqueal resolverá por E11.5 cuando los tubos se pueden distinguir como entidades distintas, cada una rodeada por tejido mesenquimal 3. La señalización de Wnt desempeña un papel clave en la especificación de las vías respiratorias como la supresión de Wnt2 y Wnt2b, expresada por el mesénquima esplácnico y supresión de β-catenina del epitelio respiratorio endodérmico resultará en agenesia pulmonar 4,5. Nuestros estudios anteriores determinaron que la supresión de Wls, una mediación de la secreción de receptor de carga de todos los ligandos Wnt, a partir de los resultados de las vías respiratorias endodérmico en hipoplasia pulmonar, defectos en el desarrollo vascular pulmonar y de errores de modelado de la mesénquima traqueal 6,7. Estos datos apoyan la importancia de la cro epitelio-mesenquimalss hablar en la diferenciación celular y la especificación, ya que también se ha demostrado en otros estudios 8,9.
El estudio de las primeras etapas del desarrollo de los pulmones se basa en genética, in vitro e in vivo técnicas ex que han permitido comprender mejor los mecanismos que impulsan la identidad respiratoria 10-16. Cultivos de explantes de pulmón enteros en la interfase aire-líquido se han utilizado ampliamente para estudiar los efectos de los factores de crecimiento en las primeras etapas de la morfogénesis pulmonar 10,17,18 ramificación. Mientras se usa este método como lectura de cambios morfológicos, tales como la morfogénesis de ramificación, y la modulación de la expresión génica, se limita al estudio de las primeras etapas del proceso de desarrollo, ya que la cultura misma no es compatible con el desarrollo de la vasculatura 17. El desarrollo del cartílago traqueal requiere tiempos de incubación más largos que pueden ser incompatibles con esta técnica de cultivo.
para ANALYZe la función de señalización Wnt durante la formación de las vías respiratorias, hemos adaptado técnicas estándar para satisfacer las necesidades de nuestros estudios embrionarias. Hemos modificado volúmenes, tiempos de tinción, ciclo de procesamiento para la inclusión en parafina y el calendario para la limpieza del tejido traqueal-pulmón. El principal objetivo de la optimización de las técnicas descritas en el presente estudio fue analizar las primeras etapas del desarrollo traqueal en ratones que tienen lugar desde E11 a E14.5. Utilizando el reportero ratones línea Axin2LacZ nosotros los sitios precisamente determinadas de la actividad / β-catenina en el mesénquima traqueal en desarrollo. También hemos adaptado procedimiento de tinción de lectina para todo el tejido traqueal montaje. Por lo tanto, hemos sido capaces de visualizar condensaciones mesenquimales y predecir los sitios en donde se llevará a cabo la condrogénesis. La tinción de todo el montaje y las secciones de tejido embrionario obtenido de ratones WlsShhCre, junto con técnicas de microscopía avanzada, nos permitió dar a conocer el papel de los ligandos Wnt producidos por el traepitelio traqueal en el patrón traqueal.
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Protocol
Los animales se alojaron en condiciones libres de patógenos. Los ratones fueron manejados de acuerdo a los protocolos aprobados por CCHMC Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Cincinnati, OH EE.UU.). Los ratones utilizados a lo largo de estos estudios se mantuvieron en un fondo mixto.
1. Todo el montaje X-galactosidasa de tinción
- La eutanasia a mujer embarazada en E11.5 a E14.5, mediante inhalación de CO2. Colocar los animales en la cámara de CO 2, cargar la cámara con CO2. Mantener los animales en la cámara por un mínimo de 5 minutos. Realizar método secundario de la eutanasia por dislocación cervical.
- área abdominal Clean con etanol (EtOH) 70% y llevar a cabo la laparotomía con una sola incisión en la línea media abdominal. Utilizar tijeras quirúrgicas y patrón estándar (serrados recta) fórceps.
- Aislar cuernos uterinos usando pinzas y tijeras finas e inmediatamente colocar el tejido en la placa de Petri que contenía solución de PBS enfriado. Mantener el tejido en hielo hasta su procedimientopara el aislamiento de los embriones.
- Aislar los embriones de los cuernos uterinos. Diseccionar el tejido traqueal de pulmón embrionario usando microscopio de disección. Utilice unas pinzas de punta fina y tijeras para sostener y perforar el tejido uterino y concepti liberación de los embriones.
- Retirar los restos de membranas embrionarias. Con la ayuda de palas de agujas cortar la cabeza de embriones y la parte inferior del cuerpo por debajo del diafragma. Localizar el hígado como un hito.
- Después del aislamiento de la región torácica del embrión, proceder a eliminar lados laterales de la pared del cuerpo, la columna vertebral y las cuchillas de aguja del corazón usando. Tenga cuidado al retirar el corazón para evitar dañar el tejido traqueal. Por último, con cuidado, separar el esófago de la tráquea tirando del esófago con ayuda de cuchillas de aguja. Mantener el tejido en solución de PBS sobre hielo.
- Coloque el tejido en 4 ml de tornillo viales de vidrio o tapa utilizando pipetas de transferencia. Fijar el tejido pulmonar traqueal en 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 30 min. Después de la fijación,enjuagar tejido con PBS. Al enjuagar, preparar la solución de X-gal tinción (añadir 5 mM K 3 Fe (CN) 6, (100 l de 0,5 M de valores) 5 mM de K 4 Fe (CN) 6 (100 l de 0,5 M de valores) 2 mM MgCl2, ( 20 l de reserva 1 M) 0,01% NaDOC (50 l 2% en acciones), 0,02% de NP 4 O (100 l 2% en acciones), 1 mg / ml de X-gal (500 l de 20 mg / Stock ml) y 9,13 ml de agua destilada para llevar a un volumen final de 10 ml).
- Eliminar cualquier resto de PBS y añadir 2 ml de solución de tinción X-gal al vial de vidrio. Colocar los viales en la bandeja en un agitador. tejidos de manchas de 1 a 2 horas en solución de tinción X-gal. Incubar el tejido en una solución de X-gal durante 4 horas para su posterior procesamiento y la inclusión.
- Detener la reacción tejidos de lavado en el 3% de dimetilsulfóxido-PBS. Enjuague en PBS, 3 veces durante 5 minutos cada lavado y almacenar en un 70% de etanol.
- Llenar cápsulas de Petri con una solución / PBS 1% de agarosa. Permitir agarosa para solidificar. El uso de pipetas de transferencia vidrio, colocar el tejido en co agarosaATED placas llenas de solución de PBS. Fotografiar su conjunto se monta utilizando un microscopio de disección. Seleccionar un filtro adecuado para campo claro.
- Para distinguir mejor los sitios de muestras del proceso de tinción X-gal para la inclusión en parafina y seccionamiento. Colocar las muestras en casetes de la pantalla fina.
- Para procesar las muestras para la inclusión en parafina utilizan un procesador automatizado y establecieron un ciclo corto de la siguiente manera: seis cambios de alcohol: 5 min primer cambio y 3 minutos por cada cambio restante. Tres cambios de xileno: 5 min primer cambio y 3 min próximos dos cambios. Los pasos anteriores se realizan a 30 ° C. Por último, realizar tres cambios de parafina a 62 ° C: 25 min, 8 min y 5 min.
- Orient muestras para incrustar con el tejido que se encuentra en la parte inferior plana de la incrustación de barco. Añadir con cuidado de parafina para llenar el barco de la incrustación. Enfriar inmediatamente en la placa fría de la incrustación de la estación hasta que se solidifica en parafina. Retire el bloque de empotrar barco. Usando un microtomo, generar 6 micras sreflexiones. secciones de montaje de diapositivas-pretratados y secar los portaobjetos en la diapositiva conjunto más caliente a 42 ° C durante 1 hora.
- Hornear se desliza durante la noche en un horno a 56 ºC. Colocar los portaobjetos en bastidores. Desparafinar desliza con tres cambios de 100% de xileno, 10 min cada uno. Utilización en la tinción platos llenos con 200 ml de xileno.
- Rehidratar diapositivas utilizando series EtOH graduada (100%, 70%, 50% y 30%, 1 min por paso) a PBS antes de la contratinción con rojo rápido nuclear durante 10 a 30 seg. Se lavan los portas con agua del grifo tres veces durante 5 minutos cada vez para eliminar el exceso de Nuclear Fast Red.
- Deshidratar las diapositivas en una serie graduada de EtOH (50%, 70% y 100% EtOH) antes del lavado en tres cambios de xileno (20 inmersiones en cada cambio) y la tapa de deslizamiento con los medios de montaje a base de xileno.
2. La tinción de lectina
- Diseccionar E13.5 y E14.5 traqueal tejido pulmonar como se describe en los pasos 1.1 a 1.4. El uso de pipetas de transferencia de vidrio lugar del tejido en viales con tapón de rosca. Fijar el tejido pulmonar traqueal con 2 ml dePFA solución al 2% durante la noche a 4 ° C. Después de la fijación, enjuague muestras en PBS tres veces durante 10 min cada lavado.
- Preparar tampón, por lo general un volumen final de 10 ml de solución de bloqueo. Añadir 0,1 g de BSA (1%) a 8 ml de PBS. Permitir BSA se disuelva. Añadir 0,2 ml de suero de cabra (2%) 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Se ajusta el volumen final a 10 ml con PBS. muestras de los bloques durante 1 h en 0,5 ml de tampón de bloqueo a temperatura ambiente.
- Retire el amortiguador de bloqueo usando una pipeta de transferencia y reemplazar con una solución de lectina compuesta de 50 g / l de lectina, suero de cabra al 10% y PBS. Utilice 250 l de solución de lectina por muestra. Incubar toda la noche a 4 ° C. Asegúrese de cubrir el vial de vidrio que contiene el tejido con papel de aluminio. Después de la incubación con solución de lectina, enjuague muestras en PBS tres veces durante 10 min.
- Coloque los explantes en placas de Petri recubierta de agarosa que contenían PBS suficiente para cubrir las muestras. Fotografiar su conjunto se monta utilizando un microscopio de fluorescencia de disección. Seleccione la appropfiltro piados para detectar la fluorescencia. Lectina PNA generalmente se acopla a GFP.
3. todo el montaje la tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal
- Aislar el tejido pulmonar traqueal, transferir a viales de tapón de rosca de vidrio de 4 ml y fijar durante la noche en PFA al 4%. E11.5 tejidos puede ser fijado en el 2% PFA. Almacenar en metanol al 100%. Las muestras pueden conservarse hasta varios meses a -20 ° C.
- Eliminar el metanol usando una pipeta de transferencia y permeabilizar las muestras usando un blanqueador de Dent (4 partes de metanol, 1 parte de DMSO y 1 parte de 30% de H 2 O 2) durante 2 horas. tejido de hidratos en una serie graduada de metanol diluido en PBS como sigue: 100% de metanol, 75% de metanol, 50% de metanol, 25% de metanol, 100% PBS. Incubar 10 min a la temperatura ambiente durante cada paso de hidratación.
- Tejido Block en reactivo de bloqueo al 0,5% diluido en PBS (ver Materiales para detalles) por dos horas a temperatura ambiente con agitación.
- Diluir el anticuerpo primario en el bloqueo desolución (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) y se incuban las muestras durante la noche a 4 ° C. muestras de lavado con PBS cinco veces a temperatura ambiente. Realizar cada lavado durante 1 hora.
- Aplicar anticuerpo secundario a una dilución 1: 500 en solución de bloqueo 0,5%. Seleccione cuidadosamente anticuerpos secundarios para evitar la unión entre los anticuerpos secundarios. Incubar toda la noche a 4 ° C en una habitación oscura. muestras de lavado tres veces para 20 min a temperatura ambiente. Deshidratar muestras en una serie graduada de metanol diluido en PBS como sigue: 25% de metanol, metanol 50% 75% de metanol, 100% de metanol, 10 min cada paso.
NOTA: Asegurarse de que las muestras permanecen cubiertos con papel de aluminio y minimizar la exposición a la luz. Tissue ahora se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas hasta que se fotografiaron. - Transferir las muestras de platos hechos a la medida de la etapa, eliminar el metanol y claro con aproximadamente 200 l de solución transparente de Murray 19,20 (2 partes de benzoato de bencilo, 1 parte de alcohol de bencilo) inmediatamente BEFformación de imágenes de mineral. Fotografía utilizando un microscopio confocal. Procesar y analizar la imagen usando el software de imágenes.
4. Proliferación Celular
- Inyectar ratones E11.5 embarazada intraperitoneal con una solución de BrdU a una concentración de 100 mg de BrdU / g de peso corporal. Sacrificar femenina tal como se describe en la sección 1 del protocolo y aislar embriones en E12.5 E13.5 o. El uso de hojas de cuchillo, cabezas especiales y la parte inferior del cuerpo por debajo de la cavidad torácica.
- Coloque el tejido torácica en 4 ml de tornillo viales de tapa y fijar en 1 ml de PFA al 4% durante la noche. muestras de lavado con PBS dos veces durante 5 min y se deshidratan muestras a través de una serie de etanol diluido en agua destilada hasta 70% de etanol como sigue: 30%, 50% y 70% de etanol, durante 5 min cada paso.
- Colocar las muestras en casetes de pantalla de tamaño mediano. tejido Proceso para la inclusión en parafina utilizando y el procesador automatizado. Establecer un ciclo de la siguiente manera: seis cambios de alcohol durante 8 minutos cada una, tres cambios de xileno durante 6 minutos cada uno, tres cHanges de parafina, durante 25 minutos, 9 minutos y 8 minutos.
- Incrustar en parafina orientando el tejido en la posición deseada para generar transversal 6 micras o secciones longitudinales como se describe en el apartado 1. Coloque las secciones en portaobjetos y permitir que el tejido se adhiera a deslizarse en la diapositiva conjunto más caliente a 42 ° C durante 1 hora.
- diapositivas de pasteles, en sus lados, durante la noche en un horno a 56 ° C. Colocar los portaobjetos en bastidores de plástico. diapositivas de-paraffinize por inmersión en tres cambios de 100% de xileno, 10 min por el cambio. Use 200 ml de xileno para sumergir completamente las diapositivas. Rehidratar diapositivas utilizando series EtOH graduada (100%, 70%, 50% y 30%, 5 min por paso con agitación) a PBS (5 min).
- Realizar la recuperación de antígenos usando tampón de citrato 10 mM, pH 6. Para preparar 100 ml de mezcla de tampón de citrato 18 ml de M de ácido cítrico monohidratado 0,1 y 82 ml de 0,1 M de citrato de sodio.
- Colocar las muestras en frascos de Coplin de plástico llenas de solución de recuperación de antígeno y de microondas durante 6,5 minutos a alta potencia. Añadir dislabrada agua para jarra Coplin para compensar tampón citrato-evaporada y recalentar a una potencia del 40% durante 6 min.
- Llene la jarra de Coplin arriba con agua, y volver a calentar de nuevo en marcha de 40% durante 6 min. tiempos de microondas pueden variar en función de microondas utilizado.
- Permitir que las diapositivas se enfríen durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de lavar portaobjetos en agua destilada durante 1 min, seguido de PBS durante 5 min. Después de que el lavado con PBS, los portaobjetos de bloque durante 2 horas en una solución que contiene TBS (2,425 g de base Tris y 8,765 g de NaCl diluido en 1 L de agua destilada) 10% de suero de burro y 1% de BSA de bloqueo.
- Añadir anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo (TBS que contenía 10% de suero burro y 1% de BSA). BrdU (marcador de la mitosis), Nkx2.1 (epitelio de las vías respiratorias), Sox9 (células que darán lugar a cartílago) y αSMA (células de músculo liso). Incubar los portaobjetos durante la noche, a 4 ° C. Utilice el método de superposición para conservar anticuerpos. Aplicar 180 l de anticuerpo a una junta y luego coloque diapositiva como si cubreobjetossilbido.
- Separar la junta sumergiendo portaobjetos en agua destilada. Después de la eliminación de la junta, lavar el anticuerpo primario no unido mediante la realización de seis lavados de 5 min con TBS que contiene 0,1% de Tween-20.
- Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo a una dilución de 1: 200, durante 1 hora a temperatura ambiente. Seleccionar anticuerpos secundarios con cuidado para evitar la unión no deseada entre ellos. Eliminar el anticuerpo secundario no unido mediante la realización de tres lavados de cinco minutos con TBS que contiene 0,1% de Tween.
- Lavado de los portaobjetos en la base M Tris 0,1 dos veces durante 5 min y luego 0,05 M Tris base de dos veces por 5 min. Las diapositivas se puede dejar en la base de Tris 0,05 M, mientras que coversliping utilizando medio de montaje con o sin DAPI (1,5 mg / ml). diapositivas de las tiendas en la carpeta de diapositivas a 4 ° C y proteger de la luz cubriendo carpeta con papel de aluminio.
- Visualizar las manchas y la fotografía utilizando un microscopio de fluorescencia automatizado. Contar las células marcadas y el total de células por campo fotografiado en20X y 40X para determinar las relaciones de la proliferación de células a las células totales.
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Representative Results
actividad / β-catenina vía
Se detectó tinción Whole mount Lac-Z en el tejido traqueal-pulmón de embriones aislados de reportero AXIN2 Lac -Z ratones 11. Sitios de tinción indican la actividad / β-catenina vía. El análisis de secciones de toda la tinción de montaje determinó que la actividad / β-catenina Wnt estaba presente en el mesénquima de la tráquea y en el mesénquima de las regiones periféricas de los pulmones en desarrollo. En los embriones WlsShhCre (en los que la secreción de ligandos Wnt desde el epitelio de las vías respiratorias fue abrogada) Lac-Z tinción fue casi ausente (Figura 1).
condensaciones mesenquimales en mesénquima traqueal
Un paso crítico en la condrogénesis es el proceso por el cual las células mesenquimales predestinados para dar rise al cartílago se condensan. Estas agregaciones apretadas de células se conocen como condensaciones mesenquimales. Para probar si la falta de cartílago observado en ratones WlsShhCre era debido a una ausencia de condensaciones mesenquimales, tejidos pulmonares traqueales de edades gestacionales E12.5 a E14.5 fueron teñidas con lectina PNA. En E13.5 y E14.5, la fluorescencia se detectó como bandas periódicas en el mesénquima traqueal en los sitios donde se formará el cartílago. La falta de fluorescencia detectable en el tejido traqueal de los embriones WlsShhCre indica que endodérmico Wnt de señalización al mesénquima traqueal es necesario para condensaciones mesenquimales (Figura 2).
especificación de células del tracto respiratorio
Todo el montaje de inmunofluorescencia de los tejidos pulmonares traqueales determinó el patrón de expresión de Sox9, Nkx2.1 y αSMA en E11.5. En el tejido traqueal, Sox9 expresión es el límiteed al mesénquima de la tráquea como una banda continua (flecha en la Figura 3A y B), mientras que en el desarrollo de pulmón Sox9 se observa en la periferia del epitelio respiratorio (puntas de flecha en la Figura 3A, B y C). Nkx2.1 presenta un patrón de expresión distinto restringido al epitelio de la tráquea del pulmón. La prevención de la secreción de ligandos Wnt de epitelio provoca la disminución de la expresión de Sox9 en mesénquima traqueal pero no afecta a la expresión de Sox9 en el epitelio pulmonar periférico. Expresión de αSMA no se detecta fácilmente en mesénquima traqueal, sin embargo se detectó tinción en el nivel de la laringe (flecha amarilla, la Figura 3) y el estómago (figura 3).
La proliferación celular en el desarrollo de la tráquea
Proliferación en el epitelio y el mesénquimade la tráquea se detectó después del marcaje in vivo de tejido con BrdU. Las secciones de tejido traqueal se tiñeron con anticuerpos que reconocen BrdU, Sox9 y αSMA. El perfil de la proliferación en el mesénquima traqueal indica que los niveles de células teñidas Sox9 proliferación de someterse a es mayor que el nivel de células teñidas αSMA sometidos a la proliferación. Este patrón de proliferación parece ser revertido en las tráqueas WlsShhCre (Figura 4).
Figura 1: Actividad / β-catenina Wnt es operativa en mesénquima traqueal tejido E13.5 traqueal de pulmón, aislado de AXIN2-LacZ y WlsShhCre:. Ratones AXIN2-lacZ, se tiñeron con X-gal (A y B). Las secciones de tejido traqueal de pulmón tiñeron por contraste con rojo rápido (A ', B'). Tenga en cuenta la falta de X-galtinción en WlsShhCre; ratones AXIN2-Lac-Z que demuestran la ausencia de actividad / β-catenina vía (B '). E14.5 tejidos de ratones AXIN2 LacZ teñidas con X-gal representa sitios de anillos cartilaginosos futuros (C); sin embargo, la actividad AXIN2 estaba restringida a la periferia (cabeza de flecha) de las condensaciones mesenquimales (flecha) (D). La barra de escala A, B y C = 500 micras; B ', D' y D = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la condensación. Mesenquimales en el desarrollo del tejido traqueal E13.5 explantes traqueal-pulmonares fueron teñidas con lectina PNA. Control de tejido traqueal que representa las regiones eran células mesenquimáticas condensadas se muestra (flechas A C). No se detectaron condensaciones mesenquimales en ratones WlsShhCre (B y la flecha en D). C y D representan más baja magnificación del tejido traqueal-pulmón se muestra en A y B. Barra de escala A y B = 1 mm; C y D = 2 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Patrón de expresión en todo precondrogénica montaje tráquea Nkx2.1 y tinción Sox9 se detectó en los explantes E11.5.. El panel A representa una imagen de un tejido de control, mientras que el panel B muestra una sección óptica de un tejido 20 micras control. Tenga en cuenta la falta de expresión mesenquimales de Sox9 en el tejido WlsShhCre (flecha en C), but mantenimiento de la expresión periférica de Sox9 (punta de flecha en C). se detectó tinción αSMA en niveles bajos en trachealmesenchyme de tejido E11.5 pero observa en la región de la laringe (punta de flecha amarilla en D y E), estómago (S) y restante tejido cardíaco (CT) (E). Nkx2.1 se expresa en el epitelio de la tráquea y los pulmones en desarrollo (D, E). Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Patrón de proliferación de las células de mesénquima precondrogénica secciones de E13.5 embriones se tiñeron con anti BrdU, Sox9 y el anticuerpo αSMA. Los paneles C y D son mayores aumentos de A B, respectivamente. Las líneas de puntos representan los límites del epitelio traqueal. Nota Sox9 células teñidas proliferativa (punta de flecha C) y αSMA manchado de proliferación celular (punta de flecha en D). T = tráquea, E = esófago. Barra de escala A y B = 50 m, C y D = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Acontecimientos que subyacen a la morfogénesis de las vías respiratorias no se entienden completamente, en particular los procesos necesarios para el modelado de las vías aéreas de conducción. Estudios anteriores han utilizado técnicas ex vivo en el que se cultivan los explantes en desarrollo en la interfase aire-líquido o incrustado en matrigel 21,22. Estos estudios han demostrado que los factores de crecimiento influyen en el patrón de la tráquea y el desarrollo de la formación de cartílago traqueal. Una limitación de estos estudios es que la arquitectura del tejido no se mantiene y, por lo tanto, puede que no bastante recapitular el proceso in vivo de la condrogénesis.
El enfoque que llevamos a cabo para estudiar el papel de la señalización de Wnt en el proceso de realización de las vías respiratorias de patrones incluidos en los estudios in vivo, junto con técnicas de tinción de montaje enteras, inmunofluorescencia y de imagen. X-gal tinción de todo el tejido montaje seguida por síctioning y contra-tinción, presenta ventajas con respecto a la tinción de secciones de parafina. Toda la tinción de montaje permite la detección directa de los sitios donde la actividad de Wnt / β-catenina está operativo. Además, el corte de los explantes teñidos determina los sitios precisos en el mesénquima en la que la actividad se encuentra como el desarrollo avanzado. Este último es una lectura mejor y precisa que la detección de la expresión de la enzima β-galactosidasa en secciones de parafina. Mientras que la actividad enzimática puede ser detectada en secciones, este procedimiento requerirá cryosections que no siempre serán fáciles de generar y no conserva la arquitectura de muestras pequeñas. Una limitación en el protocolo descrito en este documento, es que el procesamiento de las muestras para la inclusión en parafina después de toda la tinción de montaje causará una pérdida de la señal. Por lo tanto, las muestras tienen que permanecer más tiempo en solución X-gal y un ciclo más corto para la inclusión en parafina se deben utilizar para obtener una buena señal en secciones.
Por otra parte, todo procedimiento de inmunofluorescencia de montaje, modificado después de la técnica descrita por Ahnfelt-Ronne 23, permitió la visualización tridimensional de desarrollar traqueal y el tejido pulmonar, con un patrón de expresión definido de proteínas codificadas por factores de transcripción tales como Nkx2.1 y sox9. Cuando se desea, toda la tinción de montaje puede ser presentado como pilas z confocal asistida de imágenes, representando diferentes profundidades del tejido traqueal de pulmón. Mientras que las imágenes pequeñas explantes, la limpieza de los tejidos se debe realizar en una placa de la platina. Hemos utilizado metálica gruesapor encargo placas de etapa inferior con óptica donde las muestras se borran y la imagen. Esto evita la pérdida de material durante la transferencia de tejido pequeño después de despejar el paso. Si bien toda la inmunofluorescencia de montaje es una técnica adecuada para la tinción de tejido pequeña, reconocemos limitaciones a la técnica. En particular, se observó actuaciones diferentes de anticuerpos que reconocen el antígeno mejor en las secciones en lugar de todo el montaje. Este problema puede excluye la realización de la técnica si no hay anticuerpos alternativos están disponibles. También es posible que el uso de metanol y claro con Murray transparente puede tener un impacto negativo en la señal observada. En el futuro, vamos a probar otras soluciones de compensación no orgánicos y ajustar adecuadamente el protocolo para este fin 24. Una consideración final es que todo el montaje permitirá el estudio de un par de proteínas expresadas en un tejido en un momento dado.
Los informes anteriores han demostrado la utilidad deANP tinción de lectina para detectar condensaciones mesenquimales en las secciones de tejido traqueal 21,25. En el presente estudio, se presenta una metodología por la que la tinción se lleva a cabo en todo el montaje, lo que facilita una mejor visualización de las regiones de la tráquea en la que se formará el cartílago. Durante la realización de la atención tinción de lectina se debe colocar en el uso de la concentración apropiada de lectina para no sobre-mancha, como disponibles comercialmente PNA-lectina se acopla a GFP. Auto-fluorescencia del tejido puede oscurecer los resultados haciendo difícil distinguir las bandas correspondientes a mesenquimales condensaciones.
Por último, el etiquetado in vivo de tejido con BrdU seguido por el corte y la tinción de inmunofluorescencia es una técnica viable para determinar la proliferación de células que presenta ventajas sobre tinción típica y estática, como PPh3 o PCNA 26,27. Esta última técnica presenta limitaciones, como la tinción variará dependiendo de lafase del ciclo celular. Este problema se elimina por nuestra técnica descrita. La combinación de marcación in vivo seguido de la inserción, el corte y la inmunofluorescencia nos permitió determinar que los ligandos Wnt epitelial equilibrar la proliferación diferencial de Sox9 y α-SMA células que darán lugar a cartílago de la tráquea y el músculo 7 que expresan.
En resumen, un enfoque de técnica múltiple para estudiar el patrón de las vías respiratorias en desarrollo permite un análisis profundo de la función de señalización de Wnt en la realización de la morfogénesis de las vías respiratorias. Estos estudios determinaron los sitios precisos de Wnt / β-catenina en el tejido traqueal, así como la señalización inductiva e instructivo proporcionado por el epitelio traqueal que se requiere para la especificación, la proliferación diferencial de linajes de células traqueal mesénquima, así como la formación de cartílago. Nuestras direcciones futuras incluyen la optimización de toda la tinción de montaje para Wls recientemente identificadosgenes diana, así como a toda la realización de inmunofluorescencia de montaje en combinación con la tinción de lectina.
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Disclosures
"Los autores no tienen nada que revelar."
Acknowledgments
Reconocemos la ayuda de Mike y Matt Muntifering Kofron con la imagen confocal y Gail Macke con procedimientos histológicos. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud-NHLBI (K01HL115447 a DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
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