Summary
L'uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l'analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all'analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale.
Introduction
Lo sviluppo delle vie respiratorie è avviata da embrionali giorno 9 (E9) con la comparsa di cellule positive Nkx2.1 nel endodermico ventrale foregut 1,2. Esofago-tracheale separazione tubo si risolverà da E11.5 quando i tubi possono essere distinte come entità distinte, ognuna circondata dal tessuto mesenchimale 3. Wnt svolge un ruolo chiave nella specifica delle vie respiratorie come l'eliminazione di Wnt2 e Wnt2b, espressa dal mesenchima splancnico e la cancellazione di β-catenina dal epitelio respiratorio endodermico si tradurrà in agenesia del polmone 4,5. I nostri studi precedenti hanno stabilito che la cancellazione di WLS, un recettore carico mediazione secrezione di tutti i ligandi Wnt, dai risultati del tratto respiratorio endodermico a ipoplasia polmonare, difetti di sviluppo vascolare polmonare e mis-patterning del tracheale mesenchima 6,7. Questi dati supportano l'importanza del cro epitelio-mesenchimaless parlare nel differenziamento cellulare e specifica, come è stato mostrato anche in altri studi 8,9.
Lo studio delle prime fasi di sviluppo del polmone si basa su genetica, in vitro ed ex vivo tecniche che hanno permesso di comprendere meglio i meccanismi di guida identità respiratoria 10-16. Intere culture espianto polmone all'interfase liquido dell'aria sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di fattori di crescita nelle prime fasi di polmonare branching morfogenesi 10,17,18. Mentre questo metodo è usato come lettura dei cambiamenti morfologici, come morfogenesi di ramificazione, e la modulazione dell'espressione genica, è limitato allo studio delle prime fasi del processo di sviluppo, la cultura stessa non supporta lo sviluppo di vascolarizzazione 17. Sviluppo di tracheale cartilagine richiede tempi di incubazione più lunghi che possono essere non compatibili con questa tecnica di coltura.
per Analyze il ruolo di segnalazione Wnt durante la formazione del tratto respiratorio, abbiamo adattato le tecniche standard per soddisfare le esigenze dei nostri studi embrionali. Abbiamo modificato i volumi, i tempi di colorazione, trattamento ciclismo per paraffina e la tempistica per la compensazione del tessuto tracheale-polmonare. L'obiettivo principale di ottimizzare le tecniche descritte nel presente studio è stato quello di analizzare le prime fasi di sviluppo tracheale nei topi che si svolgono da E11 a E14.5. Utilizzando il topo giornalista linea Axin2LacZ noi siti precisamente determinati di attività / β-catenina Wnt in via di sviluppo mesenchima tracheale. Abbiamo anche adattato procedura di colorazione lectina per tutto il tessuto tracheale monte. Così, siamo stati in grado di visualizzare condensazioni mesenchimali e prevedere siti dove chondrogenesis avrà luogo. La colorazione di tutto il monte e sezioni di tessuto embrionale ottenuti da topi WlsShhCre, insieme con tecniche di microscopia avanzate, ci ha permesso di svelare il ruolo di ligandi Wnt prodotte dal TRAepitelio endotracheale nella trachea patterning.
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Protocol
Gli animali sono stati alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni. I topi sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla CCHMC Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Cincinnati, OH USA). I topi utilizzati nel corso di questi studi sono stati mantenuti in uno sfondo misto.
1. monte intero X-galattosidasi colorazione
- Euthanize femmina incinta a E11.5 a E14.5, da CO 2 inalazione. Mettere gli animali nella camera di CO 2, caricare la camera con CO 2. Mantenere gli animali in camera per un minimo di 5 min. Eseguire il metodo secondario di eutanasia da dislocazione cervicale.
- Pulire zona addominale con etanolo (EtOH) 70% ed eseguire laparotomia con un'unica incisione mediana addominale. Utilizzare forbici chirurgiche e modello standard (seghettate dritto) pinza.
- Isolare corna uterine con pinze e forbici sottili e collocare immediatamente il tessuto in capsula di Petri contenente raffreddato soluzione PBS. Mantenere il tessuto in ghiaccio fino procedereall'isolamento di embrioni.
- Isolare embrioni da corna uterine. Sezionare il tessuto polmonare tracheale embrionali utilizzando microscopio da dissezione. Utilizzare pinze punta fine e forbici per tenere e forare il tessuto uterino e del concepimento rilasciando gli embrioni.
- Rimuovere restante membrane embrionali. Con l'aiuto di lame ago tagliare la testa di embrioni e la parte inferiore del corpo sotto il diaframma. Individuare fegato come un punto di riferimento.
- Dopo isolamento della regione toracica dell'embrione, procedere a rimuovere i lati laterali della parete del corpo, della colonna vertebrale e cuore con lame aghi. Fare attenzione durante la rimozione del cuore per evitare lesioni del tessuto tracheale. Infine, attenzione, separare l'esofago dalla trachea tirando l'esofago con l'assistenza di lame aghi. Mantenere il tessuto in soluzione PBS in ghiaccio.
- Posizionare il tessuto in 4 ml di vite fiale cappuccio con pipette di vetro o di trasferimento. Fissare tessuto polmonare tracheale in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 30 min. Dopo la fissazione,lavare tessuti con PBS. Mentre il risciacquo, preparare la soluzione X-gal colorazione (aggiungere 5 mm K 3 Fe (CN) 6, (100 ml 0,5 m stock) 5 mm K 4 Fe (CN) 6 (100 l 0,5 m stock) 2 mM MgCl 2, ( 20 l 1 m stock) 0,01% NaDOC (50 ml 2% stock), 0,02% NP 4 O (100 ml 2% stock), 1 mg / ml di X-gal (500 ml di 20 mg / ml di magazzino) e 9.13 ml di acqua distillata per portare a volume finale di 10 ml).
- Rimuovere ogni residuo PBS e aggiungere 2 ml di soluzione di colorazione X-gal per la fiala di vetro. Mettere in fiale vassoio agitatore. tessuti Stain 1 a 2 ore nella soluzione colorante X-gal. Incubare il tessuto in soluzione X-gal per 4 ore per l'ulteriore elaborazione e incorporamento.
- Bloccare la reazione dei tessuti di lavaggio a 3% dimetilsolfossido-PBS. Sciacquare in PBS, 3 volte per 5 minuti ogni lavaggio e conservare in etanolo al 70%.
- Riempire Petri con una soluzione all'1% di agarosio / PBS. Lasciare agarosio solidificare. Usando pipette di vetro, posizionare il tessuto sulla cooperazione agarosiopiastre ATED riempite con soluzione PBS. Fotografare supporti interi usando un microscopio da dissezione. Selezionare il filtro appropriato per campo chiaro.
- Per distinguere meglio i siti di campioni processo di colorazione X-gal per paraffina e sezionamento. I campioni in cassette a maglia fine.
- Per elaborare i campioni per paraffina utilizzano un processore automatizzato e impostare un breve ciclo come segue: sei cambi di alcol: 5 min prima modifica e 3 minuti per ogni variazione residua. Tre variazioni di xilene: 5 min prima modifica e 3 min prossime due modifiche. I passi precedenti vengono eseguiti a 30 ° C. Infine, eseguire tre cambi di paraffina a 62 ° C: 25 min, 8 min e 5 min.
- campioni Orient per l'integrazione con il tessuto disteso sul fondo di incorporare barca. Aggiungere con cautela paraffina a riempire la barca embedding. Raffreddare immediatamente sul piatto freddo di incorporare stazione fino solidifica paraffina. Rimuovere blocco da incorporare barca. Utilizzando un microtomo, generare 6 micron sriflessioni. sezioni Mount su pretrattati-diapositive e diapositive a secco su vetrino più caldo insieme a 42 ° C per 1 ora.
- Cuocere scorre durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack. Deparaffinare vetrini con tre cambi di 100% xilene, 10 minuti ciascuno. Utilizzare colorazione piatti riempito con 200 ml di xilene.
- Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 1 min per punti) in PBS prima controcolorazione con rosso nucleare da 10 a 30 sec. Sciacquare i vetrini con acqua di rubinetto tre volte per 5 minuti ogni volta per eliminare l'eccesso di Nuclear Fast Red.
- Disidratare i vetrini in una serie graduata di EtOH (50%, 70% e 100% EtOH) prima del lavaggio in tre cambi di xilene (20 buchi ogni cambio) e coprire scivolare con mezzo di montaggio a base di xilene.
2. lectina colorazione
- Sezionare E13.5 e E14.5 tracheale tessuto polmonare come descritto nei punti da 1.1 a 1.4. Usando pipette di vetro posto tessuto in flaconcini con tappo a vite. Fissare tessuto polmonare tracheale con 2 ml di2% soluzione PFA notte a 4 ° C. Dopo la fissazione, lavare i campioni in PBS per tre volte per 10 minuti ogni lavaggio.
- Preparare tampone di bloccaggio, solitamente un volume finale di 10 ml di soluzione. Aggiungere 0,1 g di BSA (1%) a 8 ml di PBS. Lasciare BSA per sciogliere. Aggiungere 0,2 ml di siero di capra (2%) 0.03ml di Triton X-100 (0,3%). Portare il volume finale a 10 ml con PBS. campioni del blocco per 1 h in 0,5 ml di tampone di bloccaggio a temperatura ambiente.
- Rimuovere tampone bloccante con una pipetta di trasferimento e sostituirlo con una soluzione lectina composto da 50 mg / mL di lectina, 10% siero di capra e PBS. Utilizzare 250 ml di soluzione di lectina per campione. Incubare per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di coprire la fiala di vetro contenente il tessuto con un foglio di alluminio. Dopo incubazione con soluzione lectina, risciacquare campioni in PBS per tre volte per 10 min.
- Luogo espianti in rivestito agarosio capsule di Petri contenenti abbastanza PBS per coprire i campioni. Fotografare monta interi utilizzando un microscopio a fluorescenza-dissezione. Selezionare il appropFiltro riate per rilevare la fluorescenza. Lectina PNA ben si abbina alla GFP.
3. monte intero Immunofluorescenza e microscopia confocale
- Isolare tessuto polmonare tracheale, trasferimento a 4 ml vite vetro fiale tappo e fissare durante la notte nel 4% PFA. tessuto E11.5 può essere fissato in 2% PFA. Conservare in metanolo 100%. I campioni possono essere conservati fino a diversi mesi a -20 ° C.
- Rimuovere il metanolo con una pipetta di trasferimento e permeabilize campioni utilizzando Bleach di Dent (4 parti Metanolo, 1 parte di DMSO e 1 parte il 30% di H 2 O 2) per 2 ore. tessuto Hydrate in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 100% metanolo, 75% metanolo, 50% metanolo, 25% metanolo, 100% PBS. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente durante ogni fase di idratazione.
- Tessuto Block in 0.5% reagente bloccante diluito in PBS (vedi Materiali particolari) per due ore a temperatura ambiente con agitazione.
- Diluire anticorpo primario nel bloccaresoluzione (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) e incubare campioni notte a 4 ° C. Lavare i campioni con PBS cinque volte a temperatura ambiente. Eseguire ogni lavaggio per 1 ora.
- Applicare anticorpo secondario ad una diluizione 1: 500 in soluzione bloccante 0,5%. selezionare con attenzione anticorpi secondari per evitare legame tra anticorpi secondari. Incubare per una notte a 4 ° C in camera oscura. Lavare i campioni tre volte per 20 minuti a temperatura ambiente. Disidratare campioni in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 25% metanolo, 50% metanolo 75% di metanolo, 100% metanolo, 10 min ogni passo.
Nota: Assicurarsi che i campioni rimangono coperte con un foglio di alluminio e ridurre al minimo l'esposizione alla luce. Tissue può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane fino fotografato. - Campioni di trasferimento a su ordine piastre di scena, rimuovere il metanolo e chiaro con circa 200 ml di soluzione chiara di Murray 19,20 (2 parti benzilico benzoato, 1 parte di alcool benzilico) immediatamente BEFl'imaging minerale. Fotografia usando un microscopio confocale. Elaborare e analizzare immagine utilizzando il software di imaging.
4. proliferazione cellulare
- Iniettare E11.5 topi incinta intra-peritoneally con una soluzione di BrdU ad una concentrazione di 100 ug BrdU / g di peso corporeo. Sacrificio femminile come descritto nella sezione 1 del protocollo e isolare embrioni a E12.5 e E13.5. Usando lame di coltello, teste di consumo e la parte inferiore del corpo al di sotto della cavità toracica.
- Mettere il tessuto toracico in 4 ml di vite fiale tappo e fissare in 1 ml di PFA 4% durante la notte. Lavare i campioni con PBS due volte per 5 min e disidratano campioni attraverso una serie di etanolo diluito in acqua distillata fino al 70% di etanolo come segue: 30%, 50% e 70% di etanolo, per 5 minuti ogni passo.
- I campioni di medie dimensioni dello schermo cassette. tessuti Processo per incorporamento di paraffina utilizzo e il processore automatizzato. Impostare un ciclo come segue: sei cambi di alcol per 8 minuti ciascuno, tre cambi di xilene per 6 minuti ciascuno, tre cHANGES di paraffina, per 25 minuti, 9 min e 8 min.
- Incorpora in paraffina orientare il tessuto nella posizione desiderata per generare 6 trasversali micron o sezioni longitudinali, come descritto nella sezione 1. Posizionare sezioni su vetrini e consentire il tessuto di aderire a scivolare sulla slitta insieme più calda a 42 ° C per 1 ora.
- scivoli cuocere, su un fianco, durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack di plastica. scivoli Sparaffinare per immersione in tre cambi di 100% xilene, 10 min a cambio. Utilizzare 200 ml di xilene per sommergere completamente diapositive. Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 5 min per passo con agitazione) di PBS (5 min).
- Eseguire recupero dell'antigene utilizzando 10 mM tampone citrato, pH 6. Per preparare 100 ml di miscela di tampone citrato 18 ml di 0,1 M di acido citrico monoidrato e 82 ml di 0,1 M citrato di sodio.
- I campioni in vasi Coplin di plastica pieni di soluzione di antigene recupero e forno a microonde per 6,5 minuti ad alta potenza. Aggiungere disacqua distillata a vaschetta Coplin per compensare evaporata-citrato buffer e riscaldare alla potenza del 40% per 6 min.
- Riempire vaschetta Coplin verso l'alto con l'acqua, e riscaldare di nuovo al potere il 40% per 6 min. volte a microonde possono variare in base a microonde utilizzata.
- Lasciare vetrini raffreddare per 20 minuti a temperatura ambiente prima vetrini lavaggio in acqua distillata per 1 min, seguito da PBS per 5 min. Dopo il PBS lavare, vetrini blocco per 2 ore in una soluzione bloccante contenente TBS (2.425 g di Tris base e 8,765 g di NaCl diluito in 1 L di acqua distillata) 10% di siero asino e 1% BSA.
- Aggiungere anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante (TBS contenente 10% di siero Ciuchino e 1% BSA). BrdU (marcatore mitosi), Nkx2.1 (epitelio delle vie respiratorie), Sox9 (cellule che daranno luogo alla cartilagine) e αSMA (cellule muscolari lisce). Incubare i vetrini durante la notte, a 4 ° C. Utilizzare il metodo di sovrapposizione per conservare gli anticorpi. Applicare 180 ml di anticorpi di una guarnizione e quindi collegare slitta come se la copertura antiscivoloping.
- Staccare la guarnizione immergendo i vetrini in acqua distillata. Dopo la rimozione della guarnizione, lavare anticorpo primario non legato eseguendo sei 5 min lavaggi con TBS contenente 0,1% Tween-20.
- Incubare i vetrini con anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante alla diluizione di 1: 200, per 1 ora a temperatura ambiente. Selezionare accuratamente anticorpi secondari per evitare indesiderate legame tra di loro. Rimuovere l'anticorpo secondario non legato eseguendo tre a cinque lavaggi minuti con TBS contenente 0,1% di Tween.
- Lavare i vetrini in 0,1 M di base Tris due volte per 5 minuti e poi 0,05 di base M Tris due volte per 5 min. I vetrini possono essere lasciato in 0,05 di base M Tris mentre coversliping utilizzo dei supporti di montaggio con o senza DAPI (1,5 mg / ml). Conservare i vetrini nella cartella di diapositive a 4 ° C e al riparo dalla luce coprendo cartella con un foglio di alluminio.
- Visualizza colorazione e fotografia utilizzando un microscopio a fluorescenza automatizzato. Contare etichettati cellule e cellule totali per campo fotografato al20X e 40X per determinare i rapporti di cellule proliferanti di cellule totali.
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Representative Results
attività / β-catenina Wnt
Tutta la colorazione monte Lac-Z è stato rilevato nel tessuto tracheale-polmonare di embrioni isolati da giornalista Axin2 Lac Z topi 11. Siti di colorazione indicano l'attività / β-catenina Wnt. Analisi di sezioni di montare tutto colorazione determinato che Wnt attività / β-catenina era presente nel mesenchima della trachea e mesenchima delle regioni periferiche polmoni sviluppo. In embrioni WlsShhCre (in cui la secrezione di Wnt ligandi del dell'epitelio delle vie respiratorie è stata abrogata) Lac-Z colorazione era quasi assente (Figura 1).
condensazioni mesenchimali in tracheale mesenchima
Un passo fondamentale nella condrogenesi è il processo con cui le cellule mesenchimali fated per dare rISE alla cartilagine condensa. Queste aggregazioni stretti di cellule sono noti come condensazioni mesenchimali. Per verificare se la mancanza di cartilagine osservato nei topi WlsShhCre era dovuto l'assenza di condensazioni mesenchimali, tessuti polmonari nella trachea di età gestazionale E12.5 a E14.5 sono state colorate con PNA lectina. A E13.5 e E14.5, la fluorescenza è stato rilevato come bande periodici nel mesenchima tracheale nei siti in cui si formerà la cartilagine. Mancanza di fluorescenza rilevabile nel tessuto tracheale di embrioni WlsShhCre indica che endodermico Wnt segnalazione al mesenchima tracheale è necessario per condensazioni mesenchimali (Figura 2).
specificazione delle cellule delle vie respiratorie
Tutta monte immunofluorescenza di tessuti polmonari tracheali determinato il pattern di espressione di Sox9, Nkx2.1 e αSMA a E11.5. Nel tessuto tracheale, espressione Sox9 è limiteed al mesenchima della trachea come una striscia continua (freccia in Figura 3A e B), mentre nel polmone sviluppo Sox9 viene osservato alla periferia del epitelio respiratorio (teste di freccia in Figura 3A, B e C). Nkx2.1 presenta un modello di espressione distinta limitato all'epitelio della trachea del polmone. Prevenire la secrezione di ligandi Wnt da epitelio provoca espressione diminuita Sox9 in tracheale mesenchima, ma non influenza l'espressione Sox9 nell'epitelio polmonare periferico. Espressione dei αSMA non è facilmente rilevato in tracheale mesenchima, tuttavia colorazione è stato rilevato a livello della laringe (freccia gialla, Figura 3) e dello stomaco (Figura 3).
La proliferazione cellulare in trachea sviluppo
Proliferazione nell'epitelio e mesenchimadella trachea è stata rilevata dopo l'etichettatura in vivo del tessuto con BrdU. Le sezioni di tessuto tracheale sono state colorate con anticorpi che riconoscono BrdU, Sox9 e αSMA. Il profilo proliferazione nel mesenchima tracheale indica che i livelli di Sox9 cellule colorate subire proliferazione è superiore al livello di cellule colorate αSMA sottoposti proliferazione. Questo modello proliferazione sembra essere ripristinato in tracheas WlsShhCre (Figura 4).
Figura 1: attività / β-catenina Wnt è operativa in tracheale mesenchima tessuto E13.5 tracheale polmonare, isolato dal Axin2-LacZ e WlsShhCre:. Topi Axin2-LacZ, sono state colorate con X-gal (A e B). Le sezioni di tessuto tracheale polmonare sono stati di contrasto con rosso veloce (A ', B'). Nota la mancanza di X-galcolorazione con WlsShhCre; topi Axin2-Lac-Z che dimostrano l'assenza di Wnt attività / β-catenina (B '). Tessuto E14.5 da topi Axin2 LacZ colorati con X-gal raffigura siti di anelli cartilaginei futuri (C); Tuttavia, l'attività Axin2 è stato limitato alla periferia (punta della freccia) delle condensazioni mesenchimali (freccia) (D). barra della scala A, B e C = 500 micron; B ', D' e D = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Espianti tracheale-polmone condensa mesenchimali nello sviluppo di tessuto tracheale E13.5 sono state colorate con PNA lectina. Controllo tracheale tessuto raffigurante le regioni erano cellule mesenchimali condensato viene mostrato (frecce A C). Non condensazioni mesenchimali sono stati rilevati in WlsShhCre topi (B e freccia in D). C e D rappresentano inferiore ingrandimento del tessuto tracheale-polmonare mostrato in A e B. Scala bar A e B = 1 mm; C e D = 2 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: modello di espressione in tutto prechondrogenic montaggio trachea Nkx2.1 e Sox9 colorazione è stato rilevato in espianti E11.5.. Pannello A mostra l'immagine di un tessuto di controllo, mentre il pannello B mostra una sezione ottica di un tessuto 20 micron controllo. Si noti la mancanza di espressione mesenchimale di Sox9 nel tessuto WlsShhCre (freccia in C), but manutenzione di espressione periferica della Sox9 (punta di freccia in C). αSMA colorazione è stato rilevato a bassi livelli in trachealmesenchyme di tessuto E11.5 ma osservata nella regione laringea (freccia gialla in D ed E), stomaco (S) e rimanendo tessuto cardiaco (CT) (E). Nkx2.1 è espressa nell'epitelio di sviluppare trachea e polmoni (D, E). Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. La proliferazione cellulare modello nel mesenchima prechondrogenic sezioni di embrioni E13.5 sono state colorate con anticorpi anti BrdU, Sox9 e anticorpi αSMA. Pannelli C e D sono più alti ingrandimenti di A B, rispettivamente. Le linee tratteggiate rappresentano limiti dell'epitelio tracheale. Nota Sox9 macchiato di cellule proliferative (punta di freccia C) e αSMA macchiato di cellule proliferative (punta di freccia in D). T = trachea, E = esofago. Scala bar A e B = 50 micron, C e D = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Eventi sottostanti morfogenesi del tratto respiratorio sono state comprese, in particolare i processi necessari per il patterning delle vie aeree di conduzione. Studi precedenti hanno utilizzato ex vivo le tecniche di cui espianti in via di sviluppo sono coltivate all'interfase aria-liquido o incorporato in matrigel 21,22. Questi studi hanno dimostrato come fattori di crescita influenzano il patterning della trachea sviluppo e la formazione di tracheale cartilagine. Una limitazione a questi studi è che l'architettura del tessuto non è correttamente mantenuta e pertanto non può abbastanza riepilogare il processo in vivo di chondrogenesis.
L'approccio che abbiamo intrapreso per studiare il ruolo della segnalazione Wnt nel processo di condurre vie aeree patterning inclusi studi in vivo accoppiato con intere tecniche di colorazione di montaggio, immunofluorescenza e di imaging. X-gal colorazione di tutto il tessuto monte seguito da séctioning e contro-colorazione, presenta vantaggi rispetto alla colorazione di sezioni di paraffina. Tutta monte colorazione consente la rilevazione diretta dei luoghi in cui l'attività Wnt / β-catenina è operativo. Inoltre, il sezionamento degli espianti macchiati determinato siti precisi nel mesenchima in cui si trovava l'attività come lo sviluppo progredito. Quest'ultima è una lettura migliore e preciso di rilevamento di espressione dell'enzima β-galattosidasi in sezioni in paraffina. Mentre l'attività enzimatica potrebbe essere rilevato in sezioni, questa procedura richiederà criosezioni che non sarà sempre facile da generare e non può preservare l'architettura di piccoli campioni. Una limitazione nel protocollo descritto in questo documento, è che il trattamento dei campioni per paraffina dopo tutto il monte colorazione causerà una perdita del segnale. Pertanto, i campioni devono rimanere più in soluzione X-gal e un ciclo più breve per incorporamento paraffina devono essere utilizzati per ottenere buon segnale su sezioni.
D'altra parte, tutta la procedura immunofluorescenza monte, modificata dopo la tecnica descritta da Ahnfelt-Ronne 23, permesso per la visualizzazione tridimensionale sviluppare tracheale e tessuto polmonare, con un pattern di espressione definita di proteine codificate dai fattori di trascrizione chiave come Nkx2.1 e Sox9. Quando desiderato, tutto il monte colorazione può essere presentato come confocale-aided z pile di immagini, raffiguranti diverse profondità del tessuto tracheale polmonare. Mentre l'imaging piccoli espianti, compensazione del tessuto deve essere eseguita in un piattello. Abbiamo utilizzato spessore metallicomisura lastre di scena con fondo ottico in cui i campioni vengono cancellati e ripreso. Questo impedisce la perdita di materiale durante il trasferimento piccolo tessuto dopo l'eliminazione di passo. Mentre tutto il monte immunofluorescenza è una tecnica adatta per la colorazione dei tessuti piccoli, riconosciamo limitazioni alla tecnica. In particolare, abbiamo osservato le prestazioni dissimili di anticorpi che riconoscono antigeni meglio nelle sezioni in contrapposizione a tutto il monte. Questo problema può precludere le prestazioni della tecnica se anticorpi alternative sono disponibili. E 'anche possibile che l'uso di metanolo e di compensazione con chiaro di Murray può avere un impatto negativo nel segnale osservato. In futuro, proveremo altre soluzioni di compensazione non biologici e regolare il protocollo corretto per questo scopo 24. Una considerazione finale è che tutto il monte permetterà lo studio di alcune proteine espresse in un tessuto in un dato momento.
rapporti precedenti hanno dimostrato l'utilità diPNA lectina colorazione per rilevare condensazioni mesenchimali in sezioni di tessuto tracheale 21,25. Nel presente studio, riportiamo una metodologia con cui la colorazione è stata eseguita in tutto il monte, che facilita una migliore visualizzazione delle regioni della trachea cui si formerà la cartilagine. Durante l'esecuzione di lectina cura colorazione deve essere posto in utilizzando la giusta concentrazione di lectina di non over-macchia, come commercialmente disponibile PNA-lectina è accoppiato alla GFP. Auto-fluorescenza del tessuto può oscurare i risultati rendendo difficile distinguere le bande corrispondenti a mesenchimali condensazioni.
Infine, etichettatura in vivo di tessuto con BrdU seguita dalla sezionatura e immunofluorescenza è una tecnica praticabile per determinare la proliferazione cellulare che presenta vantaggi rispetto colorazione tipica e statico come PPh3 o PCNA 26,27. Quest'ultima tecnica presenta limitazioni, come colorazione varierà a seconda delfase del ciclo cellulare. Questo problema viene eliminato dalla nostra tecnica descritta. La combinazione di etichettatura in vivo seguita da incasso, sezionamento e immunofluorescenza ha permesso di determinare che epiteliale Wnt leganti bilanciare la proliferazione differenziale di Sox9 e α-SMA che esprimono le cellule che daranno luogo a tracheale cartilagine e muscolo 7.
In sintesi, un approccio multiplo-tecnica per studiare il patterning del tratto respiratorio sviluppo consente una profonda analisi del ruolo della segnalazione Wnt nella conduzione vie aeree morfogenesi. Questi studi determinati siti precisi di Wnt / β-catenina nel tessuto tracheale, nonché segnalazione induttivo e istruttivo fornito da epitelio tracheale che è richiesto per la specifica, differenziale proliferazione di linee cellulari tracheale mesenchima, così come la formazione di cartilagine. I nostri orientamenti futuri includono l'ottimizzazione di tutto il monte colorazione per Wls recentemente identificatigeni bersaglio, come pure l'esecuzione di tutta la immunofluorescenza monte in combinazione con lectina colorazione.
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Disclosures
"Gli autori non hanno nulla da rivelare."
Acknowledgments
Riconosciamo l'assistenza di Mike Muntifering e Matt Kofron con confocale e Gail Macke con procedure istologiche. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 per DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
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