Summary
A utilização de ratinhos repórter acoplado ao conjunto de montagem e a secção de coloração, microscopia e ensaios in vivo facilita a análise dos mecanismos subjacentes à padronização normal do tracto respiratório. Aqui descrevemos a forma como estas técnicas contribuiu para a análise de sinalização Wnt durante o desenvolvimento traqueal.
Introduction
Desenvolvimento das vias respiratórias é iniciada por dia embrionário 9 (E9) com a aparência de células positivas Nkx2.1 no intestino anterior ventral endodérmica 1,2. Separação tubo esofágico-traqueal irá resolver por E11.5 quando os tubos podem ser distinguidos como entidades distintas, cada um rodeado por tecido mesenquimal 3. Sinalização Wnt desempenha um papel chave na especificação do tracto respiratório como supressão de WNT2 e Wnt2b, expressa pelo mesênquima esplânenico e eliminação de β-catenina do epitélio respiratório endodérmica irá resultar em agenesia pulmonar 4,5. Os nossos estudos anteriores determinaram que a eliminação do WLS, um receptor de mediar a secreção de carga de todos os ligandos de Wnt, a partir dos resultados do tracto respiratório em endoderme hipoplasia pulmonar, defeitos no desenvolvimento vascular pulmonar e mis-padronização do mesênquima traqueal 6,7. Estes dados sustentam a importância da cro epitelial-mesenquimalSS falar na diferenciação celular e especificações, como também foi demonstrado em outros estudos 8,9.
O estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento do pulmão depende genética, in vitro e técnicas ex vivo que nos permitiram compreender melhor os mecanismos de condução identidade respiratória 10-16. Culturas de explantes de pulmão inteiro na interfase líquido de ar têm sido amplamente utilizados para estudar os efeitos de fatores de crescimento nos estágios iniciais de pulmonar ramificação morfogênese 10,17,18. Enquanto este método é utilizado como leitura de alterações morfológicas, tais como ramificação morfogénese, e modulação da expressão do gene, que se limita ao estudo de fases iniciais do processo de desenvolvimento, como a cultura em si não suporta o desenvolvimento da vasculatura 17. Desenvolvimento da cartilagem traqueal requer tempos de incubação mais longos que podem ser não é compatível com esta técnica de cultura.
para analyze o papel da sinalização de Wnt durante a formação do trato respiratório, que se adaptaram técnicas padrão para atender as necessidades de nossos estudos embrionárias. Nós modificamos volumes, tempos de coloração, ciclismo de processamento para inclusão em parafina e tempo para o esclarecimento de tecido traqueal-pulmão. O principal objetivo de otimizar as técnicas descritas no presente estudo foi analisar os primeiros estágios de desenvolvimento traqueal em ratos que ocorrem a partir de E11 a E14.5. Usando os ratos repórter linha Axin2LacZ nós sites de determinada com precisão de atividade / β-catenina Wnt no mesênquima traqueal em desenvolvimento. Nós também se adaptaram procedimento de coloração lectina para o tecido traqueal montagem todo. Assim, fomos capazes de visualizar condensações mesenquimais e prever locais onde chondrogenesis terão lugar. Coloração de toda montagem e seções de tecido embrionário obtidas a partir de ratos WlsShhCre, juntamente com técnicas avançadas de microscopia, permitiu-nos a desvendar o papel de ligantes Wnt produzidos pelo traepitélio traqueal no padrão traqueal.
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Protocol
Os animais foram alojados em condições sem agentes patogénicos. Os ratos foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pela CCHMC Institutional Animal Care e Use Committee (Cincinnati, OH EUA). Os ratinhos utilizados ao longo destes estudos foram mantidas num fundo misto.
1. Montagem Total X-galactosidase Coloração
- Eutanásia fêmea grávida em E11.5 a E14.5, por inalação de CO 2. Coloque animais em CO 2 câmara, carregar a câmara com CO 2. Manter animais em câmara para mínimo de 5 min. Executar método secundário da eutanásia por deslocamento cervical.
- Limpo área abdominal com etanol (EtOH) a 70% e realizar uma laparotomia com uma única incisão na linha média abdominal. Utilize uma tesoura cirúrgica e padrão standard (serrilhadas reta) fórceps.
- Isolar cornos uterinos usando uma pinça e tesouras finas e imediatamente colocar o tecido na placa de Petri contendo refrigerados solução PBS. Manter o tecido em gelo até processopara isolamento de embriões.
- Isolar embriões de cornos uterinos. Dissecar tecido traqueal do pulmão embrionário usando microscópio de dissecação. Utilize uma pinça de ponta fina e uma tesoura para segurar e perfurar o tecido uterino e concepti liberando os embriões.
- Remover restantes membranas embrionárias. Com a ajuda de lâminas de agulha cortar a cabeça de embriões e menor parte do corpo abaixo do diafragma. Localize fígado como um marco.
- Após o isolamento da região torácica do embrião, prosseguir para remover os lados laterais da parede do corpo, coluna vertebral e coração utilizando lâminas de agulha. Tome cuidado ao remover o coração para evitar ferir o tecido traqueal. Finalmente, cuidadosamente, separar o esôfago da traqueia, puxando o esôfago com a ajuda de lâminas de agulha. Manter o tecido em solução de PBS em gelo.
- tecidos lugar em 4 ml parafuso frascos CAP usando vidro ou de transferência de pipetas. Fix tecido pulmonar traqueal em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS durante 30 min. Após a fixação,lavar o tecido com PBS. Ao lavar, preparar uma solução de X-gal coloração (adicionar 5 mM de K 3 Fe (CN) 6, (100 ul de 0,5 H da) 5 mM, K 4 Fe (CN) 6 (100 ul de estoque) mM de MgCl 0,5 m 2 2, ( 20 ul 1 M Stock) 0,01% NaDOC (50 ul de 2% estoque), 0,02% de NP 4 O (100 mL 2% estoque), 1 mg / ml de X-gal (500 ul de 20 mg / ml) e 9,13 ml de água destilada para levar a um volume final de 10 ml).
- Remover qualquer PBS restante e adicione 2 ml de solução de coloração X-gal para o frasco de vidro. Coloque os frascos no tabuleiro no shaker. tecidos mancha de 1 a 2 horas em solução de coloração com X-gal. Incubar o tecido em solução X-gal, durante 4 h para posterior processamento e incorporação.
- Suspender a reacção por tecidos de lavagem em 3% dimetilsulfóxido-PBS. Enxágüe em PBS, 3 vezes durante 5 minutos cada lavagem e armazenar em 70% de etanol.
- Encha placas de Petri com uma solução / PBS 1% de agarose. Permitir agarose para solidificar. Usando pipetas de transferência de vidro, coloque o tecido em co agaroseated placas cheias com solução de PBS. Fotografar as peças inteiras utilizando um microscópio de dissecação. Selecione o filtro apropriado para campo claro.
- Para melhor distinguir locais de amostras do processo de coloração X-gal para inclusão em parafina e corte. Colocar as amostras em cassetes de tela fina.
- Para processar amostras para inclusão em parafina usar um processador automatizado e criar um ciclo curto da seguinte forma: seis mudanças de álcool: 5 min primeira mudança e 3 min por cada mudança restante. Três mudanças de xileno: 5 min primeira mudança e 3 min próximas duas alterações. Os passos anteriores são realizadas a 30 ° C. Finalmente, execute três mudanças de parafina a 62 ° C: 25 min, 8 min e 5 min.
- amostras de orientar para a incorporação com o tecido deitado no fundo da incorporação de barco. Adiciona-se cuidadosamente parafina para encher o barco incorporação. Refrescar imediatamente na placa fria de incorporar estação até que solidifica parafina. Remova o bloco de incorporação barco. Utilizando um micrótomo, gerar 6 uM sexões. seções montar em-slides pré-tratados e slides secas na corrediça conjunto mais quente a 42 ° C por 1 hora.
- Asse desliza durante a noite em estufa a 56 ºC. Colocar as lâminas em racks. Desparafinar desliza com três mudanças de 100% de xileno, 10 min cada. Use coloração pratos cheios com 200 ml de xileno.
- Rehidratar lâminas através de série graduada de EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 1 min por passo) para PBS antes contracoloração com Fast Red nuclear por 10 a 30 seg. Lavar as lâminas com água da torneira de três vezes durante 5 min de cada vez para remover o excesso de Nuclear Fast Red.
- Desidratar slides em uma série EtOH graduada (50%, 70% e 100% EtOH) antes de lavagem em três mudas de xileno (20 mergulhos cada mudança) e tampa deslizando com meios de montagem com base xileno.
2. A lectina Coloração
- Dissecar tecido pulmonar E13.5 e E14.5 traqueal como descrito nas etapas 1.1 a 1.4. Usando pipetas de transferência de vidro tecido lugar em frascos com tampa de rosca. Fix tecido pulmonar traqueal com 2 ml desolução PFA 2% durante a noite a 4 ° C. Após a fixação, lavar amostras em PBS três vezes, durante 10 min cada lavagem.
- Preparar tampão, geralmente num volume final de 10 ml de solução de bloqueio. Adicionar 0,1 g de BSA (1%) a 8 ml de PBS. Permitir BSA para dissolver. Adicionar 0,2 ml de soro de cabra (2%) de 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Levar o volume final para 10 ml com PBS. amostras de blocos de 1 h em 0,5 ml de tampão de bloqueio à temperatura ambiente.
- Remover o tampão de bloqueio usando uma pipeta de transferência e substituir com lectina solução composta por 50 mg / mL de lectina, soro de cabra a 10% e PBS. Utilizar 250 ul de solução de lectina por amostra. Incubar durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de cobrir o frasco de vidro contendo tecido com folha de alumínio. Após a incubação com uma solução de lectina, lavar amostras em PBS três vezes durante 10 min.
- explantes lugar em agarose revestidas placas de petri contendo o suficiente PBS para cobrir amostras. Fotografar as peças inteiras utilizando um microscópio de dissecação de fluorescência. Selecione o appropriate filtro para detectar a fluorescência. Lectina de PNA é normalmente acoplada a GFP.
3. Monte Whole Imunofluorescência Coloração e microscopia confocal
- Isolar tecido pulmonar traqueal, a transferência para 4 ml frascos de vidro com tampa de rosca e corrigir durante a noite em 4% PFA. tecido E11.5 pode ser fixado em 2% PFA. Loja em metanol 100%. As amostras podem ser armazenadas até vários meses à temperatura de -20 ° C.
- Remover o metanol que usa a pipeta de transferência e permeabilizar amostras usando Bleach de Dent (4 partes de metanol, 1 parte de DMSO e 1 parte 30% H 2 O 2) durante 2 horas. Hidrato de tecido numa série graduada de metanol diluído em PBS como se segue: 100% de metanol, 75% de metanol, 50% de metanol, 25% de metanol, 100% de PBS. Incubar 10 min a temperatura ambiente, durante cada passo de hidratação.
- Bloco de tecido em reagente de bloqueio a 0,5% diluído em PBS (ver Materiais para detalhes) durante duas horas à temperatura ambiente com agitação.
- Diluir anticorpo primário em bloquearsolução (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) e incubar as amostras durante a noite a 4 ° C. Lavar as amostras com PBS cinco vezes à temperatura ambiente. Execute cada lavagem durante 1 h.
- Aplicar anticorpo secundário com uma diluição de 1: 500 em solução de bloqueio a 0,5%. Selecionar cuidadosamente anticorpos secundários para evitar a ligação entre os anticorpos secundários. Incubar durante a noite a 4 ° C em ambiente escuro. Lavar as amostras três vezes durante 20 min à temperatura ambiente. Desidratar amostras numa série graduada de metanol diluído em PBS como se segue: 25% de metanol, 50% de metanol de 75% de metanol, 100% de metanol, 10 min cada passo.
NOTA: Certifique-se de que as amostras permanecem cobertas com papel alumínio e minimizar a exposição à luz. Os tecidos podem agora ser armazenados a 4 ° C, durante várias semanas até fotografado. - Amostras de transferência para custom made placas de palco, remover o metanol e clara com aproximadamente 200 ml de solução clara de Murray 19,20 (2 partes de benzoato de benzilo, 1 parte Álcool benzílico) imediatamente befimaging minério. Fotografar usando um microscópio confocal. Processar e analisar imagem usando software de imagem.
Proliferação 4. celular
- Injectar ratinhos E11.5 grávida intra-peritoneal com uma solução de BrdU para uma concentração de 100 ug de BrdU / g de peso corporal. Sacrifício do sexo feminino como descrito na seção 1 do protocolo e isolar embriões em E12.5 ou E13.5. Usando lâminas de faca, cabeças especiais de consumo e menor parte do corpo abaixo cavidade torácica.
- Coloque o tecido torácica em 4 ml parafuso frascos cap e fixar em 1 ml de PFA 4% durante a noite. Lavar as amostras duas vezes com PBS durante 5 min e desidratar as amostras através de uma série de etanol diluído em água destilada até 70% de etanol do seguinte modo: 30%, 50% e 70% de etanol, durante 5 minutos cada passo.
- Colocar as amostras em cassetes tela de tamanho médio. Processo de tecido para inclusão em parafina utilizando e processador automatizado. Configurar um ciclo da seguinte forma: seis mudanças de álcool para 8 min cada, três mudanças de xileno para 6 min cada, três cHanges de parafina, por 25 min, 9 min e 8 min.
- Incorporar em parafina orientar o tecido na posição desejada para gerar 6 uM transversal ou cortes longitudinais, como descrito na secção 1. Colocar secções em lâminas e permitir que o tecido de aderir a deslizar na corrediça conjunto mais quente a 42 ° C durante 1 h.
- Asse lâminas, sobre os seus lados, durante a noite em estufa a 56 ° C. Colocar as lâminas em cabides de plástico. lâminas de-paraffinize por imersão em três mudas de 100% xileno, 10 min por mudança. Use 200 ml de xileno para submergir completamente os slides. Rehidratar lâminas através de série graduada de EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 5 minutos por passo com agitação) para PBS (5 min).
- Executar a recuperação de antigénio utilizando-se 10 mM de tampão de citrato, pH 6. Para preparar 100 ml de tampão de citrato de mistura 18 ml de ácido cítrico 0,1 M mono-hidratado e 82 ml de citrato de sódio 0,1 M.
- Colocar as amostras em frascos coplin de plástico cheios de solução de recuperação antigênica e microondas para 6,5 min a alta potência. Adicionar discultivada água para jar coplin para compensar-citrato evaporou-tampão e reaquecimento com potência de 40% para 6 min.
- Preencha frasco coplin ao topo com água e aquecer novamente no poder de 40% para 6 min. tempos de microondas pode variar de acordo com microondas utilizado.
- Permitir que as lâminas se arrefecer durante 20 min à temperatura ambiente antes de as lâminas de lavagem em água destilada durante 1 min, seguido de PBS durante 5 min. Após a lavagem com PBS, as lâminas do bloco, durante 2 horas numa solução contendo TBS (2,425 g de base Tris e 8,765 g de NaCl diluído em 1 L de água destilada) a 10% de soro de burro e 1% de BSA de bloqueio.
- Adicionar anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio (TBS contendo 10% de soro de burro e 1% de BSA). BrdU (marcador mitose), Nkx2.1 (epitélio das vias respiratórias), Sox9 (células que dão origem a cartilagem) e αSMA (células do músculo liso). Incubar as lâminas durante a noite, a 4 ° C. Use o método de sobreposição para conservar anticorpos. Aplicar 180 mL de anticorpo a uma junta e, em seguida, anexar slide como se a tampa deslizanteping.
- Retire a junta por imersão slides em água destilada. Após a remoção do anel de vedação, lavar o anticorpo primário não ligado através da realização de seis lavagens de 5 min com TBS contendo 0,1% de Tween-20.
- Incubar as lâminas com anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio a uma diluição de 1: 200, durante 1 h à temperatura ambiente. Selecione anticorpos secundários com cuidado para evitar indesejada de ligação entre eles. Remover anticorpo secundário não ligado através da realização de três de cinco lavagens minutos, com TBS contendo 0,1% de Tween.
- Lavar as lâminas em base de 0,1 M Tris duas vezes durante 5 minutos e, em seguida, 0,05 base de Tris duas vezes por 5 min. As lâminas podem ser deixados na base de 0,05 M Tris, enquanto coversliping usando meios de montagem com ou sem DAPI (1,5 ug / ml). lâminas Armazenar na pasta de slides a 4 ° C e proteger da luz, cobrindo pasta com folha de alumínio.
- Visualize coloração e fotografia utilizando um microscópio de fluorescência automatizado. Contagem de células marcadas e células totais por campo fotografadas em20X e 40X para determinar índices de proliferação de células de células totais.
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Representative Results
atividade / β-catenina Wnt
Whole montagem Lac-Z coloração foi detectado no tecido traqueal-pulmão de embriões isolados de repórter Axin2 Lac-Z ratos 11. Sites de coloração indicar atividade / β-catenina Wnt. Análise de secções de toda a coloração de montagem determinado que a actividade / β-catenina Wnt estava presente no mesênquima da traqueia e no mesênquima de regiões periféricas do pulmão em desenvolvimento. Em embriões WlsShhCre (em que a secreção de ligandos Wnt do epitélio das vias respiratórias foi revogada) Lac-Z de coloração foi quase ausente (Figura 1).
condensações mesenquimais em mesênquima traqueal
Um passo fundamental na condrogénese é o processo pelo qual as células mesenquimais destinado a dar rise à cartilagem condense. Estas agregações apertados de células são conhecidas como condensações mesenquimais. Para testar se a falta de cartilagem observada em ratinhos WlsShhCre foi devido a uma ausência de condensações mesenquimais, os tecidos do pulmão de traqueia de idades gestacionais E12.5 a E14.5 foram coradas com lectina PNA. Em E13.5 e E14.5, a fluorescência foi detectada como bandas periódicas no mesênquima traqueal em locais onde cartilagem irá ser formada. A falta de fluorescência detectável no tecido traqueal dos embriões WlsShhCre endodérmica indica que a sinalização de Wnt ao mesênquima traqueal é necessário para condensações mesenquimais (Figura 2).
especificação das células do trato respiratório
Whole imunofluorescência montagem dos tecidos pulmonares traqueais determinado o padrão de expressão de Sox9, Nkx2.1 e αSMA em E11.5. No tecido traqueal, expressão Sox9 é limiteEd para o mesênquima da traqueia como uma faixa contínua (seta na Figura 3A e B), enquanto que no pulmão em desenvolvimento Sox9 é observado na periferia do epitélio respiratório (cabeças de seta na Figura 3A, B e C). Nkx2.1 apresenta um padrão de expressão distinto restrito ao epitélio da traqueia do pulmão. secreção de prevenção de ligantes Wnt a partir do epitélio faz com expressão diminuída de Sox9 no mesênquima traqueal, mas não afeta a expressão Sox9 no epitélio pulmonar periférico. Expressão de αSMA não é facilmente detectado em mesênquima traqueal, no entanto, a coloração foi detectada ao nível da laringe (seta amarela, a Figura 3) e do estômago (Figura 3).
A proliferação celular no desenvolvimento de traqueia
A proliferação em epitélio e mesênquimada traqueia foi detectada após a marcação in vivo de tecido com BrdU. Secções de tecido traqueal foram coradas com anticorpos que reconhecem BrdU, Sox9 e αSMA. O perfil de proliferação no mesênquima traqueal indica que os níveis de células coradas Sox9 proliferação submetidos a é maior do que o nível de células coradas αSMA submetidos a proliferação. Este padrão de proliferação parece ser revertido em traquéias WlsShhCre (Figura 4).
Figura 1: Actividade / β-catenina Wnt é operativa no mesênquima tecido traqueal E13.5 traqueal do pulmão, isolado a partir de Axin2-LacZ e WlsShhCre:. Ratinhos Axin2-LacZ, foram coradas com X-gal (A e B). Secções de tecido traqueal do pulmão foram contra-coradas com vermelho rápido (A ', B'). Note-se a falta de X-galcoloração em WlsShhCre; ratinhos Axin2-Lac-Z, demonstrando a ausência de actividade / β-catenina Wnt (B '). Tecido de ratinhos E14.5 Axin2 LacZ coradas com X-gal descreve sítios de anéis cartilagíneos futuras (C); no entanto, a atividade Axin2 era restrito à periferia (cabeça de seta) das condensações mesenquimais (seta) (D). Barra de escala A, B e C = 500 mm; B ', D' e D = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. E13.5 explantes traqueal-pulmonares condensação mesenquimais no desenvolvimento do tecido traqueal foram coradas com lectina PNA. Tecido traqueal de controlo que descreve as regiões foram células do mesênquima condensada é mostrado (setas A C). Sem condensações mesenquimais foram detectados em ratinhos WlsShhCre (B e seta em D). C e D representam inferior ampliação de tecido traqueal-pulmão mostrado em A e B. Barra de escala A e B = 1 mm; C e D = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Padrão de expressão em todo prechondrogenic montar traqueia Nkx2.1 e coloração Sox9 foi detectado em explantes E11.5.. O painel A representa uma imagem de um tecido de controlo, enquanto que o painel B mostra uma secção óptica de um tecido 20 um controlo. Note-se a falta de expressão de Sox9 mesenquimal em tecido WlsShhCre (seta em C), BUt manutenção da expressão periférica de Sox9 (ponta de seta em C). αSMA coloração foi detectada em níveis baixos em tecido trachealmesenchyme de E11.5, mas observada na região da laringe (ponta de seta amarela em D e E), estômago (S), e mantendo o tecido cardíaco (TC) (E). Nkx2.1 é expressa no epitélio de desenvolver traqueia e pulmões (D, E). Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Padrão de proliferação celular no mesênquima prechondrogenic secções de embriões E13.5 foram coradas com anti BrdU, Sox9 e anticorpo αSMA. Os painéis C e D são ampliações mais elevadas de A B, respectivamente. As linhas pontilhadas representam os limites do epitélio traqueal. Nota celular Sox9 manchado proliferativa (seta C) e de proliferação celular manchado αSMA (ponta de seta em D). T = a traqueia, o esófago E =. Barra de escala A e B = 50 mm, C e D = 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Eventos subjacentes a morfogénese do tracto respiratório não são completamente compreendidos, em particular os processos necessários para a modelação das vias aéreas condutoras. Estudos anteriores têm utilizado técnicas ex vivo, em que explantes em desenvolvimento são cultivadas na interfase ar-líquido ou embebido em matrigel 21,22. Estes estudos têm mostrado como factores de crescimento influenciam o padrão da traqueia desenvolvimento e a formação de cartilagem traqueal. Uma limitação para estes estudos é o de que a arquitectura do tecido não é adequadamente mantida e, portanto, eles não podem perfeitamente recapitular o processo in vivo de condrogénese.
A abordagem que se comprometeu a estudar o papel da sinalização Wnt no processo de realização de vias aéreas padronização incluiu estudos in vivo, juntamente com técnicas de coloração de montagem integrais, imunofluorescência e de imagem. coloração X-gal de tecido toda montagem seguido por sectioning e contra-coloração, apresenta vantagens sobre a coloração de secções de parafina. coloração montagem inteira permite a detecção direta de locais onde a atividade de Wnt / β-catenina é operativa. Além disso, o seccionamento dos explantes manchadas determinados locais precisos no mesênquima em que a atividade foi localizado como desenvolvimento progrediu. O último é uma leitura melhor e preciso do que a detecção da expressão de enzima β-galactosidase em secções de parafina. Embora a actividade enzimática pode ser detectada em secções, este procedimento requer criocortes que não será sempre fácil de gerar e não pode preservar a arquitectura de amostras pequenas. A limitação no protocolo descrito neste documento, é que o processamento de amostras para inclusão em parafina depois de toda coloração montagem vai causar uma perda do sinal. Portanto, as amostras devem permanecer mais tempo na solução X-gal e um ciclo mais curto para inclusão em parafina deve ser utilizado para obter um bom sinal em secções.
Por outro lado, toda a imunofluorescência procedimento de montagem, modificado após a técnica descrita por Ahnfelt-Ronne 23, permitiu a visualização tridimensional de desenvolver traqueal e o tecido pulmonar, com um padrão de expressão definido de proteínas codificadas por factores de transcrição importantes, tais como e Nkx2.1 Sox9. Quando desejado, toda a coloração de montagem pode ser apresentado como pilhas z-aided confocal de imagens, que descreve a diferentes profundidades de tecido traqueal do pulmão. Enquanto imagiologia de pequenos explantes, compensação do tecido deve ser realizado numa placa de fase. Utilizamos metálica de espessuracustom made placas palco com fundo óptico onde as amostras são limpas e fotografada. Isso evita a perda de material durante a transferência de tecido pequena depois de limpar etapa. Enquanto toda imunofluorescência montagem é uma técnica adequada para a coloração de tecido pequena, reconhecemos limitações para a técnica. Em particular, observou-se desempenhos diferentes de anticorpos que reconhecem antigénio melhor nas secções em oposição a todo o monte. Este problema pode impedir o desempenho da técnica, se não há anticorpos alternativos estão disponíveis. É também possível que a utilização de metanol e com compensação de clara Murray pode ter um impacto negativo no sinal observado. No futuro, vamos testar outras soluções de compensação não-orgânicos e ajustar o protocolo adequadamente para esta finalidade 24. Uma consideração final é que toda a montagem vai permitir o estudo de algumas proteínas expressas num tecido em um determinado momento.
Relatórios anteriores demonstraram a utilidade dePNA lectina coloração para detectar condensações mesenquimais em cortes de tecido traqueal 21,25. No presente estudo, são descritos uma metodologia pela qual a coloração foi realizada em conjunto de montagem, o que facilita uma melhor visualização das regiões da traqueia em que a cartilagem irá ser formada. Durante a execução de cuidados coloração lectina deve ser colocado em uso a concentração apropriada de lectina não sobre-mancha, como disponível comercialmente PNA-lectina é acoplado a GFP. Auto-fluorescência do tecido pode obscurecer os resultados tornando difícil distinguir as bandas correspondentes a mesenquimais condensações.
Finalmente, a rotulagem in vivo de tecido com BrdU seguido de corte e coloração de imunofluorescência é uma técnica viável para determinar a proliferação de células que apresenta vantagens sobre a coloração típica e estático, como PPH3 ou PCNA 26,27. A última técnica apresenta limitações, como coloração irá variar dependendo dofase do ciclo celular. Este problema é eliminado por a técnica descrita. Combinando rotulagem in vivo seguida de incorporação, de corte e imunofluorescência nos permitiu determinar que epitelial Wnt ligantes equilibrar a proliferação diferencial de Sox9 e α-SMA células que darão origem a cartilagem da traqueia e músculo 7 expressando.
Em resumo, uma abordagem de múltiplos técnica para estudar o padrão do tracto respiratório desenvolvimento permite uma análise mais profunda do papel da sinalização de Wnt na condução morfogénese das vias aéreas. Estes estudos determinaram os locais precisos de Wnt / β-catenina no tecido traqueal, bem como a sinalização indutiva e instrutiva fornecida pelo epitélio traqueal que é necessária para a especificação, a proliferação de linhagens de células diferencial mesenquimáticas traqueal, bem como a formação de cartilagem. Nossos direções futuras incluem a otimização de toda a coloração de montagem para Wls recentemente identificadosgenes-alvo, bem como toda a realização imunofluorescência montagem em combinação com coloração com lectina.
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Disclosures
"Os autores não têm nada para revelar."
Acknowledgments
Nós reconhecemos a assistência de Mike Muntifering e Matt Kofron com imagem confocal e Gail Macke com os procedimentos histológicos. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 para DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
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