Summary
Bütün montaj bağlanmış raportör fareler ve bölüm boyama, mikroskopi ve in vivo deneylerde kullanımı solunum yolu normal model oluşturmanın altında yatan mekanizmaların analizi kolaylaştırır. İşte bu teknikler trakeal gelişimi sırasında Wnt sinyal analizine katkıda açıklar.
Introduction
Solunum yolu gelişimi ventral endodermal ön bağırsak 1,2 Nkx2.1 pozitif hücrelerin ortaya çıkması ile embriyonik gün 9 (E9) ile başlatılır. Tüpler ayrı varlıklar olarak ayırt edilebilir zaman Özofagus-trakeal tüp ayırma, E11.5 ile mezenkimal dokudan 3 çevrili her çözecektir. Wnt sinyal akciğer agenezisi 4,5 neden olur endodermal solunum epitel splanknik mesenkim ve β-katenin silinmesi ile ifade Wnt2 ve Wnt2b silinmesi gibi solunum yollarının tarifnamede önemli bir rol oynar. Daha önceki çalışmalar, akciğer hipoplazisi içinde Endodermal solunum yolu sonuçlarından, WLS, tüm Wnt ligandları bir kargo reseptör aracılık salgılanmasının o silinmesini tespit, pulmoner vasküler gelişim ve trakeal mezenşimin 6,7 mis-desen kusurları. Bu veriler epitelyal-mezenkimal cro önemini destekleyenAyrıca, başka çalışmalarda 8,9 gösterildiği gibi p, hücre farklılaşması ve tarifnamede söz.
Akciğer gelişiminin erken aşamalarında çalışma bize daha iyi solunum kimliğini 10-16 sürüş mekanizmaları anlamak için izin vitro ve ex vivo teknikleri, genetik dayanmaktadır. Hava sıvı interfaz tüm akciğer eksplant kültürleri yaygın morfolojilerinden 10,17,18 dallanma pulmoner erken dönemlerinde büyüme faktörlerinin etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bu yöntem morfolojik gibi dallanma morfolojilerinden olarak değişiklikler ve gen ifadesi modülasyon okuma olarak kullanılan iken, kültür kendisi damarsal 17 gelişimini desteklemek değil gibi, gelişim sürecinin erken aşamalarında çalışma ile sınırlıdır. trakeal kıkırdak gelişimi bu kültür tekniği ile uyumlu olabilir uzun inkübasyon süreleri gerektirir.
onu çözümlemesolunum yolu oluşumu sırasında Wnt sinyal e rolü, bizim embriyonik çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için standart teknikleri adapte olması. Biz hacimleri, boyama süreleri, trakea-akciğer dokusunun temizlenmesi için parafine ve zamanlama için işlem bisiklet değiştirdiniz. Bu çalışmada açıklanan teknikler optimize ana hedefi E14.5 için E11 gerçekleşecek farelerde trakeal gelişiminin erken aşamalarında analiz etmektir. Muhabir fareler hat Axin2LacZ gelişen trakeal mezenşimin Wnt / β-katenin aktivitesinin biz kesin kararlı siteleri kullanma. Biz de tüm montaj trakeal doku için lektin boyama işlemini adapte var. Böylece, mezenkimal terlemeyi görselleştirmek ve kondrogenezis yer alacak siteleri tahmin başardık. Bütün montaj ve gelişmiş mikroskopi teknikleri ile birleştiğinde WlsShhCre farelerden elde edilen embriyonik doku bölümlerinin, boyanması tra tarafından üretilen Wnt ligandların rolünü açıklayacak için bize izintrakea dokusunda CHEAL epitel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar patojenden bağımsız koşullarda barındırıldı. Fareler CCHMC Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Cincinnati, OH ABD) tarafından onaylanan protokollere göre ele alınmıştır. Bu çalışmaları boyunca kullanılan fareler karışık arka muhafaza edilmiştir.
1. Tüm Dağı X-galaktosidaz Boyama
- CO 2 inhalasyon yoluyla, E14.5 için E11.5 hamile kadın euthanize. CO 2 odasında hayvan yerleştirin CO 2 ile odasını şarj edin. 5 dakika, en az odası içinde hayvanları korumak. servikal dislokasyon ile ötenazi ikincil yöntemi gerçekleştirmek.
- etanol (EtOH)% 70 ve tek bir karın orta hat kesi ile laparotomi gerçekleştirmek Temiz karın bölgesi. cerrahi makas ve standart desen (düz serrat) forseps yararlanın.
- petri koyun hemen forseps ve ince makas kullanılarak rahim boynuzları izole etmek ve doku PBS solüsyonu soğutulmuş içeren. Devam kadar buz üzerinde doku korumakembriyoların izolasyonu.
- rahim boynuzları embriyolar izole edin. diseksiyon mikroskobu kullanılarak embriyonik trakea, akciğer dokusunun parçalara ayır. Tutun ve rahim dokusu delinme ve embriyoları serbest concepti için ince uçlu forseps ve makas yararlanın.
- embriyonik membranlar kalan çıkarın. embriyoların iğne bıçaklarının yardımı kesti baş ve diyaframın altında alt vücut kısmı ile. bir dönüm noktası olarak karaciğer bulun.
- Embriyonun göğüs bölgesinde izole edildikten sonra, vücut duvarı, omurga ve kalp kullanarak iğne bıçakların yan yüzüne çıkarmak için devam edin. trakeal doku yaralanmasını önlemek için kalbi çıkarırken özen gösterin. Son olarak, dikkatli bir şekilde, iğne kanatlarının yardımıyla yemek borusu çekerek trakeadan yemek borusu ayırın. Buz üzerinde PBS çözeltisi içinde doku bakımı.
- 4 ml yerleştirin doku cam veya transfer pipet kullanarak vida kapaklı küçük şişelerden. 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) trakeal akciğer dokusunun düzeltildi. Tespit edildikten sonra,PBS ile doku durulayın. Durulama sırasında, X-gal ile boyama çözeltisi (5 mM K3Fe (CN ekleme) 6, (100 ul, 0.5 M stok), 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 ul, 0.5 M stok), 2 mM MgCI2, (hazırlanması 20 ul 1 M stok),% 0.01 NaDOC (50 ul% 2 stoğu),% 0.02 NP 4 O (100 uL% 2 stoğu), 1 mg / ml X-gal (20 mg, 500 ul / ml stok) ve 9.13 mi 10 ml'lik bir nihai hacim) elde etmek için su damıtıldı.
- Kalan PBS çıkarın ve bir cam şişeye X-gal ile boyama çözeltisi 2 ml ekleyin. çalkalayıcıda tepsisine şişeleri yerleştirin. Leke dokular 1 X-gal ile boyama çözeltisi içinde saat ile 2. daha fazla işleme ve yerleştirilmesi için 4 saat için X-Gal çözeltisi doku inkübe edin.
- % 3, dimetil sülfoksit-PBS içinde yıkama dokuları reaksiyonu durdurun. 5 dakika boyunca PBS içinde% 70 etanol içinde her bir yıkama ve mağaza 3 kez yıkayın.
- bir% 1 agaroz / PBS çözeltisi ile Petri kapları doldurmak. agaroz katılaşmaya izin verin. Cam transferi pipetler kullanılarak, agaroz co doku yerleştirinPBS çözeltisi ile doldurulmuş ATED plakalar. diseksiyon mikroskobu kullanılarak tüm bağlar fotoğraf. Aydınlık için uygun filtre seçin.
- Daha iyi parafine ve kesit X-gal boyama işlemi örneklerinin siteleri ayırt etmek. İnce ekran kasetlerinde yer örnekleri.
- Altı alkol değişiklikler: 5 dk ilk değişim ve kalan her değişim başına 3 dakika parafine gömme için numuneler otomatik işlemci kullanmak ve aşağıdaki gibi kısa bir döngü kurmak işlemek için. Ksilen Üç değişiklikler: 5 dk ilk değişiklik ve 3 dk sonraki iki değişiklik. Önceki adımlar 30 ° C'de gerçekleştirilir. 25 dakikada, 8 dakika ve 5 dakika: Son olarak, 62 ° C 'de parafin üç değişiklikler yapar.
- Doku tekne gömme altındaki düz yalan ile gömme Orient örnekleri. Dikkatle gömme tekne doldurmak için parafin ekleyin. parafin katılaşır kadar istasyon gömme soğuk plaka üzerinde hemen soğutun. Tekneyi gömme blok çıkarın. Bir mikrotom kullanılarak, 6 mikron s oluşturmakections. ön işleme tabi-slaytlar ve 1 saat 42 ° C'de sıcak slayt sette kuru slaytlar Mount bölümleri.
- Fırında 56 ºC fırında gecede slaytlar. raflara slaytlar yerleştirin. Deparaffinize% 100 Ksilen üç değişiklikler, 10 dakika her slaytlar. Ksilen, 200 ml dolu yemekler boyama kullanın.
- 10 ila 30 saniye boyunca nükleer hızlı kırmızı ile karşıt önce PBS'de için kademeli EtOH serisi (% 100,% 70,% 50 ve% 30, adım başına 1 dakika) kullanılarak slaytlar rehidrate. musluk suyu ile 5 dakika Nükleer Hızlı Kırmızı fazlalığını ortadan kaldırmak için her zaman üç defa slaytlar durulayın.
- Ksilen merkezli montaj medya ile kayma Ksilen üç değişiklikleri yıkamadan önce bir kademeli EtOH serisinde slaytlar (% 50,% 70 ve% 100 EtOH) (20 dips her değişiklik) ve kapağı kurutmak.
2. Lektin Boyama
- adım 1.4 1.1 de tarif edildiği gibi E 13.5 ve E14.5 trakeal akciğer dokusunun teşrih. vidalı kapaklı şişeleri cam transferi pipetler yer dokusunu kullanarak. 2 ml ile trakea akciğer dokusunun Fix4 ° C'de bir gece% 2 PFA çözeltisi. Tespit edildikten sonra, PBS içinde 10 dakika her bir yıkama için üç kez numune yıkayın.
- tampon çözelti 10 ml, genellikle bir son hacim bloke hazırlayın. PBS 8 ml BSA (% 1) 0.1 g ekleyin. BSA çözmek için izin verin. keçi serumu (% 2), Triton X-100 (% 0.3) ve 0.03 ml 0.2 ml ilave edilir. PBS ile 10 ml nihai hacme getirmek. Oda sıcaklığında 0,5 blokaj tampon çözeltisi ml 1 saat blok örnekleri.
- Bir transfer pipeti kullanarak Bloklama tamponunu çıkarın ve lektin 50 ug / ml,% 10 keçi serumu ve PBS oluşan lektin çözeltisi ile değiştirin. örnek başına lektin çözeltisi 250 ul kullanın. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir. alüminyum folyo ile doku içeren cam şişe kapağı emin olun. Lektin çözeltisi ile inkübe edildikten sonra, 10 dakika boyunca PBS içinde üç kez örnekleri yıkayın.
- örnekleri karşılamak için yeterli PBS içeren agaroz kaplı petri kaplarına yerleştirin eksplantlar. Bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak tüm bağlar fotoğraf. approp seçinyaklaşımlarına yön filtre floresan algılamak için. Lektin PNA genellikle GFP kuple edilir.
3. Tüm Dağı İmmünofloresan Boyama ve Konfokal Mikroskop
- 4 ml'lik cam vidalı kapaklı şişeleri transfer ve% 4 PFA gecede düzeltmek, trakea, akciğer dokusu izole edin. E11.5 dokusu% 2 PFA sabitlenebilir. metanol içinde saklayın% 100. Numuneler -20 ° C'de birkaç ay kadar saklanabilir.
- Transfer pipeti kullanarak, metanolün çıkması ve 2 saat Dent Bleach (4 kısım metanol, 1 kısım DMSO ve 1 kısım% 30 H2O 2) kullanarak örnekleri geçirgenliği. şu şekilde PBS içinde seyreltilmiş metanol kademeli dizi Hidrat doku:% 100 metanol,% 75 metanol,% 50 metanol,% 25 metanol,% 100 PBS ile yıkandı. Hidrasyon her aşamasında oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkalayın.
- PBS içinde seyreltilmiş,% 0.5 bloke edici reaktif engelleme doku çalkalanarak oda sıcaklığında iki saat boyunca (ayrıntılar için Materyaller bakınız).
- engelleme birincil antikor seyreltinçözeltisi (SOX9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) ve 4 ° C'de bir gece örnekleri inkübe edin. oda sıcaklığında PBS beş defa yıkayın örnekler. 1 saat süre ile, her yıkama yapın.
- % 0.5 bloke edici çözelti içinde 500 oranında seyreltilmiş bir 1: ikincil antikor uygulayın. Dikkatle ikincil antikorlar arasında bağlayıcı önlemek için sekonder antikor seçin. karanlık bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Yıkama numuneler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca üç kez. şu şekilde PBS içinde seyreltilmiş metanol kademeli dizi örnekleri kurutmak:% 25 metanol,% 50 metanol% 75 metanol,% 100 metanol, 10 dakika, her bir adım.
NOT: Numuneler alüminyum folyo ile kaplanmış kalır emin olun ve ışığa maruz kalmasını en aza indirmek. fotoğraflandı kadar doku Birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. - Aktarım örnekleri özel Murray'in berrak çözelti yaklaşık 200 ul 19,20 (2 parça Benzil benzoat, 1 kısım Benzil alkol) hemen bef ile metanol ve net çıkarmak, sahne plakaları yapılan içincevher görüntüleme. konfokal mikroskop kullanılarak fotoğraflamak. Süreç ve görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüyü analiz.
4. Hücre Çoğalması
- Vücut ağırlığının 100 ug BrdU / g bir konsantrasyonda BrdU çözeltisi ile intraperitoneal olarak E11.5 hamile farelere enjekte edilir. E12.5 veya E13.5 embriyolar protokolünün 1. bölümünde anlatıldığı ve izole olarak kadın Kurban. Bıçak bıçakları, tüketim başkanları ve göğüs boşluğu altında vücudun alt kısmını kullanarak.
- 4 ml vida kapaklı küçük şişelerden torasik doku yerleştirin ve bir gecede% 4 PFA 1 ml düzeltmek. % 30,% 50 ve% 70 etanol, 5 dakika her adım için: yıkama 5 dakika boyunca PBS ile iki kez numune aşağıdaki şekilde% 70 etanol için distile su içinde seyreltildi, bir etanol dizi örnekleri dihidrat.
- orta boy ekran kasetlerde yer örnekleri. kullanılarak parafine ve otomatik işlemci için işlem dokusu. 8 dakika için alkol altı tazelenmiş her biri 6 dakika her biri üç Cı ksilen üç değişiklikleri aşağıdaki gibidir: bir döngü ayarlama25 dakikada, 9 dakika ve 8 dakika için parafin Hanges.
- 1 saat boyunca 42 ° C'de sıcak slayt grubu üzerinde kaymasına uymak için doku örneklerinin bölüm 1. bölümlerde tarif edildiği gibi 6 um enine ya da uzunlamasına bölümleri oluşturmak ve izin vermek için arzu edilen pozisyonda doku yönlendirme parafine yerleştirme.
- Fırında slaytlar, bunların iki tarafta, bir gece boyunca 56 ° C'de bir fırında. plastik raflara slaytlar yerleştirin. % 100 Ksilen üç değişiklikler, değişiklik başına 10 dakika batırılarak De-paraffinize slaytlar. tamamen slaytları batırmak için Ksilen 200 ml kullanın. PBS (5 dakika) kademeli EtOH serisi (% 100,% 70,% 50 ve% 30, çalkalama ile adım başına 5 dakika) kullanılarak slaytlar rehidrate.
- 0.1 M sitrik asit, 18 ml monohidre sitrat tampon karışımı, 100 ml 0.1 M sodyum sitrat 82 ml hazırlamak için, 10 mM sitrat tamponu, pH 6 kullanılarak antijen alımı gerçekleştirmek.
- yüksek güçte 6.5 dakika boyunca antijen alma çözeltisi ve mikrodalga ile dolu plastik coplin kavanozlara yerleştirin örnekleri. dis ekle6 dakika boyunca 40% güçte buharlaştınldı-sitrat tamponu ve tekrar ısıtma telafi etmek için Coplin kavanoza su sürülmüş.
- su ile üst ve 6 dakika 40% güçte daha yeniden ısıtmak için Coplin kavanoza doldurun. Mikrodalga süreleri, kullanılan mikrodalga göre değişebilir.
- kayar parçalar 5 dakika boyunca PBS, ardından 1 dakika için damıtılmış su içinde yıkanması slaytlar önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca soğumaya bırakın. PBS sonra TBS içeren çözelti (Tris baz 2.425 g, 1 damıtılmış su L ile seyreltilmiş NaCI 8,765 g),% 10 eşek serumu ve% 1 BSA bloke 2 saat blok slaytlar yıkayın.
- çözeltisi (% 10 eşek serumu ve% 1 BSA ihtiva eden TBS) bloke seyreltilmiş primer antikor ekleyin. BrdU (mitoz işaretleyici), Nkx2.1 (solunum yolu epitel), SOX9 ve αSMA (düz kas hücreleri) (hücreler kıkırdak yol verecektir). 4 ° C'de, gece boyunca slaytlar inkübe edin. antikorları korumak için bindirme yöntemi kullanın. bir conta antikor 180 ul uygulayın ve ardından kapak kayma sanki slayt eklemekping.
- damıtılmış su içine slaytlar batırarak conta ayırın. conta çıkarılmasından sonra TBS,% 0.1 Tween-20 ihtiva eden altı 5 dakika yıkama yapılarak, bağlanmamış birincil antikor yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, 1: 200 arasında bir seyreltme çözeltisi engelleme seyreltilmiş sekonder antikor ile slaytlar inkübe edin. aralarında istenmeyen bağlama önlemek için dikkatli bir şekilde ikincil antikorlar seçin. % 0.1 Tween içeren TBS ile üç ila beş dakikalık bir yıkama gerçekleştirerek Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak.
- 5 dakika boyunca iki kez 0.1 M Tris baz slaytlar yıkanır ve 5 dakika boyunca iki kez daha sonra 0.05 M Tris baz. veya DAPI (1.5 ug / ml) olmadan montaj medyayı kullanarak coversliping ederken Slaytlar 0.05 M Tris baz bırakılabilir. Mağaza, 4 ° C slayt klasöründeki slaytlar ve alüminyum folyo ile kaplayarak klasörü ışıktan korumak.
- boyama ve fotoğraf otomatik bir floresan mikroskop kullanılarak gözünüzde canlandırın. fotoğraflanan etiketli-hücreleri ve alan başına toplam hücreleri saymak20X ve 40X toplam hücrelere çoğalan hücrelerin oranlarını belirlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt / β-katenin etkinliği
Tüm montaj Lac-Z boyama raportör Axin2 Lac-Z fareler 11 izole edilmiş embriyolar, trakeal akciğer dokusunda tespit edilmiştir. boyama Yer Wnt / β-katenin etkinliğini gösterir. bütün montaj boyama bölgelerinin analizi Wnt / β-katenin aktivitesi trakea mezenşimin ve gelişmekte olan akciğerlerin periferal bölgelerinde mezenşimin mevcut olduğunu tespit ettik. (Solunum yolu epitel Wnt ligandları salgılanması iptal edilmiştir, burada) WlsShhCre embriyolar Lac-Z, boyama neredeyse yok (Şekil 1).
trakea mezenşimin mezenkimal Kondansasyonları
kondrogenezisi kritik bir adım mezenkimal hücreler r vermek için kaderde süreçtirimkb yoğunlaştırarak kıkırdak. Hücrelerin bu sıkı toplamalardan mezenkimal sıkıştırmaların olarak bilinir. WlsShhCre farelerde gözlenen kıkırdak yetersizliği PNA lektin ile boyanmıştır E14.5 gebelik yaşları E12.5 gelen mezenşimal sıkıştırmaların, trakeal akciğer dokularında yokluğu nedeniyle olup olmadığını test etmek için. E13.5 ve E14.5 anda, floresan kıkırdak oluşacak sitelerinde trakeal mezenşimin periyodik bantları olarak tespit edildi. WlsShhCre embriyoların trakeal dokusunda saptanabilir flüoresans eksikliği trakeal mezenşimin için endodermal Wnt sinyal mezenkimal sıkıştırmaların (Şekil 2) için gerekli olduğunu gösterir.
Solunum yolu hücre özellikleri
trakeal akciğer dokularının tüm montaj immünofloresan E11.5 de SOX9, Nkx2.1 ve αSMA ifadesi desen belirledi. Trakeal dokusunda, SOX9 ifade sınırı(Şekil 3A, B ve C ok başları) solunum epiteli çevresine görülmektedir gelişmekte akciğer SOX9 ise sürekli bir şerit olarak trakea mezenşimin için ed (Şekil 3A ve B ok). Nkx2.1 akciğer trakea epiteline sınırlı ayrı bir ifade desen sunar. epitelden Wnt ligandlar önlenmesi salgılama trakeal mezenşimin SOX9 azalmış ifade neden olur, ancak, periferik akciğer epitel SOX9 ifade etkilemez. ΑSMA İfadesi kolaylıkla trakea mezenşimin tespit edilmez, ancak boyama larinks (sarı ok, Şekil 3) ve mide (Şekil 3) seviyesinde tespit edildi.
Gelişmekte olan trakea hücre çoğalması
Epitel ve mezenşimin çoğalmatrakea BrdU ile doku in vivo etiketleme sonra tespit edildi. Trakea doku bölümleri BrdU, Sox9 ve αSMA tanıyan antikorlar ile boyandı. Trakea mezenşimin proliferasyon profili SOX9 olarak lekeli hücreler, uygulanan çoğalması seviyelerini proliferasyon geçiren αSMA boyanan hücrelerin seviyesinden daha yüksek olduğunu göstermektedir. Bu çoğalma desen WlsShhCre tracheas (Şekil 4) döndürülmesi gibi görünüyor.
Şekil 1: Wnt / β-katenin aktivitesi trakeal mezenşimin işlevsel olduğu Axin2-LacZ ve WlsShhCre izole E 13.5 trakeal akciğer dokusu. Axin2-LacZ fareler, X-gal (A ve B) ile boyanmıştır. Trakea, akciğer dokusunun Bölümleri ( 'B' A) hızlı kırmızı ile zıt. X-gal olmayışına dikkat edinWlsShhCre boyama, Wnt / β-katenin aktivitesi (B ') yokluğunu gösteren Axin2-Lac-Z fareleri. X-gal ile lekelenmiştir Axin2 LacZ farelerden E14.5 dokusu gelecek kıkırdak halkalarının (C) 'nin sitesi göstermektedir; Bununla birlikte, Axin2 aktivitesi mezenkimal sıkıştırmaların (ok) (D) çevresinin (ok başı) ile sınırlandırılmıştır. Ölçek çubuğu A, B ve C = 500 mikron; B ', D' ve D = 100 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Trakeal doku geliştirmek Mezenkimal kondansasyon E13.5 trakeal akciğer eksplantlar PNA lektin ile boyandı. Bölgelerini gösteren kontrol trakeal dokusu gösterilmiştir yoğunlaştırılmış mezenkimal hücreler (oklar A C). Resim mezenkimal kondensasyonları WlsShhCre farelerde tespit edildi (B ve D'de ok) edildi. C ve D, A ve B de gösterilen trakeal akciğer dokusunun düşük büyütme tasvir etmektedir. Ölçek çubuğu A ve B = 1 mm; C ve D = 2 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Ekspresyon paterni prechondrogenic tamamının trakea Nkx2.1 ve SOX9 boyama E11.5 eksplantlarında saptandı monte edilir. Panel B, 20 um kontrol dokusu bir optik bölüm gösterirken Panel A, bir kontrol dokusu bir görüntü gösterir. WlsShhCre dokuda SOX9 mezenşimsel ifadesinin eksikliğine (C ok), buSOX9 periferik ifade t bakımı (C ok ucu). αSMA boyama E11.5 doku trachealmesenchyme düşük düzeylerde tespit ancak laringeal bölgede gözlenen (D ve E san bir ok başı) olan, mide, (S) ve geri kalan kalp dokusu (BT) (E). Nkx2.1 nefes borusu ve akciğerler (D, E) geliştirmek epitelinde ifade edilir. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Prechondrogenic mezenşimin Hücre çoğalma desen E13.5 embriyo kesitleri anti BrdU, SOX9 ve αSMA antikor ile boyandı. Paneller C ve D A yüksek büyütme vardır B. Noktalı çizgiler trakeal epitel sınırlarını temsil etmektedir. SOX9 lekeli proliferatif hücre (ok başı C) ve αSMA lekeli proliferatif hücre (D ok başı) dikkat edin. T = trakea, E = yemek borusu. Ölçek çubuğu A ve B = 50 mikron, C ve D = 20 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Solunum yollarının morfojenezi yatan olaylar tamamen iletken solunum yollarının desen için gerekli özel işlemler anlaşılamamıştır. Daha önceki çalışmalar, gelişmekte olan eksplantlar hava-sıvı arayüz kültüre ya Matrigel 21,22 gömülü burada eks vivo teknikleri kullanmışlardır. büyüme faktörleri, gelişmekte trakea desenlendirme ve trakeal kıkırdak oluşumunu nasıl etkilediğini Bu çalışmalar göstermiştir. Bu çalışmalara bir sınırlama doku mimarisi düzgün muhafaza değil ve bu nedenle de oldukça kondrogenezisi in vivo sürecini özetlemek olmayabilir olmasıdır.
Biz hava yollarını yapma sürecinde Wnt sinyal rolünü incelemek üstlendi yaklaşım tüm montaj boyama teknikleri, immunfloresan ve görüntüleme ile birleştiğinde in vivo çalışmalar dahil desenleme. tüm montaj doku X-gal boyama se ardındanctioning ve karşı-boyama, parafin kesitlerinden boyanması üzerinde avantajlar sağlar. Tüm montaj boyama Wnt / β-katenin etkinliği ameliyat olan sitelerin doğrudan saptanması için izin verir. Ayrıca, lekeli eksplant kesit gelişme ilerledikçe aktivite bulunduğu buradaki mezenşimin hassas siteleri belirledi. ikinci parafin bölümlerinde β-galaktosidaz enzimin ekspresyonunun saptanması daha iyi ve doğru okuma olup. Enzimatik aktivite bölümlerinde tespit edilebilir iken, bu işlem, her zaman elde etmek kolay değildir ve küçük numunelerin normal yapı olabilir cryosections gerektirecektir. Bu yazıda anlatılan protokol bir sınırlama, sinyal kaybına neden olur bütün montaj boyamadan sonra parafine gömme için örneklerin bu işlem olduğunu. Bu nedenle, numuneler X-gal çözelti içinde daha uzun süre kalması gerekir ve parafine gömme için daha kısa bir döngü bölümlerinde iyi bir sinyal elde etmek için kullanılmalıdır.
Öte yandan, Ahnfelt-Ronne 23 tarafından tarif edilen teknik sonra değiştirilen tüm montaj immünofloresan prosedür, örneğin Nkx2.1 gibi önemli transkripsiyon faktörleri tarafından kodlanan bir protein tarif ifade düzenine sahip, trakeal, pulmoner dokunun geliştirilmesi üç boyutlu görüntüleme için izin verilen SOX9. Arzu edildiği zaman, bütün montaj boyama trakeal akciğer dokusunun farklı derinliklere gösteren, görüntü konfokal destekli Z yığınlar olarak sunulabilir. Küçük eksplantlar görüntüleme sırasında, doku temizleme sahne plaka yapılmalıdır. Biz kalın Metalik kullanılanNumuneler temizlenir ve görüntülü nerede özel optik alt evre plakaları yaptı. adımı temizledikten sonra küçük doku aktarımı yaparken bu malzemenin kaybını önler. tüm montaj immünofloresan küçük doku boyama için uygun bir teknik olmasına rağmen, biz tekniğine sınırlamaları kabul. Özellikle, bütün montaj karşı bölümlerde daha iyi bir antijeni tanıyan antikorların farklı performans görülmektedir. alternatif antikorlar mevcut değilse, bu sorun tekniğinin performansını engelleyebilir. Murray net ile metanol ve takas kullanımı gözlenen sinyalde olumsuz bir etkiye sahip olması da mümkündür. Gelecekte, diğer organik olmayan temizleme çözümlerini test edecek ve bu amaçla 24 düzgün protokolü ayarlayın. Son bir husus bütün montaj için tek bir belirli bir zamanda bir dokuda ifade edilen bir kaç protein bir çalışma sağlayacak olmasıdır.
Önceki raporlar yararlılığını göstermiştirPNA lektin boyama trakeal dokusunun 21,25 bölümler halinde mezenkimal terlemeyi algılamak için. Bu çalışmada, boyama kıkırdak oluşturulabilir; burada trakea bölgelerinin daha iyi bir görüntü kolaylaştıran bütün montaj bölgesi gerçekleştirildiği bir metot sunulmaktadır. ticari olarak temin edilebilen, PNA-lektin GFP bağlanmış olduğu gibi lektin boyama bakım performansı değil, aşırı leke lektin uygun konsantrasyonu kullanılarak yerleştirilmelidir birlikte. doku Otomatik floresan terlemeyi mezenkimal karşılık gelen bantları ayırt etmek zor hale sonuçları gizleyebilir.
Son olarak, kesit ve immünfloresan boyama takip BrdU ile doku in vivo etiketleme gibi PPh3 veya PCNA 26,27 olarak tipik ve statik boyanma üzerinde avantajlar sunuyor hücre çoğalmasını belirlemek için uygulanabilir bir tekniktir. İkinci teknik boyama bağlı olarak değişecektir gibi sınırlamalar sunulurHücre döngüsü aşaması. Bu sorun bizim açıklanan teknikle elimine edilir. , Gömme, kesit ve immünfloresans ardından in vivo etiketleme birleştiren bize epitel Wnt trakeal kıkırdak ve kas 7 sebebiyet verecek ifade hücreleri SOX9 ve α-SMA diferansiyel çoğalmasını dengelemek ligandları belirlemek için izin verdi.
Özetle, gelişen solunum yollarında desenlendirme okuyan bir çoklu-teknik yaklaşım havayolu morfolojilerinden yürütülmesinde Wnt sinyal rolü derin bir analiz sağlar. Bu çalışmalar, trakeal dokusunda Wnt / β-katenin kesin alanlarının yanı sıra tarifnamede, trakeal mesenkim hücresi soylarının ayırıcı proliferasyonu, hem de kıkırdak oluşumu için gerekli olan trakeal epitel sağladığı endüktif ve öğretici sinyal tespit edilmiştir. Gelecekteki yön son zamanlarda tanımlanmış WLS için tüm montaj boyama optimizasyonu dahilHedef genler gibi lektin boyama ile kombinasyon halinde performans bütün montaj immünofloresan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"Yazarlar ifşa hiçbir şey yok."
Acknowledgments
Biz histolojik prosedürleri ile Mike Muntifering ve konfokal görüntüleme ile Matt Kofron ve Gail Macke yardım kabul. Bu çalışma kısmen Sağlık-NHLBI National Institutes (DS K01HL115447) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
