Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

WNT सिगनल का अध्ययन का आयोजन एयरवेज के patterning के दौरान

Published: October 16, 2016 doi: 10.3791/53910
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neonatology and Pulmonary Biology-Perinatal Institute, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati, College of Medicine

Summary

पूरे माउंट करने के लिए मिलकर संवाददाता चूहों और इस खंड धुंधला हो जाना, माइक्रोस्कोपी के और इन विवो assays में उपयोग श्वसन तंत्र की सामान्य patterning अंतर्निहित तंत्र के विश्लेषण की सुविधा। यहाँ हम वर्णन कैसे इन तकनीकों सांस की नली के विकास के दौरान WNT सिगनल के विश्लेषण के लिए योगदान दिया।

Introduction

श्वसन तंत्र के विकास उदर endodermal अग्रांत्र 1,2 में Nkx2.1 सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ भ्रूण दिन 9 (E9) द्वारा शुरू की है। इसोफेजियल-सांस की नली ट्यूब जुदाई E11.5 द्वारा mesenchymal ऊतक 3 से घिरे प्रत्येक हल होगा जब नलियों अलग संस्थाओं के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है। WNT सिगनल Wnt2 और Wnt2b का विलोपन के रूप में श्वसन तंत्र के निर्देशन में एक महत्वपूर्ण भूमिका, स्प्लैनकिंक mesenchyme और β-catenin का विलोपन endodermal श्वसन उपकला से फेफड़ों के द्वारा व्यक्त agenesis 4,5 में परिणाम होगा निभाता है। हमारे पिछले अध्ययनों, WLS, सभी Wnt ligands के एक मालवाहक रिसेप्टर मध्यस्थता स्राव की कि विलोपन चुना गया फेफड़ों hypoplasia में endodermal श्वसन तंत्र परिणामों से, फेफड़े संवहनी विकास और सांस की नली mesenchyme 6.7 की गलत patterning में दोष। इन आंकड़ों उपकला-mesenchymal सीआरओ के महत्व का समर्थनएस एस, सेल भेदभाव और विनिर्देश में बात करते हैं, क्योंकि यह भी अन्य अध्ययनों से 8,9 में दिखाया गया है।

फेफड़ों के विकास के शुरुआती दौर के अध्ययन के आनुवंशिक पर निर्भर करता है, इन विट्रो और पूर्व vivo तकनीक है कि हमें बेहतर सांस की पहचान 10-16 ड्राइविंग तंत्र को समझने के लिए अनुमति दी है में। हवा तरल interphase पर पूरे फेफड़ों explant संस्कृतियों का व्यापक रूप से फेफड़े के morphogenesis 10,17,18 शाखाओं में बंटी के प्रारंभिक दौर में विकास के कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इस पद्धति ऐसी शाखाओं में बंटी morphogenesis के रूप में रूपात्मक परिवर्तन, और जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन के readout के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह विकास की प्रक्रिया के प्रारंभिक दौर के अध्ययन तक सीमित है, के रूप में संस्कृति ही वाहिका 17 के विकास का समर्थन नहीं करता। सांस की नली उपास्थि के विकास अब ऊष्मायन बार इस संस्कृति तकनीक के साथ संगत नहीं किया जा सकता है कि आवश्यकता है।

analyz करने के लिएश्वसन तंत्र के गठन के दौरान WNT सिगनल की ई भूमिका, हम मानक तकनीक ढाल लिया है हमारे भ्रूण पढ़ाई की जरूरतों को पूरा करने के लिए। हम संस्करणों, धुंधला बार, आयल embedding और सांस की नली-फेफड़े के ऊतकों के समाशोधन के लिए समय के लिए प्रसंस्करण साइकिल चालन संशोधित किया है। तकनीक वर्तमान अध्ययन में वर्णित के अनुकूलन का मुख्य लक्ष्य है कि चूहों E14.5 करने के लिए E11 से जगह ले में सांस की नली विकास के प्रारंभिक चरणों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। संवाददाता चूहों लाइन Axin2LacZ विकासशील सांस की नली में mesenchyme Wnt / β-catenin गतिविधि का हम ठीक निर्धारित साइटों का उपयोग करना। हम भी पूरे माउंट सांस की नली ऊतक के लिए लेक्टिन धुंधला प्रक्रिया ढाल लिया है। इस प्रकार, हम mesenchymal condensations कल्पना और साइटों जहाँ उपास्थिजनन जगह ले जाएगा भविष्यवाणी करने में सक्षम थे। पूरे माउंट और WlsShhCre चूहों, उन्नत माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ युग्मित से प्राप्त भ्रूण ऊतक के वर्गों, का धुंधला Wnt टीआरए द्वारा उत्पादित ligands की भूमिका अनावरण करने के लिए हमें की अनुमति दीसांस की नली में patterning cheal उपकला।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

पशु रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखे थे। चूहे CCHMC संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (सिनसिनाटी, ओह यूएसए) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार संभाल रहे थे। इन अध्ययनों भर में उपयोग चूहे एक मिश्रित पृष्ठभूमि में बनाए रखा गया।

1. पूरा पर्वत एक्स-galactosidase धुंधला

  1. E14.5 करने के लिए E11.5 में गर्भवती महिला euthanize, सीओ 2 साँस लेना द्वारा। सीओ 2 कक्ष में जानवरों की जगह, सीओ 2 के साथ चैम्बर चार्ज करते हैं। 5 मिनट के न्यूनतम के लिए चैम्बर में जानवरों को बनाए रखें। ग्रीवा अव्यवस्था से इच्छामृत्यु के माध्यमिक विधि का प्रदर्शन।
  2. इथेनॉल (EtOH) 70% है और एक भी पेट midline चीरा साथ laparotomy प्रदर्शन के साथ स्वच्छ पेट क्षेत्र। शल्य कैंची और मानक पैटर्न (सीधे दांतेदार) संदंश का उपयोग।
  3. पेट्री डिश में संदंश और ठीक कैंची का उपयोग गर्भाशय सींग अलग करने और तुरंत जगह ऊतक पीबीएस समाधान ठंडा होता है। कार्यवाही जब तक बर्फ पर ऊतक बनाए रखेंभ्रूण के अलगाव के लिए।
  4. गर्भाशय सींग से भ्रूण को अलग। विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग भ्रूण सांस की नली फेफड़े के ऊतकों काटना। ठीक टिप संदंश और कैंची पकड़ और गर्भाशय ऊतक पंचर और भ्रूण को रिहा concepti करने के लिए उपयोग।
    1. भ्रूण झिल्ली शेष निकालें। भ्रूण की सुई ब्लेड की सहायता में कटौती सिर और डायाफ्राम के नीचे कम शरीर भाग के साथ। एक मील का पत्थर के रूप में जिगर का पता लगा।
    2. भ्रूण के वक्ष क्षेत्र के अलगाव के बाद, शरीर दीवार, रीढ़ की हड्डी और हृदय का उपयोग कर सुई ब्लेड के पार्श्व पक्षों को दूर करने के लिए आगे बढ़ें। जबकि दिल को हटाने सांस की नली के ऊतकों को घायल कर से बचने के लिए ध्यान रखना। अंत में, ध्यान, सुई ब्लेड की सहायता से घेघा खींच कर श्वासनली से घेघा अलग। बर्फ पर पीबीएस समाधान में ऊतक बनाए रखें।
  5. 4 मिलीलीटर में रखें ऊतक गिलास या हस्तांतरण pipettes का उपयोग टोपी शीशियों पेंच। 30 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में सांस की नली फेफड़े के ऊतकों को ठीक करें। निर्धारण के बाद,पीबीएस के साथ ऊतक कुल्ला। Rinsing, वहीं एक्स-लड़की धुंधला समाधान (5 मिमी कश्मीर 3 फे (सीएन जोड़) 6, (100 μl 0.5 एम स्टॉक) 5 मिमी कश्मीर 4 फे (सीएन) 6 (100 μl 0.5 एम स्टॉक) 2 मिमी 2 MgCl, (तैयार 20 μl 1 एम स्टॉक) 0.01% NaDOC (50 μl 2% शेयर), 0.02% एनपी 4 हे (100 μl 2% शेयर), 1 मिलीग्राम / एमएल एक्स-लड़की (20 मिलीग्राम के 500 μl / एमएल शेयर) और 9.13 मिलीग्राम की आसुत जल 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा) को लाने के लिए।
  6. किसी भी शेष पीबीएस निकालें और कांच की शीशी के लिए एक्स-लड़की धुंधला समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें। प्रकार के बरतन पर ट्रे में शीशियों रखें। दाग ऊतकों 1 2 एक्स-लड़की धुंधला समाधान में मानव संसाधन के लिए। आगे की प्रक्रिया और embedding के लिए 4 घंटे के लिए एक्स-लड़की समाधान में ऊतक सेते हैं।
  7. 3% डाइमिथाइल sulfoxide-पीबीएस में धोने के ऊतकों द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो। 5 मिनट के लिए प्रत्येक धोने और 70% इथेनॉल में दुकान पीबीएस में कुल्ला, 3 बार।
  8. एक 1% agarose / पीबीएस समाधान के साथ पेट्री डिश भरें। agarose जमना करने की अनुमति दें। कांच हस्तांतरण pipettes का प्रयोग, agarose सह पर ऊतक जगहपैदा प्लेटों पीबीएस समाधान के साथ भर दिया। एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग पूरे mounts तस्वीर। brightfield के लिए उपयुक्त फिल्टर का चयन करें।
  9. बेहतर आयल एम्बेडिंग और सेक्शनिंग के लिए एक्स-लड़की धुंधला प्रक्रिया के नमूने की साइटों भेद। ठीक स्क्रीन कैसेट में रखें नमूने हैं।
    1. प्रक्रिया करने के लिए आयल embedding के लिए नमूने लिए एक स्वचालित प्रोसेसर का उपयोग करें और इस प्रकार के रूप में एक छोटी चक्र की स्थापना: शराब के छह परिवर्तन: 5 मिनट पहले परिवर्तन और प्रत्येक शेष परिवर्तन प्रति 3 मिनट। Xylene के तीन परिवर्तन: 5 मिनट पहले परिवर्तन और 3 मिनट के लिए अगले दो परिवर्तन। पिछले चरणों 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं। 25 मिनट, 8 मिनट और 5 मिनट: अंत में, 62 डिग्री सेल्सियस पर आयल के तीन परिवर्तन करते हैं।
  10. ऊतक नाव embedding के तल पर फ्लैट झूठ बोल के साथ embedding के लिए ओरिएंट नमूने हैं। ध्यान से embedding नाव को भरने के लिए आयल जोड़ें। पैराफिन solidifies तक स्टेशन embedding की ठंड प्लेट पर तुरंत शांत। नाव embedding से ब्लॉक निकालें। एक microtome का उपयोग करना, उत्पन्न 6 माइक्रोन रोंections। pretreated के रूप में स्लाइड और 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म स्लाइड सेट पर सूखी स्लाइड्स पर माउंट वर्गों।
  11. सेंकना 56 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रात भर स्लाइड। रैक में स्लाइड्स रखें। Deparaffinize 100% ज़ाइलीन के तीन परिवर्तन, 10 मिनट प्रत्येक के साथ स्लाइड। Xylene की 200 मिलीलीटर से भरा बर्तन धुंधला करने का प्रयोग करें।
  12. 10 से 30 सेकंड के लिए परमाणु फास्ट लाल के साथ counterstaining पहले पीबीएस को वर्गीकृत EtOH श्रृंखला (100%, 70%, 50% और 30%, कदम प्रति 1 मिनट) का उपयोग कर स्लाइड rehydrate। नल के पानी से कुल्ला स्लाइड 5 मिनट के लिए हर बार परमाणु फास्ट लाल से अधिक दूर करने के लिए तीन बार।
  13. Xylene के तीन परिवर्तन में धोने से पहले एक वर्गीकृत EtOH श्रृंखला में स्लाइड्स (50%, 70% और 100% EtOH) (20 गिरावट प्रत्येक परिवर्तन) और कवर ज़ाइलीन आधारित बढ़ते मीडिया के साथ फिसल निर्जलीकरण।

2. Lectin धुंधला

  1. कदम 1.4 करने के लिए 1.1 में वर्णित के रूप में E13.5 और E14.5 सांस की नली फेफड़े के ऊतकों काटना। पेंच टोपी शीशियों में जगह ऊतक का उपयोग कांच हस्तांतरण pipettes। के 2 मिलीलीटर के साथ सांस की नली फेफड़े के ऊतकों को ठीक करें4 डिग्री सेल्सियस पर 2% पीएफए ​​समाधान रात भर। निर्धारण के बाद, 10 मिनट प्रत्येक धोने के लिए तीन बार पीबीएस में नमूने कुल्ला।
  2. बफर, आमतौर पर समाधान के 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा अवरुद्ध तैयार करें। बीएसए (1%) की 0.1 ग्राम पीबीएस के 8 मिलीलीटर जोड़ें। बीएसए को भंग करने की अनुमति दें। बकरी सीरम (2%) ट्राइटन X-100 (0.3%) की 0.03ml के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस के साथ 10 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाओ। कमरे के तापमान पर बफर अवरुद्ध के 0.5 मिलीलीटर में 1 घंटे के लिए नमूने ब्लॉक।
  3. अवरुद्ध बफर निकालें एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग और लेक्टिन समाधान लेक्टिन के 50 माइक्रोग्राम / μl, 10% बकरी सीरम और पीबीएस के शामिल के साथ बदलें। नमूना प्रति लेक्टिन समाधान के 250 μl का प्रयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। कांच एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ऊतक युक्त शीशी को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें। लेक्टिन समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद, नमूने पीबीएस में 10 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला।
  4. agarose लेपित पेट्री पर्याप्त पीबीएस युक्त नमूनों को कवर करने के बर्तन में रखें explants। एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग पूरे mounts तस्वीर। approp का चयन करेंriate फिल्टर प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए। लेक्टिन PNA आमतौर पर GFP के लिए युग्मित है।

3. पूरा पर्वत इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और confocal माइक्रोस्कोपी

  1. सांस की नली फेफड़े के ऊतकों को अलग, 4 मिलीलीटर कांच पेंच टोपी शीशियों को हस्तांतरण और 4% पीएफए ​​में रात भर ठीक। E11.5 ऊतक 2% पीएफए ​​में तय किया जा सकता है। मेथनॉल में स्टोर 100%। नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीने तक रखा जा सकता है।
  2. हस्तांतरण पिपेट का उपयोग मेथनॉल निकालें और 2 घंटे के लिए डेंट की ब्लीच (4 भागों मेथनॉल, 1 भाग DMSO और 1 हिस्सा 30% एच 2 ओ 2) का उपयोग कर नमूने permeabilize। पीबीएस में पतला प्रकार के रूप में मेथनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला में हाइड्रेट ऊतक: 100% मेथनॉल, 75% मेथनॉल, 50% मेथनॉल, 25% मेथनॉल, 100% पीबीएस। हाइड्रेशन के प्रत्येक चरण के दौरान कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. 0.5% अवरुद्ध अभिकर्मक पीबीएस में पतला में ब्लॉक ऊतक आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए (विवरण के लिए सामग्री देखें)।
  4. रोकने में प्राथमिक एंटीबॉडी पतलासमाधान (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने सेते हैं। कमरे के तापमान पर पीबीएस पांच बार के साथ धो नमूने हैं। 1 घंटे के लिए प्रत्येक धोने के प्रदर्शन करना।
  5. 0.5% अवरुद्ध समाधान में 500 कमजोर पड़ने: एक 1 पर माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें। ध्यान से माध्यमिक एंटीबॉडी के बीच बंधन को रोकने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करें। अंधेरे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। धो नमूने कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए तीन बार। पीबीएस में पतला प्रकार के रूप में मेथनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला में नमूने निर्जलीकरण: 25% मेथनॉल, 50% मेथनॉल 75% मेथनॉल, 100% मेथनॉल, 10 मिनट प्रत्येक कदम है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि नमूने एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर रहते हैं और प्रकाश के संपर्क में कम से कम। ऊतक अब कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता जब तक फोटो खिंचवाने।
  6. स्थानांतरण के नमूने कस्टम चरण प्लेटों से बना है, तुरंत BEF मूर्रे स्पष्ट समाधान के लगभग 200 μl 19,20 (2 भागों लोबान बेंजोएट, 1 हिस्सा बेंजाइल अल्कोहल) के साथ मेथनॉल और स्पष्ट हटानेअयस्क इमेजिंग। एक confocal खुर्दबीन का उपयोग तस्वीर। प्रक्रिया और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि का विश्लेषण।

4. सेल प्रसार

  1. 100 माइक्रोग्राम BrdU / शरीर के वजन के जी की एकाग्रता में BrdU का एक समाधान के साथ इंट्रा-peritoneally E11.5 गर्भवती चूहों इंजेक्षन। E12.5 या E13.5 पर प्रोटोकॉल की धारा 1 में वर्णित है और भ्रूण को अलग रूप में महिला बलिदान। चाकू ब्लेड, आबकारी सिर और वक्ष गुहा के नीचे शरीर के निचले हिस्से का उपयोग करना।
  2. वक्ष के ऊतकों की जगह में 4 मिलीलीटर टोपी शीशियों पेंच और रात में 4% पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर में तय कर लो। 30%, 50% और 70% इथेनॉल, 5 मिनट के प्रत्येक चरण के लिए: धो 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ नमूने और एक इथेनॉल 70% इथेनॉल के लिए आसुत पानी में पतला के रूप में इस श्रृंखला के माध्यम से नमूने निर्जलीकरण।
    1. मध्यम आकार की स्क्रीन कैसेट में रखें नमूने हैं। आयल एम्बेडिंग का उपयोग कर और स्वचालित प्रोसेसर के लिए प्रक्रिया ऊतक। 8 मिनट के लिए शराब की छह परिवर्तन प्रत्येक, 6 मिनट प्रत्येक, तीन सी के लिए xylene के तीन परिवर्तन: इस प्रकार के रूप में एक चक्र सेट अपआयल की hanges, 25 मिनट, 9 मिनट और 8 मिनट के लिए।
  3. वांछित स्थिति में ऊतक orienting स्लाइड पर खंड 1. वर्गों वर्णित के रूप में 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म स्लाइड सेट पर स्लाइड करने के लिए पालन करने के लिए 6 माइक्रोन अनुप्रस्थ या अनुदैर्ध्य वर्गों पैदा करते हैं और ऊतक अनुमति देने के लिए पैराफिन में शामिल करें।
  4. सेंकना स्लाइड, अपने पक्ष पर, रातोंरात 56 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में। प्लास्टिक रैक में स्लाइड्स रखें। 100% ज़ाइलीन के तीन परिवर्तन, परिवर्तन प्रति 10 मिनट में विसर्जन के द्वारा डी-paraffinize स्लाइड। Xylene की 200 मिलीलीटर का प्रयोग पूरी तरह से डूब स्लाइड। पीबीएस (5 मिनट) के लिए श्रेणीबद्ध EtOH श्रृंखला (100%, 70%, 50% और 30%, आंदोलन के साथ कदम प्रति 5 मिनट) का उपयोग कर स्लाइड rehydrate।
  5. 10 मिमी साइट्रेट बफर, पीएच 6. का उपयोग कर और 0.1 एम सोडियम साइट्रेट के 82 मिलीलीटर साइट्रेट बफर मिश्रण 0.1 एम साइट्रिक एसिड की 18 मिलीलीटर monohydrated की 100 मिलीलीटर तैयार करने के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन करना।
    1. प्लास्टिक Coplin उच्च शक्ति में 6.5 मिनट के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान और माइक्रोवेव के साथ भरा जार में रखें नमूने हैं। जिले मेCoplin जार करने के लिए कृषि पानी 6 मिनट के लिए 40% बिजली पर सुखाया-साइट्रेट बफर और गरम करना के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए।
    2. Coplin जार भरें पानी के साथ शीर्ष, और 6 मिनट के लिए 40% बिजली पर फिर से गरम करना। माइक्रोवेव बार इस्तेमाल माइक्रोवेव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    3. स्लाइड 20 मिनट के लिए 1 मिनट, 5 मिनट के लिए पीबीएस के द्वारा पीछा के लिए आसुत पानी में धोने स्लाइड से पहले कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। पीबीएस के बाद 2 घंटे के लिए धोने, ब्लॉक स्लाइड टीबीएस युक्त समाधान (Tris आधार की 2.425 जी और सोडियम क्लोराइड की 8.765 जी आसुत पानी का 1 एल में पतला) 10% गधा सीरम और 1% बीएसए को रोकने में।
  6. समाधान (10% गधा सीरम और 1% BSA युक्त टीबीएस) अवरुद्ध में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। BrdU (बँटवारा मार्कर), Nkx2.1 (श्वसन तंत्र उपकला), Sox9 और αSMA (चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं) (कोशिकाओं उपास्थि को जन्म देगा कि)। रात भर स्लाइड सेते हैं, 4 डिग्री सेल्सियस पर। एंटीबॉडी के संरक्षण के लिए ओवरले विधि का प्रयोग करें। एक गैसकेट के लिए एंटीबॉडी के 180 μl लागू करें और उसके बाद के रूप में अगर कवर पर्ची स्लाइड देते हैंपिंग।
  7. आसुत जल में स्लाइड सूई से गैसकेट को अलग करें। गैसकेट को हटाने के बाद, टीबीएस युक्त 0.1% बीच 20 के साथ छह 5 मिनट washes के प्रदर्शन से अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी धो लें।
    1. 200, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए: 1 के कमजोर पड़ने पर अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी के साथ स्लाइड्स सेते हैं। उन के बीच अवांछित बंधन को रोकने के लिए सावधानी से माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करें। 0.1% बीच युक्त टीबीएस के साथ तीन से पांच मिनट washes के प्रदर्शन से अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें।
    2. दो बार 5 मिनट के लिए और 0.1 एम Tris बेस में स्लाइड्स धो लें तो 0.05 5 मिनट के लिए एम Tris आधार दो बार। स्लाइड 0.05 एम Tris बेस में छोड़ा जा सकता है, जबकि साथ या DAPI (1.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के बिना बढ़ते मीडिया का उपयोग कर coversliping। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड फ़ोल्डर में स्टोर स्लाइड और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर द्वारा फ़ोल्डर प्रकाश से बचाने के।
  8. धुंधला हो जाना और फोटोग्राफ एक स्वचालित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कल्पना। गणना लेबल वाली कोशिकाओं और क्षेत्र के अनुसार कुल कोशिकाओं पर फोटो खिंचवाने20X और 40X कुल कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं proliferating के अनुपात का निर्धारण करने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wnt / β-catenin गतिविधि

पूरे माउंट लाख-जेड धुंधला संवाददाता Axin2 लाख -Z चूहों 11 से पृथक भ्रूण की सांस की नली-फेफड़े के ऊतकों में पाया गया था। धुंधला की साइटें Wnt / β-catenin गतिविधि का संकेत मिलता है। पूरे माउंट धुंधला के वर्गों के विश्लेषण से निर्धारित किया है कि Wnt / β-catenin गतिविधि श्वासनली की mesenchyme में और विकासशील फेफड़ों के परिधीय क्षेत्रों के mesenchyme में मौजूद था। WlsShhCre भ्रूण (जिसमें श्वसन तंत्र के उपकला से Wnt ligands के स्राव को निराकृत किया गया था) में एलएसी-जेड धुंधला लगभग अनुपस्थित (चित्रा 1) था।

सांस की नली mesenchyme में mesenchymal condensations

उपास्थिजनन में एक महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया है जिसके द्वारा mesenchymal कोशिकाओं आर देने के लिए नसीब हैआईएसई गाढ़ा उपास्थि करने के लिए। कोशिकाओं के इन तंग एकत्रित mesenchymal condensations के रूप में जाना जाता है। परीक्षण है कि क्या WlsShhCre चूहों में मनाया उपास्थि की कमी mesenchymal condensations, E14.5 को गर्भावधि उम्र E12.5 से सांस की नली से फेफड़ों के ऊतकों की अनुपस्थिति PNA लेक्टिन के साथ दाग थे की वजह से था। E13.5 और E14.5 पर, प्रतिदीप्ति स्थलों पर सांस की नली mesenchyme जहां उपास्थि का गठन किया जाएगा में समय-समय पर बैंड के रूप में खोजा गया था। WlsShhCre भ्रूण की सांस की नली के ऊतकों में पहचाने जाने प्रतिदीप्ति की कमी को इंगित करता है कि endodermal Wnt सांस की नली mesenchyme को संकेत mesenchymal condensations (चित्रा 2) के लिए आवश्यक है।

श्वसन तंत्र सेल विनिर्देश

सांस की नली से फेफड़ों के ऊतकों के पूरे माउंट immunofluorescence E11.5 पर Sox9, Nkx2.1 और αSMA की अभिव्यक्ति पैटर्न चुना गया। सांस की नली के ऊतकों में, Sox9 अभिव्यक्ति की सीमा हैएड एक सतत पट्टी के रूप में श्वासनली की mesenchyme (चित्रा 3 ए और बी में तीर), जबकि विकासशील फेफड़ों में सांस Sox9 उपकला (चित्रा 3 ए, बी और सी में तीर सिर) की परिधि में मनाया जाता है। Nkx2.1 एक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न फेफड़ों की श्वासनली की उपकला के लिए प्रतिबंधित कर प्रस्तुत करता है। उपकला से Wnt ligands की रोकथाम स्राव सांस की नली में mesenchyme Sox9 के कम अभिव्यक्ति का कारण बनता है, लेकिन परिधीय फेफड़ों उपकला में Sox9 अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता। ΑSMA की अभिव्यक्ति आसानी से सांस की नली mesenchyme में पता नहीं है, लेकिन धुंधला गला (पीले तीर, चित्रा 3) और पेट (चित्रा 3) के स्तर पर पाया गया।

विकासशील श्वासनली में सेल प्रसार

उपकला और mesenchyme में परमाणु अप्रसारश्वासनली की BrdU के साथ ऊतक के vivo लेबलिंग के बाद पता चला था। सांस की नली के ऊतकों की धारा को पहचानने BrdU, Sox9 और αSMA एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। सांस की नली में mesenchyme प्रसार प्रोफ़ाइल इंगित करता है αSMA दाग प्रसार के दौर से गुजर कोशिकाओं के स्तर की तुलना में अधिक है कि Sox9 दाग कोशिकाओं के दौर से गुजर प्रसार का स्तर। यह प्रसार पैटर्न WlsShhCre tracheas (चित्रा 4) में लौट जा रहा है।

आकृति 1
चित्रा 1: Wnt / β-catenin गतिविधि सांस की नली में mesenchyme ऑपरेटिव है E13.5 सांस की नली फेफड़े के ऊतकों, Axin2-lacZ और WlsShhCre से पृथक। Axin2-lacZ चूहों, एक्स-लड़की (ए और बी) के साथ दाग रहे थे। सांस की नली फेफड़े के ऊतकों के वर्गों ( 'बी' ए) फास्ट लाल के साथ counterstained थे। नोट एक्स-लड़की की कमीWlsShhCre में धुंधला; Wnt / β-catenin गतिविधि (बी) के अभाव का प्रदर्शन Axin2-Lac-जेड चूहों। एक्स-लड़की के साथ दाग Axin2 lacZ चूहों से E14.5 ऊतक भविष्य उपास्थि के छल्ले (सी) की साइटों को दर्शाया गया है; हालांकि, Axin2 गतिविधि mesenchymal condensations (तीर) (डी) की परिधि (तीर सिर) के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया था। स्केल पट्टी ए, बी और सी = 500 माइक्रोन; बी ',' डी और डी = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। सांस की नली के ऊतकों के विकास में mesenchymal संक्षेपण E13.5 सांस की नली-फेफड़ों explants PNA लेक्टिन के साथ दाग रहे थे। नियंत्रण सांस की नली ऊतक क्षेत्रों चित्रण mesenchymal सघन दिखाया गया है कोशिकाओं थे (तीर एक सी)। कोई mesenchymal condensations WlsShhCre चूहों में पाया गया (बी और डी में तीर)। सी और डी ए और बी में दिखाया गया है सांस की नली-फेफड़े के ऊतकों के निचले बढ़ाई को दर्शाती है। स्केल पट्टी ए और बी = 1 मिमी, सी और डी = 2 मिमी। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: prechondrogenic पूरे में अभिव्यक्ति पैटर्न माउंट श्वासनली Nkx2.1 और Sox9 धुंधला E11.5 explants में पाया गया था।। पैनल, एक नियंत्रण के ऊतकों की एक छवि को दर्शाया गया है, जबकि पैनल बी एक 20 माइक्रोन नियंत्रण ऊतक के एक ऑप्टिकल अनुभाग से पता चलता है। नोट WlsShhCre ऊतकों में Sox9 की mesenchymal अभिव्यक्ति की कमी (सी में तीर), बूSox9 के परिधीय अभिव्यक्ति की टी रखरखाव (सी में नोक)। αSMA धुंधला E11.5 ऊतक के trachealmesenchyme में निम्न स्तर पर पता लगाया लेकिन (डी और ई में पीले रंग की नोक) laryngeal क्षेत्र में मनाया गया, पेट (एस) और शेष हृदय के ऊतकों (सीटी) (ई)। Nkx2.1 श्वासनली और फेफड़ों (डी, ई) के विकास की उपकला में व्यक्त किया जाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Prechondrogenic mesenchyme में सेल प्रसार पैटर्न E13.5 भ्रूण की धारा विरोधी BrdU, Sox9 और αSMA एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। पैनलों सी और डी ए के उच्च आवर्धन हैं बी क्रमशः। बिंदीदार लाइनों सांस की नली उपकला की सीमा प्रतिनिधित्व करते हैं। नोट Sox9 दाग proliferative सेल (नोक सी) और αSMA दाग proliferative सेल (डी में नोक)। टी = श्वासनली, ई = घेघा। स्केल पट्टी ए और बी = 50 माइक्रोन, सी और डी = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

श्वसन तंत्र के morphogenesis अंतर्निहित घटनाओं को पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं, विशेष रूप से आयोजित करने एयरवेज के patterning के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं। पिछले अध्ययनों से पूर्व vivo तकनीक है जिसमें विकासशील explants हवा तरल interphase पर सुसंस्कृत या Matrigel 21,22 में एम्बेडेड रहे हैं का उपयोग किया है। इन अध्ययनों से पता चला है कि कैसे विकास के कारकों के विकास श्वासनली की patterning और सांस की नली उपास्थि के गठन को प्रभावित। इन अध्ययनों के लिए एक सीमा है कि ऊतक की वास्तुकला ठीक से रखरखाव नहीं है और इसलिए, वे काफी उपास्थिजनन के vivo प्रक्रिया पुनरावृत्ति नहीं हो सकता है।

दृष्टिकोण है कि हम एयरवेज आयोजित करने की प्रक्रिया में WNT सिगनल की भूमिका का अध्ययन करने के लिए चलाया पूरे माउंट धुंधला तकनीक, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इमेजिंग के साथ मिलकर vivo अध्ययन में शामिल patterning। पूरे माउंट ऊतक के एक्स-लड़की धुंधला एसई द्वारा पीछा कियाctioning और जवाबी धुंधला हो जाना, आयल वर्गों का धुंधला से अधिक लाभ प्रस्तुत करता है। पूरे माउंट धुंधला साइटों जहाँ Wnt / β-catenin गतिविधि ऑपरेटिव है की प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, दाग explants की सेक्शनिंग mesenchyme जिसमें गतिविधि विकास के रूप में आगे बढ़े स्थित था में सटीक साइटों चुना गया। उत्तरार्द्ध आयल वर्गों में β-galactosidase एंजाइम की अभिव्यक्ति का पता लगाने की तुलना में एक बेहतर और सटीक readout है। enzymatic गतिविधि वर्गों में पता लगाया जा सकता है, इस प्रक्रिया cryosections कि हमेशा उत्पन्न करने के लिए आसान नहीं होगा और छोटे नमूने की वास्तुकला की रक्षा नहीं कर सकते हैं की आवश्यकता होगी। प्रोटोकॉल इस पत्र में वर्णित में एक सीमा है, पूरे माउंट धुंधला के बाद आयल embedding के लिए नमूनों की है कि प्रसंस्करण संकेत की हानि का कारण होगा। इसलिए, नमूने एक्स-लड़की समाधान में लंबे समय तक रहने के लिए की जरूरत है और आयल embedding के लिए एक छोटा चक्र वर्गों पर अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

दूसरी ओर, पूरे माउंट immunofluorescence प्रक्रिया, तकनीक Ahnfelt-Ronne 23 द्वारा वर्णित के बाद संशोधित, सांस की नली और फेफड़े के ऊतकों के विकास के निरीक्षण दृश्य के लिए अनुमति प्रोटीन का एक परिभाषित अभिव्यक्ति पैटर्न ऐसे Nkx2.1 और जैसे प्रमुख प्रतिलेखन कारक द्वारा इनकोडिंग के साथ Sox9। जब वांछित, पूरे माउंट धुंधला छवियों के confocal सहायता प्राप्त Z ढेर के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है, सांस की नली फेफड़े के ऊतकों के विभिन्न गहराई चित्रण। छोटे explants इमेजिंग, वहीं ऊतक के समाशोधन एक मंच थाली में किया जाना चाहिए। हम मोटी धातु उपयोग कियाजहां नमूनों को मंजूरी दे दी है और imaged हैं कस्टम ऑप्टिकल नीचे के साथ मंच प्लेटों बना दिया। इस सामग्री के नुकसान से बचाता है, जबकि कदम समाशोधन के बाद छोटे ऊतक स्थानांतरित। जबकि पूरे माउंट immunofluorescence छोटे ऊतक के धुंधला के लिए एक उपयुक्त तकनीक है, हम तकनीक के लिए सीमाओं को स्वीकार करते हैं। विशेष रूप से, हम एंटीबॉडी कि प्रतिजन बेहतर समझते हैं वर्गों में के रूप में पूरे माउंट करने के लिए विरोध के भिन्न प्रदर्शन मनाया। यह समस्या तकनीक के प्रदर्शन में बाधा हो सकती है अगर कोई विकल्प नहीं एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। यह भी संभव है मूर्रे स्पष्ट साथ मेथनॉल और समाशोधन के उपयोग के संकेत मनाया में एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है। भविष्य में, हम अन्य गैर जैविक समाशोधन समाधान का परीक्षण और इस उद्देश्य के लिए ठीक से 24 प्रोटोकॉल को समायोजित करेगा। एक अंतिम विचार है कि पूरे माउंट एक निश्चित समय पर एक ऊतक में व्यक्त कुछ प्रोटीन का अध्ययन की अनुमति होगी।

पिछली रिपोर्टों की उपयोगिता से पता चला हैPNA लेक्टिन धुंधला सांस की नली के ऊतकों 21,25 के वर्गों में mesenchymal condensations पता लगाने के लिए। वर्तमान अध्ययन में, हम एक पद्धति है जिसके द्वारा धुंधला पूरे माउंट, जो श्वासनली के क्षेत्रों में से एक बेहतर दृश्य की सुविधा है जिसमें उपास्थि का गठन किया जाएगा में किया गया था की रिपोर्ट। लेक्टिन धुंधला देखभाल प्रदर्शन, नहीं पर दाग को लेक्टिन की उचित एकाग्रता का उपयोग करने में रखा जाना चाहिए, जबकि के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PNA-लेक्टिन GFP के लिए युग्मित है। ऊतक के ऑटो प्रतिदीप्ति परिणाम condensations mesenchymal करने के लिए इसी बैंड भेद करना मुश्किल बनाने अस्पष्ट हो सकती है।

अंत में, BrdU के साथ ऊतक के vivo लेबलिंग सेक्शनिंग और immunofluorescence धुंधला द्वारा पीछा सेल प्रसार कि इस तरह के PPH3 या PCNA 26,27 के रूप में विशिष्ट और स्थिर धुंधला से अधिक लाभ प्रस्तुत करता है निर्धारित करने के लिए एक व्यावहारिक तकनीक है। बाद तकनीक सीमाओं को प्रस्तुत करता है, के रूप में धुंधला के आधार पर अलग अलग होंगेसेल चक्र चरण। यह समस्या हमारे वर्णित तकनीक से सफाया कर दिया है। संयोजन में विवो लेबलिंग, embedding सेक्शनिंग और immunofluorescence के द्वारा पीछा हमें निर्धारित करने के लिए कि उपकला Wnt ligands Sox9 और α-SMA के अंतर प्रसार कोशिकाओं है कि सांस की नली उपास्थि और मांसपेशियों में 7 को जन्म देगा व्यक्त संतुलन के लिए अनुमति दी।

सारांश में, विकासशील श्वसन तंत्र के patterning का अध्ययन करने के लिए एक बहु-तकनीक दृष्टिकोण एयरवे morphogenesis के संचालन में WNT सिगनल की भूमिका की गहरी विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इन अध्ययनों से सांस की नली के ऊतकों में Wnt / β-catenin की सटीक साइटों, साथ ही सांस की नली उपकला कि विनिर्देश, सांस की नली mesenchyme सेल प्रजातियों का अंतर प्रसार, साथ ही उपास्थि के गठन के लिए आवश्यक है द्वारा प्रदान की प्रेरक और शिक्षाप्रद सिगनल चुना गया। हमारा भविष्य दिशाओं हाल ही में पहचान Wls के लिए पूरे माउंट धुंधला के अनुकूलन शामिललक्ष्य जीन, साथ ही लेक्टिन धुंधला के साथ संयोजन में पूरे माउंट immunofluorescence प्रदर्शन।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

"लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।"

Acknowledgments

हम ऊतकीय प्रक्रियाओं के साथ माइक Muntifering और confocal इमेजिंग के साथ मैट Kofron और गेल Macke की सहायता स्वीकार करते हैं। इस काम आंशिक स्वास्थ्य NHLBI के राष्ट्रीय संस्थान (डी एस के लिए K01HL115447) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti Sox9 ab. Millipore AB5535 1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab. Santa Cruz Sc-20095 1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab. Sigma A5228 1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:400, mouse
Anti Brdu ab. Abcam AB1893 1:200, sheep
Anti Brdu ab. Santa Cruz Sc-32323 1:4k, mouse
PNA Lectin Sigma L 7381
Secondary antibodies Life technologies Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6 Sigma P8131
K4Fe(CN)6 Sigma-Aldrich P3289
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
NaDOC Life Technologies 89905
NP4O Life Technologies 85124
Alcian Blue 8GX Sigma A-3157
Fisher brand super-frost plus Fisher 12-550-15
PFA (16%) EMS 15710
PBS Gibco 70011-044
Fetal Calf Serum Sigma 11K413
Blocking reagent Invitrogen Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu Sigma B5002-5g
Vectashield mounting medium Vector labs H-1000
Permount Fisher SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen Fisher C-0250-GR
Biopsy cassettes Premiere BC0109 Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1% Sigma N3020
Citric acid Sigma C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma S4641-1Kg
Trizma hydrochloride Sigma T5941-500G
Xylene Pharmco-AAPER 399000000
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Micro knives FST 10318-14
Dumont #5 ceramic coated FST 11252-50
Dumont #5CO FST 11295-20
Dumont # 5 FST 91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES Thermo Fisher
Microtome Leica RM2135
Nikon i90 Nikon Wide field microscope
NikonA1Rsi Nikon Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. 
Leica MS 16 FA Leica Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss Zeiss Automated fluorescence microscope
Leica Application suite Leica Leica imaging software
NIS Nikon Nikon imaging software
IMARIS Bitplane Imaging processing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
  3. Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
  4. Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
  5. Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
  6. Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
  7. Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
  8. Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
  9. Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
  10. Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
  11. Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
  12. Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
  13. Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
  14. Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
  15. Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
  16. Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
  17. Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
  18. Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  19. Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
  20. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  21. Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
  22. Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
  23. Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  25. Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
  26. Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
  27. Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 116 wnt श्वासनली फेफड़े उपास्थि मांसपेशियों PNA लेक्टिन immunofluorescence
WNT सिगनल का अध्ययन का आयोजन एयरवेज के patterning के दौरान
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snowball, J., Ambalavanan, M.,… More

Snowball, J., Ambalavanan, M., Sinner, D. Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways. J. Vis. Exp. (116), e53910, doi:10.3791/53910 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter