Summary
Anvendelsen af reporter mus koblet til hele mount og sektion farvning, mikroskopi og in vivo assays letter analysen af mekanismer bag den normale mønsterdannelse i luftvejene. Her beskriver vi, hvordan disse teknikker bidraget til analyse af Wnt-signalering under tracheal udvikling.
Introduction
Udvikling luftvejene er initieret af embryonale dag 9 (E9) med fremkomsten af Nkx2.1 positive celler i den ventrale endodermal fortarm 1,2. Esophageal-trachealtube separation vil løse ved E11.5 når rørene kan skelnes som særskilte enheder, hver omgivet af mesenkymale væv 3. Wnt signalering spiller en central rolle i specifikationen af luftvejene som sletning af Wnt2 og Wnt2b ved splanknisk mesenkym og sletning af β-catenin fra endodermal respiratorisk epitel udtrykt vil resultere i lunge agenesi 4,5. Vores tidligere undersøgelser fastslået, at sletning af WLS, en last receptor medierer sekretion af alle Wnt-ligander, fra endodermale resultater luftveje i lungehypoplasi, defekter i pulmonal vaskulær udvikling og mis-mønster af tracheal mesenchym 6,7. Disse data understøtter betydningen af epitel-mesenchymale cross taler i celledifferentiering og specifikation, som det også er blevet vist i andre undersøgelser 8,9.
Undersøgelsen af de tidligste stadier af lunge udvikling er afhængig af genetiske, in vitro og ex vivo teknikker, der har givet os mulighed for bedre at forstå mekanismerne kørsel respiratorisk identitet 10-16. Hele lunge eksplantatkulturer på Air Liquide interfase er ofte blevet anvendt til at undersøge virkningerne af vækstfaktorer i tidlige stadier af pulmonal forgrening morfogenese 10,17,18. Mens denne metode anvendes som udlæsning af morfologiske ændringer, såsom forgrening morfogenese og genekspression modulation, det er begrænset til studiet af tidlige stadier af udviklingsprocessen, da kulturen ikke selv støtte udviklingen af karrene 17. Udvikling af tracheal brusk kræver længere inkubationstider, der kan være ikke kompatibel med denne kultur teknik.
at analyze rolle Wnt signalering under dannelsen luftveje, har vi tilpasset standardteknikker til at opfylde de behov, vores embryonale undersøgelser. Vi har ændret volumener, farvning gange, forarbejdning cykling for paraffin indlejring og timing for rydning af tracheal-lungevæv. Det vigtigste mål for at optimere de beskrevne teknikker i nærværende undersøgelse var at analysere de tidligste stadier af trachea udvikling hos mus, der finder sted fra E11 til E14.5. Brug af reporter mus linje Axin2LacZ vi præcist bestemte steder i Wnt / β-catenin aktivitet i udviklingslandene tracheal mesenkym. Vi har også tilpasset lectin farvningsprocedure for hele mount luftrør væv. Således var vi i stand til at visualisere mesenkymale fortætninger og forudsige steder, hvor chondrogenese vil finde sted. Farvning af hele mount og sektioner af fostervæv opnået fra WlsShhCre mus, kombineret med avancerede mikroskopi-teknikker, tilladt os at afsløre rolle Wnt ligander produceret af traCheal epitel i tracheal mønster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene blev huset i patogenfrie betingelser. Musene blev håndteret i overensstemmelse med protokoller godkendt af CCHMC Institutional Animal Care og brug Udvalg (Cincinnati, OH USA). Mus anvendt i alle disse undersøgelser blev opretholdt i en blandet baggrund.
1. Whole Mount X-galactosidasefarvning
- Euthanize gravide kvinder ved E11.5 til E14.5 ved CO2 inhalation. Placer dyr i CO 2 kammer, oplade kammer med CO 2. Oprethold dyr i kammer til mindst 5 min. Udfør sekundær fremgangsmåde til eutanasi ved cervikal dislokation.
- Ren abdominale område med ethanol (EtOH) 70% og udfører laparotomi med en enkelt abdominal midtlinjeincision. Udnyt kirurgiske sakse og standard mønster (lige savtakkede) pincet.
- Isoler livmoderhornene bruger pincet og fine sakse og straks placere væv i petriskål indeholdende kølet PBS løsning. Bevar væv på is indtil fortsættertil isolering af embryoer.
- Isoler embryoner fra uterine horn. Dissekere embryonisk trakeal lungevæv ved hjælp dissektionsmikroskop. Udnytte fin spids pincet og saks til at besidde og punktere livmodervæv og concepti frigive embryonerne.
- Fjern resterende embryonale membraner. Med hjælp fra nål knive skærer hovedet af embryoner og nedre kropsdel under mellemgulvet. Find lever som en milepæl.
- Efter isolering af bryst regionen af embryonet, videre til fjerne laterale sider af kroppen væg, ryg og hjerte ved hjælp nål klinger. Pas samtidig fjerne hjertet til at undgå skade tracheal væv. Endelig omhyggeligt, adskille spiserøret fra luftrøret ved at trække i spiserøret med hjælp fra nål klinger. Opretholde væv i PBS-opløsning på is.
- Placer væv i 4 ml skruelåg hætteglas bruger glas- eller overførselspipetter. Fix trakeal lungevæv i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 30 min. Efter fikseringSkyl vævet med PBS. Mens skylning, forberede X-gal-farvning opløsning (tilsættes 5 mM K3Fe (CN) 6, (100 pi 0,5 M stamopløsning) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 pi 0,5 M stamopløsning) 2 mM MgCl2, ( 20 pi 1 M lager) 0,01% NaDOC (50 pi 2% lager), 0,02% NP 4 O (100 pi 2% lager), 1 mg / ml X-gal (500 pi 20 mg / ml lager) og 9.13 ml destilleret vand for at bringe til et endeligt volumen på 10 ml).
- Fjerne eventuelle rester af PBS, og der tilsættes 2 ml X-gal-farvning løsning på hætteglasset. Placer hætteglas i bakke på shaker. Farv væv 1 til 2 timer i X-gal-farvning løsning. Inkuber vævet i X-gal-opløsning i 4 timer til yderligere behandling og forankring.
- Reaktionen standses ved vask væv i 3% dimethylsulfoxid-PBS. Skyl i PBS, 3 gange i 5 minutter hver vask og opbevares i 70% ethanol.
- Fyld petriskåle med en 1% agarose / PBS-opløsning. Tillad agarose at størkne. Brug glas overførselspipetter placere væv på agarose coated plader fyldt med PBS-opløsning. Fotografere hele underlag ved hjælp af en dissektionsmikroskop. Vælg passende filter for lysfelt.
- For bedre at skelne mellem steder af X-gal farvning proces prøver til paraffin indlejring og sektionering. Anbring prøverne i fine screen kassetter.
- For at behandle prøver til paraffin indlejring bruge en automatiseret processor og oprette en kort cyklus som følger: seks ændringer alkohol: 5 min første ændring og 3 min pr hver resterende forandring. Tre hold xylen: 5 min første ændring og 3 min næste to ændringer. De foregående trin udføres ved 30 ° C. Endelig udfører tre skift af paraffin ved 62 ° C: 25 min, 8 min og 5 min.
- Orient prøver til indlejring med væv liggende fladt på bunden af indlejring båd. tilsættes forsigtigt paraffin at fylde indlejring båden. Køl straks kold plade af indlejring station indtil paraffin størkner. Fjern blok fra indlejring båd. Ved hjælp af en mikrotom, generere 6 um stninger. Mount afsnittene om forbehandlede-dias og tørre glider på slide varmere sæt ved 42 ° C i 1 time.
- Bages glider natten over i ovnen ved 56 ºC. Placer dias i stativer. Afparaffiniser objektglas med tre skift af 100% xylen, 10 minutter hver. Brug farvning retter fyldt med 200 ml xylen.
- Rehydrere dias ved hjælp sorteres EtOH serien (100%, 70%, 50% og 30%, 1 min per trin) til PBS før modfarvning med Nuclear Fast Red i 10 til 30 sek. Skyl objektglassene med ledningsvand tre gange i 5 minutter hver gang for at fjerne overskud af Nuclear Fast Red.
- Dehydrer dias i en gradueret EtOH serie (50%, 70% og 100% EtOH) før vask i tre hold af xylen (20 dips hver ændring) og dæksel glider med Xylen baseret montering medier.
2. Lectin Farvning
- Dissekere E13.5 og E14.5 tracheal lungevæv som beskrevet i trin 1.1 til 1.4. Hjælp af glas overførselspipetter sted væv i skruelåg hætteglas. Fix trakeal lungevæv med 2 ml2% PFA-opløsning natten over ved 4 ° C. Efter fiksering skylles prøverne i PBS tre gange i 10 min hver vask.
- Forbered blokerende buffer, som regel et slutvolumen på 10 ml opløsning. Tilføj 0,1 g BSA (1%) til 8 ml PBS. Tillad BSA at opløse. Tilsæt 0,2 ml gedeserum (2%) 0,03 ml af Triton X-100 (0,3%). Bring slutvolumenet op på 10 ml med PBS. Blok prøver i 1 time i 0,5 ml blokerende buffer ved stuetemperatur.
- Fjern blokerende buffer under anvendelse af en overførsel pipette og erstatte med lectin opløsning omfattende 50 pg / pl af lectin, 10% gedeserum og PBS. Brug 250 pi lectin opløsning per prøve. Inkuber natten over ved 4 ° C. Sørg for at dække hætteglas indeholder væv med aluminiumsfolie. Efter inkubering med lectin-opløsning, skylles prøverne i PBS tre gange i 10 min.
- Place eksplantater i agarose belagt petriskåle indeholdende nok PBS til at dække prøverne. Fotografere hele underlag ved anvendelse af en fluorescens-dissektionsmikroskop. Vælg appropriate filter til påvisning af fluorescens. Lectin PNA er normalt koblet til GFP.
3. Hele Mount immunfluorescensfarvning og konfokal mikroskopi
- Isoler trakeal lungevæv, overførsel til 4 ml glas skruelåg hætteglas og løse natten over i 4% PFA. E11.5 væv kan fastgøres i 2% PFA. Opbevares i methanol 100%. Prøver kan opbevares i op til flere måneder ved -20 ° C.
- Fjerne methanol under anvendelse transfer pipette og permeabilisere prøver ved anvendelse Dent s Blegemiddel (4 dele methanol, 1 del DMSO og 1 del 30% H 2 O 2) i 2 timer. Hydrat væv i en gradueret serie af methanol fortyndet i PBS som følger: 100% methanol, 75% methanol, 50% methanol, 25% methanol, 100% PBS. Inkuber 10 min ved stuetemperatur under hvert trin af hydratisering.
- Blok væv i 0,5% blokerende reagens fortyndet i PBS (se Materialer for detaljer) i to timer ved stuetemperatur under omrøring.
- Fortynd primært antistof i blokerendeopløsning (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) og inkuber prøverne natten over ved 4 ° C. Vask prøver med PBS fem gange ved stuetemperatur. Udfør hver vask i 1 time.
- Påfør sekundært antistof ved en 1: 500 fortynding i 0,5% blokeringsopløsning. omhyggeligt udvælge sekundære antistoffer til at forhindre binding af sekundære antistoffer. Inkuber natten over ved 4 ° C i mørke rum. Vask prøverne tre gange i 20 min ved stuetemperatur. Dehydrer prøver i en gradueret serie af methanol fortyndet i PBS som følger: 25% methanol, 50% methanol 75% methanol, 100% methanol, 10 min hvert trin.
BEMÆRK: Sørg for, at prøverne forbliver dækket med aluminiumsfolie og minimere udsættelse for lys. Væv kan nu opbevares ved 4 ° C i adskillige uger, indtil fotograferet. - Overfør prøver at specialfremstillede fase plader, fjernelse af methanol og klar med cirka 200 ul Murray klar opløsning 19,20 (2 dele Benzyl benzoat, 1 del Benzylalkohol) straks BEFmalm billeddannelse. Fotografere under anvendelse af et konfokalt mikroskop. Bearbejde og analysere billedet ved hjælp imaging software.
4. Cell Proliferation
- Injicer E11.5 gravide mus intraperitonealt med en opløsning af BrdU i en koncentration på 100 ug BrdU / g legemsvægt. Sacrifice kvindelig som beskrevet i afsnit 1 i protokollen og isolere embryoner ved E12.5 eller E13.5. Brug knivblade, punktafgifter hoveder og nederste del af kroppen under brysthulen.
- Placer thorax væv i 4 ml skruelåg hætteglas og løse i 1 ml 4% PFA natten over. Vask prøver med PBS to gange i 5 minutter og dehydrerer prøver gennem en ethanol-serien fortyndet i destilleret vand op til 70% ethanol som følger: 30%, 50% og 70% ethanol, i 5 min hvert trin.
- Anbring prøverne i mellemstore skærmen kassetter. Proces væv til paraffin indlejring hjælp og automatiseret processor. Indstil en cyklus som følger: seks ændringer i alkohol for 8 min hver, tre ændringer af Xylen for 6 min hver, tre cNDRINGER af paraffin, i 25 min, 9 min og 8 min.
- Integrer i paraffin orientere vævet i ønsket position til at generere 6 um tværgående eller langsgående sektioner som beskrevet i afsnit 1. Anbring afsnittene om dias og tillade væv til at klæbe til at glide på slide varmere sæt ved 42 ° C i 1 time.
- Bake lysbilleder, på deres sider, natten over i ovn ved 56 ° C. Placer dias i plast bøjler. De-paraffinize slides ved nedsænkning i tre hold af 100% xylen, 10 min per ændring. Brug 200 ml xylen til helt nedsænkes dias. Rehydrere objektglas under anvendelse gradueret EtOH serien (100%, 70%, 50% og 30%, 5 min per trin med omrøring) til PBS (5 min).
- Udføre antigen-genvinding ved anvendelse af 10 mM citratpuffer, pH 6. Til fremstilling af 100 ml citratbuffer mix 18 ml 0,1 M citronsyre monohydrat og 82 ml 0,1 M natriumcitrat.
- Anbring prøverne i plast Coplin-skåle fyldt med antigen hentning løsning og mikrobølgeovn i 6,5 min ved høj effekt. Tilføj disdestilleret vand til Coplin-skål for at kompensere for fordampet-citratpuffer og genopvarmning ved 40% effekt i 6 min.
- Fyld Coplin-skål til toppen med vand, og genopvarmning igen ved 40% effekt i 6 min. Microwave tider kan variere baseret på mikrobølge anvendes.
- Tillad objektglas til afkøling i 20 minutter ved stuetemperatur før vask objektglassene i destilleret vand i 1 minut, efterfulgt af PBS i 5 min. Efter PBS vaske, blok objektglas i 2 timer i blokeringsopløsning indeholdende TBS (2,425 g Tris-base og 8,765 g NaCl fortyndet i 1 liter destilleret vand) 10% Donkey serum og 1% BSA.
- Tilføj primære antistoffer fortyndet i blokeringsopløsning (TBS indeholdende 10% Donkey serum og 1% BSA). BrdU (mitose markør), Nkx2.1 (luftveje epitel), Sox9 (celler, som vil give anledning til brusk) og αSMA (glatte muskelceller). Inkuber slides natten over ved 4 ° C. Brug overlay metode til at bevare antistoffer. Påfør 180 ul antistof til en pakning og derefter vedhæfte dias som om dækglasping.
- Frigør pakning ved at dyppe slides i destilleret vand. Efter fjernelse af pakningen, vaske ubundet primært antistof ved at udføre seks 5 minutters vaske med TBS indeholdende 0,1% Tween-20.
- Inkuber objektglassene med sekundært antistof fortyndet med blokerende opløsning ved en fortynding på 1: 200, i 1 time ved stuetemperatur. Vælg sekundære antistoffer forsigtigt for at undgå uønsket binding blandt dem. Fjerne ubundet sekundært antistof ved at udføre tre fem minutters vask med TBS indeholdende 0,1% Tween.
- Skylning af objektglas i 0,1 M Tris-base to gange i 5 min og derefter 0,05 M Tris-base to gange i 5 min. Slides kan efterlades i 0,05 M Tris base, mens coversliping hjælp montering medier med eller uden DAPI (1,5 ug / ml). Opbevar dias i slide mappe ved 4 ° C og beskyttet mod lys ved at dække mappe med aluminiumsfolie.
- Visualiser farvning og fotografi ved hjælp af en automatiseret fluorescens mikroskop. Tæl mærkede-celler og totale celler pr fotograferet på20X og 40X for at bestemme forhold mellem prolifererende celler til det totale antal celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt / β-catenin-aktivitet
Whole mount Lac-Z farvning blev påvist i trakeal-lungevæv af embryoner isoleret fra reporter Axin2 Lac-Z mus 11. Lokaliteter af farvning indikerer Wnt / β-catenin-aktivitet. Analyse af sektioner af hele mount-farvning bestemmes, at Wnt / β-catenin-aktivitet var til stede i mesenkym af luftrøret og i mesenkym af randområder i udviklingslandene lungerne. I WlsShhCre embryoner (hvor sekretion af Wnt-ligander fra epitelet i luftvejene blev ophævet) Lac-Z-farvning var næsten fraværende (figur 1).
Mesenkymale fortætninger i trachea mesenkym
Et kritisk trin i chondrogenese er den proces, hvorved mesenchymalceller skæbnesvangre at opnåelse rise til brusk kondens. Disse stramme sammenlægninger af celler er kendt som mesenkymale fortætninger. For at teste, om den manglende brusk observeret i WlsShhCre mus skyldtes en manglende mesenchymal kondensationer, tracheale lungevæv fra gestationsalder E12.5 til E14.5 blev farvet med PNA lectin. På E13.5 og E14.5, blev fluorescens påvist som periodiske bånd i luftrør mesenkym på steder, hvor brusk vil blive dannet. Manglende påviselig fluorescens i trakeale væv af WlsShhCre embryoer indikerer, at endoderm Wnt signalering til tracheal mesenkym er nødvendig for mesenchymale kondensationer (figur 2).
I luftvejene celle specifikation
Hele mount immunfluorescens af luftrør lungevæv bestemt udtryk mønster af Sox9, Nkx2.1 og αSMA på E11.5. I luftrør væv, Sox9 ekspression er grænseed til mesenkym af luftrøret som en kontinuerlig stribe (pil i figur 3A og B), mens i udviklingslandene lunge Sox9 observeres ved periferien af det respiratoriske epitel (pilespidser i figur 3A, B og C). Nkx2.1 præsenterer en distinkt ekspressionsmønster begrænset til epitelet i luftrøret i lungerne. Forebyggelse sekretion af Wnt-ligander fra epitel forårsager formindsket ekspression af Sox9 i tracheal mesenkym men påvirker ikke Sox9 ekspression i perifere lunge epitel. Ekspression af αSMA ikke let påvises i tracheal mesenkym, blev imidlertid farvning detekteret på niveau med strubehovedet (gul pil, figur 3) og mave (figur 3).
Celleproliferation i udviklingen trachea
Proliferation i epitel og mesenkymaf luftrøret blev påvist efter in vivo mærkning af væv med BrdU. Dele af trachea væv blev farvet med antistoffer, som genkender BrdU, Sox9 og αSMA. Proliferationen profil i luftrør mesenkym indikerer, at niveauerne af Sox9 farvede celler undergår proliferation er højere end niveauet for αSMA farvede celler undergår proliferation. Denne spredning mønster synes at blive omgjort WlsShhCre luftrør (Figur 4).
Figur 1: Wnt / β-catenin aktivitet er operativ i tracheal mesenkym E13.5 tracheal lungevæv, isoleret fra Axin2-LacZ og WlsShhCre:. Axin2-LacZ-mus blev farvet med X-gal (A og B). Sektioner af tracheal lungevæv blev modfarvet med fast red (A ', B'). Bemærk manglen på X-galfarvning i WlsShhCre; Axin2-Lac-Z-mus demonstrerer fravær af Wnt / β-catenin-aktivitet (B '). E14.5 væv fra Axin2 LacZ mus farvet med X-gal skildrer steder af fremtidige bruskspidserne ringe (C); dog var Axin2 aktivitet begrænset til periferien (pilespids) af mesenchymale kondensationer (pil) (D). Scale bar A, B og C = 500 um; B ', D' og D = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Mesenchymale kondens i at udvikle tracheal væv E13,5 tracheal-lunge-eksplantater blev farvet med PNA lektin. Kontrol luftrør væv afbilder regioner var mesenchymale celler kondenserede er vist (pilene A C). Ingen mesenkymale kondensationer blev påvist i WlsShhCre mus (B og pil i D). C og D afbilder lavere forstørrelse af tracheal-lungevæv vist i A og B. Scale bar A og B = 1 mm; C og D = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Expression mønster i prechondrogenic hele mount luftrøret Nkx2.1 og Sox9 farvning blev påvist i E11.5 eksplanteret.. Panel A viser et billede af et kontrolvæv, mens felt B viser en optisk sektion af en 20 um kontrolvæv. Bemærk den manglende mesenkymale ekspression af Sox9 i WlsShhCre væv (pil i C), but vedligeholdelse af perifer udtryk for Sox9 (pilespids i C). αSMA farvning blev detekteret i lave niveauer i trachealmesenchyme af E11.5 væv, men observeret i retningen strube region (gul pilespids i D og E), mave (S) og resterende hjertevæv (CT) (E). Nkx2.1 udtrykkes i epitel udvikle luftrør og lunger (D, E). Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Cell spredning mønster i prechondrogenic mesenkym Sektioner af E13,5 embryoer blev farvet med anti BrdU, Sox9 og αSMA antistof. Paneler C og D er højere forstørrelser af A B henholdsvis. Stiplede linjer repræsenterer grænserne af tracheal epitel. Bemærk Sox9 farves proliferativ celle (pilespids C) og αSMA farvet proliferativ celle (pilespids i D). T = luftrøret, E = spiserøret. Målestok A og B = 50 um, C og D = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arrangementer ligger til grund for morfogenese i luftvejene forstås ikke til fulde, navnlig de processer, der er nødvendige for mønsterdannelse af de ledende luftveje. Tidligere undersøgelser har anvendt ex vivo-teknikker, hvor udviklingslande eksplantater dyrkes ved luft-væske interfase eller indlejret i matrigel 21,22. Disse undersøgelser har vist, hvordan vækstfaktorer påvirker mønsterdannelse af den udviklende luftrøret og dannelsen af tracheal brusk. En begrænsning til disse undersøgelser er, at arkitekturen af vævet ikke er ordentligt vedligeholdt, og derfor kan de ikke helt rekapitulere in vivo processen med chondrogenese.
Den fremgangsmåde, som vi lover at behandle rolle Wnt signalering i processen med at gennemføre luftveje mønsterdannelse inkluderet in vivo studier kombineret med hele mount farvning fremstilles immunofluorescens og billeddannelse. X-gal-farvning af hele mount væv efterfulgt af sectioning og kontra-farvning, præsenterer fordele i forhold til farvning af paraffinsnit. Hele mount farvning giver mulighed for direkte påvisning af steder, hvor Wnt / β-catenin aktivitet er operative. Endvidere sektionering af de farvede eksplantater bestemmes præcise steder i mesenkym hvor aktiviteten var placeret som udvikling skred frem. Sidstnævnte er en bedre og nøjagtig udlæsning end påvisning af ekspression af β-galactosidase-enzym i paraffinsnit. Mens kunne påvises enzymatisk aktivitet i afsnit, vil denne procedure kræver kryosektioner der vil ikke altid være let at generere, og kan ikke bevare arkitekturen i små prøver. En begrænsning i protokollen beskrevet i dette papir, er, at behandling af prøver til paraffin indlejring efter hele mount farvning vil medføre et tab af signalet. Derfor prøver nødt til at forblive længere i X-gal-opløsning og en kortere cyklus for paraffin embedding bør anvendes til at opnå god signal på sektioner.
På den anden side, hele mount immunfluorescens procedure, modificeret efter teknikken beskrevet af Ahnfelt-Ronne 23, tilladt for tredimensionale visualisering udvikle luftrør og lungevæv, med en defineret ekspressionsmønster af proteiner kodet af vigtige transkriptionsfaktorer, såsom Nkx2.1 og Sox9. Når det ønskes, kan hele mount farvning præsenteres som konfokal-aided z stakke af billeder, der viser forskellige dybder af tracheale lungevæv. Mens billeddannelse små eksplantater, bør udføres clearing af vævet i en bordpladen. Vi udnyttede tyk metalliskspecialfremstillede stage plader med optisk bund hvor prøver cleares og afbildet. Dette forhindrer tab af materiale under overførsel lille væv efter clearing trin. Mens hele mount immunfluorescens er en egnet teknik til farvning af små væv, anerkender vi begrænsninger for teknikken. Især vi observerede uens opførelser af antistoffer, som genkender antigen bedre i afsnit i modsætning til hele mount. Dette problem kan til hinder for udførelsen af teknikken, hvis der ikke alternative antistoffer er tilgængelige. Det er også muligt, at brugen af methanol og clearing med Murray klare kan have en negativ indvirkning på signalet observeret. I fremtiden vil vi tester andre ikke-økologiske clearing løsninger og justere protokollen ordentligt til dette formål 24. En sidste overvejelse er, at hele mount vil tillade undersøgelse af nogle få proteiner udtrykt i et væv på et givet tidspunkt.
Tidligere rapporter har vist nytten afPNA lektin farvning at opdage mesenkymale fortætninger i sektioner af tracheal væv 21,25. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi en metode, hvorved farvningen blev udført i hele mount, hvilket letter en bedre visualisering af regionerne i luftrøret, hvor brusken vil blive dannet. Under udførelsen lectin-farvning pleje skal placeres i anvendelse af den passende koncentration af lektin til ikke over-plet, som kommercielt tilgængeligt PNA-lectin er koblet til GFP. Autofluorescens af vævet kan sløre resultaterne gør vanskeligt at skelne bånd svarende til mesenchymale kondensationer.
Endelig in vivo mærkning af væv med BrdU efterfulgt af sektionering og immunfluorescensfarvning er en mulig teknik til at bestemme celleproliferation, der præsenterer fordele i forhold typiske og statisk farvning såsom PPh3 eller PCNA 26,27. Sidstnævnte teknik viser begrænsninger, som farvning vil variere afhængigt afcellecyklus fase. Dette problem er elimineret ved vores beskrevne teknik. Kombinere in vivo mærkning efterfulgt af indlejring, sektionering og immunofluorescens tilladt os at bestemme, at epitelial Wnt ligander afbalancere den differentielle spredning af Sox9 og α-SMA udtrykkende celler, der vil give anledning til tracheal brusk og muskel 7.
Sammenfattende en multiple-teknik tilgang til at studere mønsterdannelse af den udviklende luftvejene giver mulighed for en dyb analyse af den rolle, Wnt signalering i ledende luftveje morfogenese. Disse undersøgelser bestemmes de præcise steder af Wnt / β-catenin i trakeale væv samt induktive og lærerigt signalering tilvejebringes af tracheal epitel, der er nødvendig for specifikation, differentiel proliferation af tracheal mesenchym celleafstamninger, samt bruskdannelse. Vores fremtidige retninger omfatter optimering af hele mount farvning for nylig identificerede WLSmålgener, såvel som at udføre hele mount immunofluorescens i kombination med lectin-farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"Forfatterne har intet at afsløre."
Acknowledgments
Vi anerkender bistand fra Mike Muntifering og Matt Kofron med konfokal billedbehandling og Gail Macke med histologiske procedurer. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 til DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
