Summary
Bruken av reporter mus koblet til hele mount og § flekker, mikroskopi og in vivo, letter analyse av mekanismene bak den normale fordelingen av luftveiene. Her beskriver vi hvordan disse teknikkene bidratt til analysen av Wnt signal under tracheal utvikling.
Introduction
I luftrøret utvikling blir initiert ved embryonisk dag 9 (E9) med utseendet av Nkx2.1 positive celler i den ventrale endodermal forutgående 1,2. Esophageal-trakealtuben separasjon vil løse ved E11.5 når rørene kan erklæres som atskilte enheter, hver omgitt av mesenchymale vev tre. Wnt signal spiller en nøkkelrolle i spesifikasjonen i luftveiene som sletting av Wnt2 og Wnt2b, uttrykt av innvoller mesenchyme og sletting av β-catenin fra endodermal respiratorisk epitel vil resultere i lunge agenesis 4,5. Våre tidligere studier fastslått at sletting av WLS, en last reseptor medierende utskillelse av alle Wnt ligander, fra endodermal luftveis resulterer i lunge Hypoplasia, defekter i pulmonal vaskulær utvikling og mis-mønstring av tracheal mesenchyme 6,7. Disse dataene støtter viktigheten av epitel-mesenchymale cross snakke i celledifferensiering og spesifikasjon, som det har også blitt vist i andre studier 8,9.
Studiet av de tidligste stadiene av lunge utvikling er avhengig av genetisk, in vitro og ex vivo teknikker som har tillatt oss å bedre forstå mekanismer som driver luft identitet 10-16. Hele lunge eksplantering kulturer på luften væske inter har vært mye brukt til å studere effekter av vekstfaktorer i tidlige stadier av lunge forgrening morphogenesis 10,17,18. Selv om denne metoden er brukt som avlesning av morfologiske endringer, for eksempel forgrening morphogenesis og genekspresjon modulering, er det begrenset til studiet av tidlige stadier av utviklingsprosessen, som kulturen i seg selv ikke støtter utviklingen av blodkar 17. Utvikling av tracheal brusk krever lengre inkubasjonstid som kan være ikke kompatible med denne kulturen teknikk.
til analyze rolle Wnt signal under luftveiene formasjon, har vi tilpasset standardteknikker for å møte behovene til våre embryonale studier. Vi har endret volum, farging ganger, prosessering sykling for parafin innebygging og timing for clearing av tracheal-lungevevet. Hovedmålet med å optimalisere teknikker beskrevet i denne studien var å analysere de tidligste stadiene av tracheal utvikling hos mus som finner sted fra E11 til E14.5. Bruke reporter mus linjen Axin2LacZ vi nettopp bestemte områder av Wnt / β-catenin aktivitet i utviklings tracheal mesenchyme. Vi har også tilpasset lektin flekker prosedyre for hele mount tracheal vev. Dermed var vi i stand til å visualisere mesenchymale condensations og forutsi områder hvor chondrogenesis vil finne sted. Farging av hele mount og deler av embryonale vev hentet fra WlsShhCre mus, kombinert med avanserte mikroskopi teknikker, tillot oss å avsløre den rollen Wnt ligander produsert av tracheal epitel i tracheal mønster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene ble huset i patogenfrie forhold. Mus ble håndtert i henhold til protokoller godkjent av CCHMC Institutional Animal Care og bruk Committee (Cincinnati, OH USA). Musene som ble benyttet i disse studiene ble opprettholdt i en blandet bakgrunn.
1. Hele Mount X-galaktosidase Farging
- Avlive gravid kvinne på E11.5 til E14.5, ved CO 2 innånding. Plasser dyr i CO 2 kammer, lade kammeret med CO 2. Opprettholde dyrene i kammeret for minimum 5 min. Utfør sekundær metode for aktiv dødshjelp ved halshugging.
- Ren mageområdet med etanol (EtOH) 70% og utføre laparotomi med en enkelt abdominal midtlinjesnitt. Utnytte kirurgisk saks og standard mønster (rett sagtannete) tang.
- Isoler livmor horn bruker pinsett og fine sakser og umiddelbart plassere vev i petriskål som inneholder kjølt PBS løsning. Oppretthold vev på is inntil fortsettertil isolering av embryoer.
- Isolere embryoer fra livmor horn. Dissekere embryonale tracheal lungevev ved hjelp dissekere mikroskop. Utnytte fin spiss pinsett og saks for å holde og punktere livmorvevet og concepti slippe embryoer.
- Fjern gjenværende embryonale membraner. Med hjelp av nål blader kutte hodet av embryoer og nedre del av kroppen under mellomgulvet. Finn leveren som et landemerke.
- Etter isolering av thorax-regionen av embryoet, videre å fjerne laterale sider av kroppsveggen, ryggrad og hjerte ved hjelp av nål kniver. Vær forsiktig når du fjerner hjertet for å unngå å skade tracheal vev. Til slutt, nøye, skiller spiserøret fra luftrøret ved å trekke i spiserøret med hjelp av nål bladene. Opprettholde vev i PBS-oppløsning på is.
- Place vev i 4 ml skrukork ampuller som bruker glass eller overføre pipetter. Fiks trakeal lungevev i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 30 min. Etter fiksering,skyll vev med PBS. Mens skylling, forberede X-gal fargeløsning (tilsett 5 mM K 3 Fe (CN) 6, (100 ul 0,5 M lager) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 ul 0,5 M lager) 2 mM MgCl2, ( 20 pl 1 M stam) 0,01% NaDOC (50 ul 2% lager), 0,02% NP 4 O (100 ul 2% lager), 1 mg / ml X-gal (500 ul av 20 mg / ml stam) og 9,13 ml destillert vann for å bringe til et sluttvolum på 10 ml).
- Fjern eventuelle gjenværende PBS og tilsett 2 ml X-gal farging løsning på hetteglass. Plasser hetteglassene i skuffen på shaker. Flekk vev 1 til 2 timer i X-gal fargeløsning. Inkuber vev i X-gal-løsning i 4 timer for videre prosessering og innstøping.
- Stopp reaksjonen ved å vaske vev i 3% dimetylsulfoksid-PBS. Skyll i PBS, 3 ganger i 5 min hver vask og butikken i 70% etanol.
- Fyll Petriskåler med en 1% agarose / PBS-oppløsning. La agarose å stivne. Ved hjelp av glass transfer pipetter, plasserer vevet på agarose corerte plater fylt med PBS løsning. Fotografere hele mounts bruker en dissekere mikroskop. Velg riktig filter for lysfelt.
- For bedre å skille områder av X-gal farging prosessprøver for parafin innebygging og seksjonering. Plasser prøver i fin skjerm kassetter.
- For å behandle prøver for parafin embedding bruke en automatisert prosessor og sette opp en kort syklus som følger: seks endringer av alkohol: 5 min første endringen og 3 min per hver gjenværende endring. Tre endringer av Xylen: 5 min første endringen og 3 min neste to endringer. De tidligere trinnene er utført ved 30 ° C. Til slutt utfører tre endringer av parafin ved 62 ° C: 25 min, 8 min og 5 min.
- Orient prøver for innebygging med vev ligger flatt på bunnen av embedding båt. legge nøye parafin for å fylle forsenkningen båten. Avkjøl umiddelbart på kald plate for å bygge stasjonen til parafin stivner. Fjern kvartal fra embedding båt. Ved hjelp av en mikrotom, generere 6 mikrometer seksjoner. Monter delene på forbehandlet-lysbilder og tørre lysbilder på lysbildet varmere sett ved 42 ° C i 1 time.
- Bake glir over natten i ovnen ved 56 ºC. Plasser lysbilder i rack. Deparaffinize glass med tre endringer av 100% xylen, 10 min hver. Bruk farging retter fylt med 200 ml xylen.
- Rehydrere lysbilder ved hjelp av gradert serie EtOH (100%, 70%, 50% og 30%, 1 min per trinn) til PBS før kontra med Nuclear Fast Red i 10 til 30 sek. Skyll lysbilder med vann fra springen tre ganger for 5 min hver gang for å fjerne overskudd av Nuclear Fast Red.
- Dehydrere lysbilder i en gradert EtOH serie (50%, 70% og 100% EtOH) før vask i tre endringer av Xylen (20 dips hver endring) og dekke slipping med Xylen basert montering media.
2. lektin Farging
- Dissekere E13.5 og E14.5 trakea lungevev som beskrevet i trinn 1.1 til 1.4. Ved hjelp av glass transfer pipetter sted vev i skrukork ampuller. Fix trakeal lungevev med 2 ml2% PFA løsning over natten ved 4 ° C. Etter fiksering, skylling prøvene i PBS tre ganger i 10 min hver vask.
- Forbered blokkeringsbuffer, vanligvis et sluttvolum på 10 ml oppløsning. Tilsett 0,1 g av BSA (1%) i 8 mL PBS. Tillat BSA å oppløse. Legg 0,2 ml geiteserum (2%) 0,03 ml Triton X-100 (0,3%). Sluttvolumet bringes til 10 ml med PBS. Blokkprøver i 1 time i 0,5 ml blokkeringsbuffer ved romtemperatur.
- Fjern blokkeringsbuffer ved hjelp av en overføring pipette og erstatte med lektin oppløsning bestående av 50 ug / ul av lectin, 10% geiteserum og PBS. Bruk 250 ul av lektin-løsning per prøve. Inkuber over natten ved 4 ° C. Sørg for å dekke hetteglass som inneholder vev med aluminiumsfolie. Etter inkubasjon med lektin-løsning, skylles prøvene i PBS tre ganger i 10 min.
- Plasser explants i agarose belagt petriskåler som inneholder nok PBS å dekke prøver. Fotografere hele mounts med en fluorescens-dissekere mikroskop. Velg hensiktsmessig filter for å oppdage fluorescens. Lektiner PNA er vanligvis koblet til GFP.
3. Hele Mount immunfluorescens Farging og konfokalmikroskopi
- Isoler tracheal lungevev, overføre til 4 ml glass skrukork ampuller og fikse overnatting i 4% PFA. E11.5 vev kan festes i 2% PFA. Oppbevares i metanol 100%. Prøver kan lagres i opptil flere måneder ved -20 ° C.
- Fjerne metanol ved hjelp av overførings pipette og permeabilize prøver ved hjelp av Dent Bleach (4 deler Metanol, en del DMSO og 1 del 30% H 2 O 2) i 2 timer. Hydrat vev i en gradert serie av metanol fortynnet i PBS som følger: 100% metanol, 75% metanol, 50% metanol, 25% metanol, 100% PBS. Inkuber 10 minutter ved romtemperatur i løpet av hvert trinn av fuktighet.
- Blokk vev i 0,5% blokkerende reagens fortynnet i PBS (se Materialer for detaljer) i to timer ved romtemperatur med omrøring.
- Fortynnet primær antistoff i blokkeringoppløsning (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) og inkubere prøvene over natten ved 4 ° C. Vask prøver med PBS fem ganger ved romtemperatur. Utfør hver vask for en time.
- Anvende sekundære antistoff ved en 1: 500-fortynning i 0,5% blokkeringsoppløsningen. Nøye velge sekundære antistoffer for å hindre binding mellom sekundære antistoffer. Inkuber over natten ved 4 ° C i et mørkt rom. Vaskeprøver tre ganger i 20 minutter ved romtemperatur. Dehydrere prøver i en gradert serie av metanol fortynnet i PBS som følger: 25% metanol, 50% metanol 75% metanol, 100% metanol, 10 min hvert trinn.
MERK: Pass på at prøvene er fortsatt dekket med aluminiumsfolie og minimere eksponering for lys. Vev kan lagres ved 4 ° C i flere uker til fotografert. - Overfør prøvene til skreddersydde scenen plater, fjerne metanol og klar med ca 200 ul Murray klar løsning 19,20 (2 deler benzylbenzoat, en del benzylalkohol) umiddelbart BEFmalm bildebehandling. Fotografere ved hjelp av en konfokal mikroskop. Bearbeide og analysere bildet ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer.
4. Cell Proliferation
- Injiser E11.5 gravide mus intra-peritonealt med en oppløsning av BrdU ved en konsentrasjon på 100 ug BrdU / g kroppsvekt. Offer kvinne som beskrevet i punkt 1 i protokollen og isolere embryoer ved E12.5 eller E13.5. Ved hjelp av knivblad, avgifts hoder og nedre del av kroppen under brysthulen.
- Plasser thorax vev i 4 ml skrukork ampuller og fikse i 1 ml 4% PFA natten. Vask prøver med PBS to ganger i 5 min og tørke prøvene gjennom en Etanol serie fortynnet i destillert vann opp til 70% etanol som følger: 30%, 50% og 70% etanol, i 5 min hvert trinn.
- Plasser prøver i medium størrelse skjermen kassetter. Prosess vev for parafin embedding hjelp og automatisert prosessor. Sett opp en syklus som følger: seks endringer av alkohol for 8 min hver, tre endringer av Xylen for 6 min hver, tre cHanges av parafin, til 25 min, 9 min og 8 min.
- Bygge inn i parafin orientere vevet i ønsket posisjon til å generere seks mikrometer tverrgående eller langsgående profiler som beskrevet i punkt 1. Plasser seksjoner på lysbilder og la vevet å følge skli på lysbildet varmere sett ved 42 ° C i 1 time.
- Bake lysbilder, på sine sider, over natten i ovn ved 56 ° C. Plasser lysbilder i plast kleshengere. De-paraffinize lysbilder ved nedsenkning i tre endringer på 100% Xylen, 10 min per endring. Bruk 200 ml xylen helt dukke lysbilder. Rehydrere lysbilder ved hjelp av gradert serie EtOH (100%, 70%, 50% og 30%, 5 min per trinn med omrøring) til PBS (5 min).
- Utføre antigen gjenfinning ved hjelp av 10 mM citratbuffer, pH 6. For å fremstille 100 ml citratbuffer blanding 18 ml av 0,1 M sitronsyre monohydratisert og 82 ml av 0,1 M natrium-citrat.
- Plasser prøver i plast Coplin krukker fylt med antigen henting løsning og mikrobølgeovn for 6,5 min ved høy effekt. Legg disdestillert vann til Coplin jar å kompensere for fordampet-citratbuffer og Varm på 40% effekt i 6 min.
- Fyll Coplin krukke til toppen med vann, og varme opp igjen ved 40% effekt i 6 min. Mikrobølgeovn ganger kan variere basert på mikrobølge brukt.
- La lysbilder avkjøles i 20 minutter ved romtemperatur før vaske lysbilder i destillert vann i 1 min, etterfulgt av PBS i 5 min. Etter PBS-vask, blokk lysbilder i 2 timer i blokkeringsløsning inneholdende TBS (2,425 g Tris-base og 8,765 g NaCl fortynnet i 1 liter destillert vann) 10% Esel serum og 1% BSA.
- Legg primære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning (TBS inneholdende 10% Esel serum og 1% BSA). BrdU (mitose markør), Nkx2.1 (luftrøret epitel), Sox9 (celler som vil gi opphav til brusk) og αSMA (glatte muskelceller). Inkuber lysbilder over natten ved 4 ° C. Bruk overlegg metode for å spare antistoffer. Påfør 180 mL av antistoff mot en pakning og deretter legge lysbilde som om dekkglassping.
- Ta pakningen ved å dyppe lysbilder i destillert vann. Etter fjernelse av pakningen, vaskes ubundet primære antistoffet ved å utføre seks 5 min vaskinger med TBS inneholdende 0,1% Tween-20.
- Inkuber objektglass med sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning ved en fortynning på 1: 200, i 1 time ved romtemperatur. Velg sekundære antistoffer nøye for å hindre uønsket binding mellom dem. Fjerne ubundet sekundært antistoff ved å utføre tre fem-minutters vaskinger med TBS inneholdende 0,1% Tween.
- Vask objektglass i 0,1 M Tris-base to ganger i 5 min og deretter 0,05 M Tris-base to ganger i 5 min. Lysbilder kan etterlates i 0,05 M Tris-base, mens coversliping med festemateriale med eller uten DAPI (1,5 ug / ml). Lagre lysbilder i lysbilde mappe ved 4 ° C og beskyttes mot lys ved å dekke mappe med aluminiumsfolie.
- Visualiser flekker og fotografi ved hjelp av en automatisert fluorescens mikroskop. Count merkede-celler og celler totalt per felt fotografert på20X og 40X for å finne ut prosenter av voksende celler til totale celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt / β-catenin aktivitet
Whole mount Lac-Z farging ble påvist i luftrør-lungevev embryoer isolert fra reporter Axin2 Lac-Z mus 11. Nettsteder av flekker indikerer Wnt / β-catenin aktivitet. Analyse av deler av hele monterings flekker fastslått at Wnt / β-catenin aktivitet var til stede i den mesenchyme av luftrøret, og i mesenchyme av perifere regioner av utviklings lungene. I WlsShhCre embryoer (der utskillelsen av Wnt ligander fra epitel luftveiene ble avskaffet) Lac-Z flekker var nesten fraværende (figur 1).
Mesenchymale condensations i tracheal mesenchyme
Et kritisk punkt i chondrogenesis er prosessen der mesenchymalceller skjebnebestemt til å gi rise til brusk kondensere. Disse tette samlinger av celler er kjent som mesenchymale kondensasjoner. For å teste om mangelen på brusk observert i WlsShhCre mus skyldes et fravær av mesenchymale condensations, tracheal lunge vev fra svangerskaps alderen E12.5 til E14.5 ble farget med PNA lektin. På E13.5 og E14.5, ble fluorescens detektert som periodiske band i tracheal mesenchyme på steder der brusken vil bli dannet. Mangel på detekterbar fluorescens i luftrør vev av WlsShhCre embryoer indikerer at endodermal Wnt signalering til luftrør mesenchyme er nødvendig for mesenchymale kondensasjoner (figur 2).
Luftveiene celle spesifikasjon
Hele mount immunfluorescens av tracheal lunge vev bestemt uttrykk mønster av Sox9, Nkx2.1 og αSMA på E11.5. I tracheal vev, er Sox9 uttrykk grenseed til mesenchyme av luftrøret som en kontinuerlig stripe (pilen i figur 3A og B), mens i den tredje lunge Sox9 observeres ved periferien av det respiratoriske epitel (piler i figur 3A, B og C). Nkx2.1 viser en tydelig uttrykk mønster begrenset til epitelet i luftrøret til lungene. Å hindre sekresjon av wnt ligander fra epitelet fører til redusert ekspresjon av Sox9 i tracheal mesenchyme men påvirker ikke Sox9 ekspresjon i omkrets lungeepitelet. Ekspresjon av αSMA er ikke lett oppdages i tracheal mesenchyme, ble imidlertid farging detektert ved nivået av strupehodet (gul pil, figur 3) og mage (figur 3).
Celleproliferasjon i utviklingen av trachea
Spredning i epitel og mesenchymeav trachea ble detektert etter in vivo merking av vev med BrdU. Deler av tracheal vev ble farget med antistoffer som gjenkjenner BrdU, Sox9 og αSMA. Proliferasjonen Profilen i trakea mesenchyme indikerer at nivået av Sox9 fargede celler som gjennomgår spredning er høyere enn nivået av αSMA fargede celler som gjennomgår proliferasjon. Dette spredning mønsteret ser ut til å bli tilbakestilt om WlsShhCre luftrør (figur 4).
Figur 1: Wnt / β-catenin aktivitet er operativ i trakea mesenchyme E13.5 tracheal lungevev, isolert fra Axin2-LacZ og WlsShhCre:. Axin2-lacZ-mus ble farget med X-gal (A og B). Deler av tracheal lungevev ble kontra med rask rød (A ', B'). Legg merke til mangelen på X-galflekker i WlsShhCre, Axin2-Lac-Z mus som viser fravær av Wnt / β-catenin aktivitet (B). E14.5 vev fra Axin2 LacZ mus farget med X-gal viser områder av fremtidige bruskringer (C); imidlertid, ble Axin2 aktivitet begrenset til periferien (pilhode) av mesenchymale kondensasjoner (pil) (D). Målestokk A, B og C = 500 um; B ', D' og D = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Mesenchymale kondens i å utvikle tracheal vev E13.5 tracheal-lunge explants ble farget med PNA lektin. Kontroll tracheal vev viser regionene var mesenchymalceller kondensert vises (piler A C). Ingen mesenchymale condensations ble oppdaget i WlsShhCre mus (B og bue i D). C og D viser lavere forstørrelse av tracheal-lungevev vist i A og B. Scale bar A og B = 1 mm; C og D = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Uttrykk mønster i prechondrogenic hele montere luftrøret Nkx2.1 og Sox9 farging ble påvist i E11.5 explants.. Panel A viser et bilde av en styre vev, mens Panel B viser en optisk seksjon av en 20 mikrometer kontroll vev. Legg merke til mangel på mesenchymale uttrykk for Sox9 i WlsShhCre vev (pil i C), but vedlikehold av perifer ekspresjon av Sox9 (pilspiss i C). αSMA farging ble påvist ved lave nivåer i trachealmesenchyme av E11.5 vev, men observert i den laryngeale region (gul pilspiss i D og E), mage (S) og gjenværende hjertevev (CT) (E). Nkx2.1 er uttrykt i epitel for utvikling av luftrøret og lungene (D, E). Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Celleproliferering mønster i prechondrogenic mesenchyme Deler av E13.5 embryoer ble farget med anti BrdU, Sox9 og αSMA antistoff. Paneler C og D er høyere forstørrelser av A B. Stiplede linjer representerer grensene av tracheal epitel. Merk Sox9 farget proliferative celle (pilspiss C) og αSMA farget proliferative celle (pilspiss i D). T = luftrør, E = spiserør. Scale bar A og B = 50 mikrometer, C og D = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hendelser som ligger til grunn morfogenese i luftveiene er ikke helt forstått, spesielt de prosesser som er nødvendige for mønstring av de ledende luftveier. Tidligere studier har benyttet ex vivo teknikker, hvor utviklings explants dyrkes på luft-væske interfase eller innebygd i matrigel 21,22. Disse studiene har vist hvordan vekstfaktorer påvirker fordelingen av den tredje luftrøret og dannelse av tracheal brusk. En begrensning til disse studiene er at arkitekturen av vevet ikke er riktig vedlikeholdt, og derfor kan de ikke helt rekapitulere in vivo fremgangs chondrogenesis.
Tilnærmingen at vi påtok seg å studere rollen av Wnt signal i ferd med å gjennomføre luftveiene mønster inkludert in vivo studier kombinert med hele mount fargeteknikker, immunfluorescens og bildebehandling. X-gal farging av hele mount vev etterfulgt av seg selvctioning og mot flekker, presenterer fordeler i forhold til farging av parafinsnitt. Hele mount farging gir mulighet for direkte påvisning av nettsteder der Wnt / β-catenin aktivitet er operative. Videre seksjonering av de fargede explants bestemt presise steder i mesenchyme der aktiviteten ble plassert som utviklingen gikk fremover. Sistnevnte er en bedre og nøyaktig avlesning enn deteksjon av ekspresjon av β-galaktosidase-enzym i parafinsnitt. Mens enzymatisk aktivitet kunne påvises i seksjoner, vil denne prosedyren krever frysesnitt som ikke alltid vil være lett å lage og kan ikke bevare arkitekturen av små prøver. En begrensning i protokollen er beskrevet i denne artikkelen, er at behandling av prøver for parafin embedding etter hele mount farging vil føre til tap av signal. Derfor prøver må forbli lenger i X-gal-løsning og bør brukes en kortere syklus for parafin innebygging for å oppnå godt signal på seksjonene.
På den annen side, hel montere immunofluorescens prosedyre, modifisert etter den teknikk som er beskrevet av Ahnfelt-Ronne 23, tillates for tridimensional visualisering for å utvikle tracheal og pulmonalt vev, med en ekspresjon definert mønster av proteiner som kodes av nøkkeltranskripsjonsfaktorer som Nkx2.1 og Sox9. Når det er ønsket, kan hele montere flekker bli presentert som konfokale assistert z stabler av bilder, som viser forskjellige dybder av tracheal lungevevet. Mens avbilding av små eksplantater, bør rydding av vevet bli utført i et trinn plate. Vi utnyttet tykk metalliskskreddersydde scene plater med optisk bunnen der prøvene er ryddet og avbildes. Dette hindrer tap av materialet ved overføring liten vev etter å fjerne trinn. Mens hele mount immunfluorescens er en egnet metode for farging av liten vev, erkjenner vi begrensninger i teknikken. Spesielt observerte vi ulike forestillinger av antistoffer som gjenkjenner antigen bedre i seksjoner i motsetning til hele mount. Dette problemet kan være til hinder for utførelsen av teknikken dersom alternative antistoffer er tilgjengelige. Det er også mulig at bruk av metanol og clearing med Murrays klart kan ha en negativ innvirkning på signalet observert. I fremtiden vil vi teste andre ikke-organiske clearing løsninger og justere protokollen riktig for dette formålet 24. En avsluttende vurdering er som helhet montere tillater studiet av noen proteiner som uttrykkes i et vev ved en gitt tid.
Tidligere rapporter har vist nytten avPNA lektin flekker å oppdage mesenchymale condensations i deler av tracheal vev 21,25. I den foreliggende undersøkelse, avdekker en metode ved hjelp av hvilken farging ble utført i hel montering, noe som muliggjør en bedre visualisering av de områder av luftrøret, karakterisert ved at brusk vil bli dannet. Mens du utfører lektin flekker forsiktighet bør plasseres i å bruke passende konsentrasjon av lectin å ikke over-flekken, som er kommersielt tilgjengelig PNA-lectin er koblet til GFP. Auto-fluorescens av vevet kan tilsløre resultatene gjør vanskelig å skille bånd tilsvarende mesenchymale kondensasjoner.
Til slutt, in vivo merking av vev med BrdU fulgt av seksjonering og farging immunofluorescens er en mulig teknikk for å bestemme celle-proliferasjon som presenterer fordeler i forhold til vanlig, og statisk flekker slik som PPh3 eller PCNA 26,27. Den sistnevnte teknikk presenterer begrensninger, som flekker vil variere avhengigcellesyklustrinn. Dette problemet elimineres ved vår beskrevne teknikk. Kombinere in vivo merking fulgt ved å bygge, seksjonering og immunfluorescens mulig for oss å fastslå at epitelial Wnt ligander balansere differensial spredning av Sox9 og α-SMA uttrykke celler som vil gi opphav til tracheal brusk og muskel 7.
Oppsummert en multippel-teknikk tilnærming til å studere fordelingen av utviklingsluftveiene gir en dyp analyse av rollen Wnt signal i å gjennomføre luftveis morphogenesis. Disse studier fastslått den nøyaktige områder av Wnt / β-catenin i luftrør vev, så vel som induktive og læresignal levert av trakeal epitel som er nødvendig for spesifikasjon, differensial spredning av tracheal mesenchyme celle linjer, så vel som bruskdannelse. Våre fremtidige retninger inkluderer optimalisering av hele mount farging for nylig identifiserte WLSmålgener, så vel som å utføre helhet montere immunofluorescens i kombinasjon med lektin-farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"Forfatterne har ikke noe å avsløre."
Acknowledgments
Vi erkjenner hjelp av Mike Muntifering og Matt Kofron med confocal bildebehandling og Gail Macke med histologiske prosedyrer. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 til DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
