Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l'intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Introduction

Ca ²⁺ est un ion très important qu'on trouve en abondance au sein de chaque cellule dans le corps. Il a un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires différentes, y compris la croissance, la prolifération, la migration et l' apoptose ^1-4. Il est bien établi que le Ca ²⁺ peut affecter ces processus à travers les deux actions directes et indirectes, et par conséquent, les modifications des concentrations intracellulaires normales de cet ion peut facilement aboutir à des résultats négatifs pour les cellules affectées. Le SR est considéré comme la plus grande concentration intracellulaire de Ca ²⁺ magasin dans la cellule ^5. Les niveaux de l' état ​​d' équilibre de Ca ²⁺ tant dans le SR et le cytoplasme sont normalement maintenus grâce à un flux constant dans et hors des canaux Ca ²⁺ -transporting de cet organite. Les conditions stressantes imposées sur les cellules en raison de toute forme de blessure ou de maladie sont généralement associées à des changements significatifs dans SR Ca ²⁺ qui vont sur ​​d'avoir des effets à long terme sur l'ilalth de la cellule. Dans la plus grave des cas, l'incapacité d'une cellule souligné de récupérer et de maintenir l' état ​​d' équilibre SR Ca ²⁺ niveaux peuvent même aboutir à la mort par apoptose ^6-8.

Les recherches actuelles sur cellulaires Ca ²⁺ dynamique est limitée par le fait que quelques tests d'études organite le contenu de la mémoire ^de Ca directement ^9-11. La pratique la plus courante consiste à la place de la mesure cytoplasmiques ^Ca2 niveaux comme des mesures indirectes des changements dans SR Ca ²⁺ contenu ^12-14. Dans ces expériences, le Ca ²⁺ est généralement amené à être libéré du SR grâce à l'utilisation d'agents pharmacologiques provoquant la diminution de l'organelle (par exemple , la thapsigargine). Les conclusions sont ensuite tirées à l' égard des modifications apportées à SR Ca ²⁺ basé sur les fluctuations des cytoplasmiques ^Ca2 concentrations. Malgré la capacité restante pour les enquêteurs de tirer de telles conclusions dans un rond-point manner, cette méthode de mesure ^de SR Ca est clairement un moyen indirect de glaner ces informations, avec de nombreuses limitations concernant l'interprétation des données recueillies. Afin de contourner cette restriction claire, il est nécessaire de mesurer la quantité de Ca ²⁺ trouvé directement dans le réseau luminal SR.

Vital pour le résultat final d'être en mesure d'enregistrer directement intraluminaux SR Ca ²⁺ niveaux sont les outils de culture cellulaire et l'indicateur Ca ²⁺ utilisé. Pour les données référencées dans le manuscrit en cours, il est important de noter que les CMLV utilisées provenaient d'une lignée de cellules congelées. Les cellules ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum de veau nouveau - né (NCS) au- dessus des passages 22-26 pour les expériences décrites, mises en incubation à une température constante de 37 ° C avec 5% de CO ₂ d' alimentation. En utilisant la méthode courante, par exemple, les cellules ont été cultivées avec succès sur un mélange de protéines extracellulaires qui simule lal' environnement d' un grand nombre de différents types de tissus ^15. Important pour le succès le long de la veine de SR ^{Ca2 +} recherche est le type de mélange de protéines utilisé; dans ce cas, une faible variété de facteur de croissance est nécessaire pour éviter que des composants de cet outil d'affecter la signalisation régulière Ca ²⁺ et les mouvements se produisant constamment dans les cellules testées. Après une croissance réussie de cellules de test, l'indicateur de ^{Ca2 +} doit également être efficacement introduit dans ces cellules en culture. Ceci est devenu possible grâce à l' utilisation d' un vecteur adenoviral qui porte le SR-résident ^{Ca2 +} indicateur D1SR. Pour parvenir à une haute efficacité de transfection, les cellules doivent être mises en incubation avec des vecteurs viraux pendant au moins 36 à 48 heures avant l'imagerie. Cette préparation fournit un outil fiable pour mesurer Ca ^{2 +} transitoires dans la lumière SR avec une grande précision et la reproductibilité.

Indicateur D1SR utilisé dans ce protocole est une variante modifiée du D1ER Ca ²⁺ indicateur qui a été créé à l' origine par le laboratoire du Dr Roger Tsien à l'Université de Californie, San Diego, Etats - Unis ^9,16. La D1ER originale appartient à une deuxième génération de génétiquement codés Ca ²⁺ indicateurs appelés caméléons qui affichent Ca ^de sensibilités sur une gamme beaucoup plus large (0,5 à 160 uM) par rapport aux précédentes Ca ²⁺ indicateurs ^9,16. La nouvelle variante D1SR, un cadeau genre du Dr Wayne Chen (Université de l'Alberta, Canada), cependant, porte une séquence de calséquestrine mutant (au lieu d'une séquence de calréticuline comme dans le D1ER original). Le calséquestrine mutant a une liaison réduite à Ca ²⁺ qui élimine la question de la concurrence avec calséquestrine endogène dans la liaison à Ca ²⁺ dans le SR lumen ^11. L'indicateur de D1SR porte une cyan améliorée tronquée protéine fluorescente (PCP) et de la protéine fluorescente jaune (YFP) qui se lient par une protéine de liaison contenant la calmoduline modifiée (CaM) et M13 (til peptide 26-résidu de la myosine chaîne légère kinase qui se lie à CaM) séquences. La séquence CaM-M13 a été modifiée pour empêcher M13 de se lier à la calmoduline endogène. En outre, pour assurer une rétention SR, une séquence calséquestrine a été ajoutée à l'extrémité 5 'de la PCP ^11. Lorsqu'il est lié à Ca ^2+, le domaine CaM-M13 passe par des changements conformationnels qui se traduisent par une augmentation du transfert d'énergie entre la PCP et d' accompagnement YFP, qui est enregistré comme une augmentation de l'intensité du signal FRET. D'autre part, lorsque la concentration de SR luminal Ca ²⁺ gouttes, le domaine CaM-M13 passe par des changements conformationnels inverse, ce qui entraîne une diminution du transfert d'énergie entre la PCP et d' accompagnement YFP, et une baisse significative de FRET intensité du signal .

Protocol

déclaration éthique: Toutes les expériences et les procédures ont été menées en accord avec les lignes directrices de biosécurité en laboratoire de l'Université de la Colombie-Britannique, Vancouver, Canada.

1. Préparation de 35 plats Culture mm à fond de verre pour base de FRET Microscopie confocale

1. Préparer des plaques en utilisant la procédure suivante 36-48 h avant les expériences.
2. Récupérez mélange de protéines gélatineuse choisi et 0,25% de trypsine-EDTA de -20 ° C stockage et conservez-les dans un bain de glace mobiles jusqu'à utilisation.
   NOTE: Le mélange de protéine de revêtement ne doit être exposé à la température ambiante pendant une brève période de temps pour empêcher le mélange de se solidifier avant son utilisation. solution de trypsine devrait également être garder réfrigéré jusqu'à ce que nécessaire; En variante, la trypsine peut être extraite de stockage à -20 ° C après la fin de l'étape 1.5.
3. Préparer une dilution 1:25 du mélange de protéines: DMEM (pas de sérum ajoutée, réfrigérés). Transfert volume approprié de la protéine mélange / DMEM à chaque plaque en cours de préparation. Pour 35 plaques de verre à fond mm, ajouter environ 200 pi pour couvrir entièrement le cercle intérieur en verre sur le fond de la plaque.
4. Laisser les plaques reposer pendant au moins 30 min à l'intérieur de l'enceinte de sécurité et à la température ambiante. DMEM chaud avec 10% de NCS à 37 ° C dans un bain d'eau pendant cette période.
5. trypsine chaud dans un bain d'eau à 37 ° C immédiatement avant les prochaines étapes.
6. Enlever DMEM qui est actuellement en flacon de culture à l'aide d'une pipette de verre et d'aspiration. Laver étage de la fiole avec du PBS chaud stérile pour éliminer les résidus restants DMEM.
7. Déloger les cellules musculaires lisses préalablement cultivées à partir du bas du ballon:
   REMARQUE: Fiole jour a été établie à cette étape pour permettre aux cellules d'atteindre une confluence souhaitée (environ 80%) avant la préparation de la plaque. Les cellules ont été initialement mis en suspension dans le flacon dans 20 ml de DMEM avec 10% de NCS et incubées à 37 ° C avec 5% de CO ₂ d' alimentation pendant 24 heures, après quoi DMEM approvisionnement a été rafraîchi et les cellules ont été retournés dans l'incubateur. DMEM a été rafraîchie veillery 48 heures suivant ces étapes initiales jusqu'à ce que les cellules ont atteint la confluence.
   1. Laver rapidement flacon avec 1 ml de trypsine, puis retirez 1 ml de trypsine par aspiration.
   2. Ajouter encore 1 ml de trypsine et laisser pendant une période plus longue (environ 30 à 60 secondes), swishing flacon pour assurer l'enzyme en contact avec l'ensemble du fond du flacon.
   3. Observez combien les cellules ont détaché au microscope jusqu'à ce que satisfait de la séparation du flacon. solution bruissement de trypsine Alternate et le détachement des cellules vérification jusqu'à satisfaits proportion de cellules séparées du flacon.
      NOTE: Le flacon peut être retourné à l'incubateur pendant environ 30-60 secondes pour accélérer ce processus à 37 ° C.
   4. Une fois que les cellules ont été délogées à l' aide de trypsine, ajouter DMEM frais avec 10% NCS dans le ballon pour arrêter la réaction de la trypsine (volume suffisant pour que la trypsine forme 1/8 du volume total dans la fiole).
      NOTE: Par exemple, lorsque vous utilisez un 250 ml flacon de culture, ce seraitsoit 7 ml de DMEM ajouté à la 1 ml de trypsine pour aboutir dans 8 ml de solution de cellules.
8. Transfert solution de cellules de la fiole à un (marqués) 50 ml tube conique propre résultant.
9. Ajouter 1 ml de DMEM frais plus 10% NCS à chaque plaque en cours de préparation (moyenne suffisante pour durer 24 heures).
10. Retourner doucement le tube contenant la solution de cellules à plusieurs reprises pour briser toute pastille qui aurait pu se former.
11. Pipette désiré volume de solution cellulaire doucement mélangé dans chaque plaque.
    REMARQUE: Le numéro CML recommandé plaqué pour ce protocole est de 0,5-0,8 x 10 ⁶ par 35 boîtes de culture de mm. Ces chiffres peuvent varier en fonction du type de cellule et doivent être testés et modifiés par chaque laboratoire.
12. Agiter chaque plaque à fond dans le sens horaire / anti-horaire pour assurer une répartition égale des cellules à travers à fond de verre.

2. Transfection transitoire avec vecteur adénoviral de transport Indicateur ^de D1SR Ca

1. Après addition de moidium et solution de cellules à chaque plaque, laisser les plaques à incuber à 37 ° C avec 5% de CO ₂ d' alimentation pendant au moins 1 heure pour permettre aux cellules de se fixer correctement au verre sur le fond des plats. Vérifiez les plaques au microscope à intervalles de 15 minutes jusqu'à ce que les cellules sont clairement fixés.
2. Récupérer adénovirus-D1SR aliquote de -80 ° C stockage et maintenir dans un bain de glace mobile pour transporter au cabinet de sécurité biologique.
3. dose souhaitée pipette (multiplicité d'infection de 100) D1SR refroidie à chaque plaque.
   NOTE: Le calcul du volume de solution adénoviral nécessaire par plaque dépend du titre du virus dans la solution mère d'origine, qui est présenté comme l'unité de formation de plaques (PFU). Sur la base de notre expérience, nous recommandons une multiplicité d'infection (MOI) de 100, ce qui est interprété comme le nombre ou particules virales nécessaires pour infecter une cellule de muscle lisse (SMC) dans la plaque de culture.
4. Incuber les cellules infectées à 37 ° C avec 5% de CO ₂ d' alimentation O / N.
5. Le lendemain, reconstituer les cellules avec 1 ml de DMEM frais plus 10% NCS.
6. Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 ° C dans 5% de CO ₂ O / N.

3. Mesure de la SR Luminal Ca ²⁺ Utilisation basée FRET-imagerie confocale

1. Après O / N incubation, éliminer le milieu de culture de la plaque.
2. Laver la plaque de culture avec 1 ml de tampon chaud physiologiques HEPES-PSS contenant (en mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucose 10, KCl 5, HEPES 5, _CaCl2 1,5 et _MgCl2 1 (pH 7,4) à trois reprises.
3. Ajouter 1 ml de tampon chaud frais HEPES-PSS juste avant le début de l'enregistrement.
4. Effectuer l'imagerie initiale à l'aide de l'application FRET SE (Sensitized Emission) (ou une fonction similaire) sur le logiciel associé au microscope confocal.
   1. Une fois que l'application est ouverte, cliquez sur l'onglet "Configuration" pour régler les paramètres pour obtenir des conditions expérimentales souhaitées.
   <li> modifier manuellement les paramètres de canal de sorte que les cellules sont excités en séquence à 440 nm (pour le donneur et FRET canaux) et 513 nm (pour le canal accepteur). Collecter les longueurs d'onde d'émission à 488 nm (pour donneur) et 535 nm (pour FRET et accepteur).
   2. Réglez l'intensité de la lumière à l'émission de 15%, avec 150 ms excitation temps d'exposition des cellules (temps d'enregistrement pour trois séquentiel donneur CFP, FRET et canaux accepteur YFP) et 10 seconde d'intervalle entre les expositions.
5. Stabiliser plaque sur la platine du microscope.
6. Utilisez le bouton "Live" pour vérifier la résolution d'image. Tweak paramètres encore jusqu'à la résolution souhaitée est atteinte.
7. Toujours sous l'onglet "Configuration", prendre une image de l'échantillon en utilisant le bouton "Capture d'image".
8. Passons à l'onglet "Evaluation", choisissez la méthode appropriée pour calculer l'efficacité de FRET pour les expériences étant effectuées. Méthode 3, en utilisant le calcul Ratiométrique [E _A (i) = B / A], Est recommandé pour les expériences impliquant des caméléons tels que l'indicateur de D1SR.
9. Commutation sur l'onglet "Graph" pour être en mesure d'observer les valeurs d'intensité enregistrées sous forme de graphique pendant l'expérience.
10. Dessinez un retour sur investissement dans la visionneuse d'image pour observer l'intensité moyenne correspondante de cette zone d'intérêt sur le graphique que l'expérience produit.
    NOTE: enquêteur peut également choisir de dessiner plusieurs ROIs et ont correspondant intensités enregistrées et affichées simultanément sur le graphique. Alternativement, les enquêteurs peuvent présenter un seul retour sur investissement pour l'enregistrement initial, et passez à décrire plusieurs ROIs à un moment plus tard, en ouvrant le fichier d'expérience sur une version de données orientée analyse-du logiciel.
    NOTE: De plus amples détails sur les étapes nécessaires pour mettre en place des expériences à base de FRET peut être trouvée dans FRET manuels de l'assistant d'application. Si le microscope est pas équipé de l'Assistant FRET, le protocole suivant peut être utilisé pour configurer les paramètres pourl'enregistrement manuellement.
11. Commencer l'enregistrement et de permettre la collecte de données pendant au moins 3 min pour assurer un enregistrement basale stable du signal avant l'introduction de l'agent d'intérêt.
12. Introduire Ca ²⁺ agent de -moving (par exemple 2 uM thapsigargine; 100 nm endothéline-1) comme un outil d'appauvrissement SR Ca ^2+, par pipetage manuellement la dose prédéterminée directement dans la plaque à un endroit aussi près de la région d'intérêt étant enregistré que possible. Continuer l'enregistrement pour un traitement désiré de poste de temps.
13. Capture des images ratiométrique FRET série (512 x 512 pixels) avec un objectif à immersion dans l'huile 63X du microscope confocal inversé en utilisant l'application de FRET SE.
14. Recueillir des données résultant de l'imagerie à partir d'un groupe de 5-10 CML dans chaque région d'intérêt (ROI) et ensuite formater et analyser l'utilisation de logiciels à base de statistiques.
    1. Pour enregistrer des données pour une utilisation ultérieure, cliquez-droit sur la trace enregistrée et choisissez l'option "Exporter" pour save la feuille de calcul avec enregistrées intensités de signal moyennes sur le lecteur choisi de l'enquêteur.
    2. Normaliser les données de chaque expérience individuelle en divisant chaque point de données par la valeur d'intensité à partir observé au point 0 sec de temps.
    3. Importer des données normalisées à partir des feuilles de calcul dans un fichier de projet de programme statistique en copiant et collant les lignes de données pertinentes à partir de leur origine feuille de calcul / sec manuellement.
    4. Générer automatiquement des graphiques correspondant aux ensembles de données collées dans le programme.
       REMARQUE: les paramètres par défaut du programme génèrent des graphiques linéaires à partir des données importées. Type de graphique affiché peut être modifié en cliquant sur le bouton "Choisir un type de graphique différent» dans le cadre du "changement" cap trouvés dans la barre d'outils principale.
    5. données Pool représentant plusieurs essais indépendants au sein d'un groupe plus large d'expériences identiques dans une seule fiche de données pour produire une trace moyenne pour le test spécifique effectué.
4. Préparation de l'indicateur de ^{Ca2 +} cytoplasmique
1. Dissoudre 0,0125 g Pluronic acide (PA) dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tube de microcentrifugeuse noir (peut avoir pour réchauffer le tube dans un bain d'eau mobile pour aider à dissoudre PA).
2. Extraire un tube (50 ug) du ^{Ca2 +} cytoplasmique colorant indicateur (Fluo-4 AM) de stockage de -20 ° C.
3. Envelopper le tube dans une feuille de colorant pour le protéger autant que possible de tout contact avec la lumière.
4. Introduire à la pipette 45 ul de la solution dans le DMSO + PA dans le tube contenant le colorant. Enveloppez solution DMSO + PA dans du papier et conserver à la température ambiante.
5. Mélanger le contenu du tube à fond en pipetant une solution de haut en bas plusieurs fois. Alternativement, sonication le tube de teinture pendant 10 min.
   NOTE: Toute méthode de distribution soigneusement le colorant dans la solution DMSO + PA sera suffisant; il est simplement une question de préférence de l'investigateur. Si l'enquêteur choisit de sonication solution, ildevrait être fait dans une zone / pièce isolée où les autres ne seront pas affectés par le bruit. Enquêteur devrait également utiliser des silencieux lourds pour protéger les oreilles.
   1. Si la solution sonication, insérer le tube de papier d'aluminium enveloppé contenant le colorant dans un support de tube de mousse et place à l' intérieur du plein (avec dH ₂ O) bain sonicateur 2/3.
   2. Lieu bain sonicateur en région isolée / chambre et machine de mise sous tension (assurer un casque protecteur est en place avant de commencer processus de sonication). Laissez de la place et de laisser la machine en cours d'exécution pendant 10 minutes avant de l'arrêter et de récupérer le tube (garder enveloppé dans du papier pour protéger de la lumière aussi longtemps que possible).
6. Aliquoter la solution maintenant complètement mélangé dans des tubes de microcentrifugation sombres (5 pi par tube, devrait être en mesure de faire 10 tubes total).
7. Enveloppez chaque tube aliquote dans du papier. tubes d'étiquetage et de stocker dans déshydratant à -20 conditions ° C jusqu'à utilisation.

5. Mesure de cytoplasmique Ca ²⁺

1. Suivez les étapes à 01/01 au 01/12 pour préparer des plaques de culture de CML aortiques de rat.
2. Retirez le milieu de culture de la plaque au niveau post culture de 48 h.
3. Retirer la aliquote préalablement préparée de ^{Ca2 +} cytoplasmique indicateur (5 pi) de -20 ° C et maintenir le stockage dans un bain de glace mobiles jusqu'à leur utilisation.
4. Laver la plaque de culture avec 1 ml de tampon chaud physiologiques HEPES-PSS contenant (en mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucose 10, KCl 5, HEPES 5, _CaCl2 1,5 et _MgCl2 1 (pH 7,4) à trois reprises.
5. Mélanger l'indicateur avec 1 ml de chaud HEPES-PSS et le charger sur la plaque de culture.
6. Incuber CML avec l'indicateur pendant 1 heure à température ambiante (24 ° C).
7. Retirer l'indicateur de la plaque de culture et laver avec 1 ml chauds physiologiques HEPES-PSS tampon trois fois.
8. Ajouter 1 ml de tampon chaud frais HEPES-PSS juste avant le début de l'enregistrement.
9. Capture d'images de série (512 x 512 pixels) avec un o 63Xobjectif il-immersion du confocal microscope inversé.
   1. Modifier manuellement les paramètres de sorte que les cellules sont excités à 488 nm, et les longueurs d'onde d'émission sont recueillies à 555 nm avec une vitesse de 700 Hz de balayage.
   2. Réglez l'intensité de la lumière à l'émission de 15%, avec 150 msec temps d'exposition d'excitation des cellules (la quantité de temps que les cellules sont exposées à la lumière à des intervalles de temps désignés pendant l'enregistrement) et intervalles de 5 secondes entre les expositions.
10. Stabiliser plaque sur la platine du microscope et de commencer l'enregistrement.
11. Enregistrez pendant au moins 3 min pour assurer un enregistrement basale stable du signal avant l'introduction de l'agent d'intérêt.
12. Introduire Ca ²⁺ agent de -moving (par exemple 2 uM thapsigargine) comme un outil d'appauvrissement SR Ca ²⁺ (comme décrit à l' étape 3.16) et continuer à enregistrer pour la quantité désirée de post - traitement de temps.
13. Enregistrez l'intensité du signal en utilisant un logiciel spécifique au microscope par fluorescence moyenne signaux (F / F ₀₎ à partir d' un groupe de 5-10 CML dans chaque région d'intérêt (ROI). Collecter, le format, et analyser les données résultant de l'imagerie en utilisant un logiciel d'analyse de données. Voir les étapes 3.18.1-3.18.5 pour la description de la collecte de données et d'analyse à l'aide de ce logiciel.

Representative Results

Cette section fournit des exemples des résultats qui peuvent être obtenus en utilisant la méthode décrite pour capturer SR luminal ^Ca2 données de concentration, par rapport à la manière couramment employée de mesurer indirectement les changements à organites les concentrations de magasin ^de Ca en observant les fluctuations cytoplasmique Ca ²⁺ .

La figure 1A montre un instantané d'une région d'intérêt (ROI) de la culture SMC transfectées avec l' adénovirus de D1SR dans le canal YFP (514 nm d' excitation / 535 nm d'émission). Comme on le voit, bien que tous les CML sont positives pour l' expression de D1SR, il est évident que les niveaux d'expression de l' indicateur D1SR varient entre les différentes cellules au sein de la même retour sur investissement. La figure 1B montre une projection en 2-D d'une image de fluorescence d'un SMC transfectée avec le D1SR adénovirus (canal YFP), qui présente une image claire de Ca ²⁺ répartitionau sein du réseau luminal SR expansive. Figure 1C présente la distribution de l' indicateur D1SR dans le SMC en utilisant CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) et YFP (514/535 nm) des filtres passe-bande.

Nous montrons aussi des exemples de Ca ²⁺ traces de signaux obtenus à partir de surveiller le mouvement de cet ion ciblé dans le SR, en utilisant le test clair de l' exposition aiguë des cellules à un agent de SR vider thapsigargine (2 uM) (Figure 2). Comme on le voit sur ​​la figure 2A et 2B, la thapsigargine induit une baisse de la teneur en ^{Ca2 +} SR ([Ca ^2+] _SR).

Sur la figure 3A, on a représenté des images représentatives de CML cultivées chargées de l'indicateur de ^{Ca2 +} cytoplasmique traité avec un agent SR vidant thapsigargine (2 uM). Le pic transitoire observé dans enregistré Ca ²⁺ de signal ( 2+ libération dans le cytoplasme de la SMC, même si la source des Ca ^{2 +} transitoires ne peut pas être explicitement identifié.

La figure 4A montre des clichés représentatifs de CML en culture exprimant le SR calcium indicateur D1SR et traités avec 100 nm de l' endothéline-1. Comme le montre dans les deux figures 4A et 4B, l' endothéline-1 induit une baisse lente, mais constante SR teneur en calcium , telle que mesurée par une baisse du signal D1SR FRET. Comme cela est évident, le protocole de FRET permet ratiométrique important étude des mouvements ^{Ca2 +} directement liés au mode d'action de l'agent utilisé. La mesure directe du mouvement de cet ion dans / à partir du plus grand magasin Ca ²⁺ dans la cellule de cette manière est utile pour fournir des résultats représentatifs de Ca ²⁺ dynamique directement concernant les actions du SR ou en raison du changement s dans SR environnement de lumière.

Figure 1. Répartition de la SR Ca ²⁺ indicateur D1SR chez le rat CML aortiques. (A) l' image représentant représentant de la culture SMC transfectées avec D1SR vecteur andenoviral après l'infection de 48 heures. (B) de projection 2-D d'une image de fluorescence de la distribution dans un D1SR SMC cultivées en utilisant le canal YFP (514 nm d' excitation / émission 535 nm). (C) de l' instantané d'un représentant SMC transfectées avec indicateur de D1SR utilisant CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) et YFP (514/535 nm) des filtres passe-bande. Barres d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Thapsigargin provoque une baisse significative de la [Ca ^2+] _SR. (A) en temps réel des instantanés de pseudocolor (canal FRET) de rat en culture CML aortiques transfectées avec D1SR et traités avec 2 uM de thapsigargine montrant une diminution de l'intensité de signal indiquant une baisse significative de SR Ca ²⁺ contenu en raison de la thapsigargine induite-Ca ²⁺ libération. (B) trace représentant pour F / F ₀ valeur dans les CML cultivées traitées avec 2 uM thapsigargine confirmant une baisse significative de [Ca ^2+] _SR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figurer 3. Thapsigargin provoque une augmentation significative de la cytoplasmique Ca ²⁺ ([Ca ^2+] _i). (A) des clichés représentatifs de l' aorte de rat en culture CML chargées de ^{Ca2 +} cytoplasmique témoin et traité avec 2 uM de thapsigargine. Comme on le voit, la thapsigargine provoque une augmentation significative de l'intensité du signal dans le cytoplasme , en raison de la libération de Ca ²⁺ de la SR. (B) de trace représentant pour F / F ₀ valeur dans les CML cultivées traitées avec 2 uM de thapsigargine. L'augmentation représentée dans le signal Ca est considéré comme proportionnel à la quantité de Ca ²⁺ libéré de la SR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. endothéline-1 provoque une baisse significative de la [Ca ^2+] _SR. (A) en temps réel des instantanés de pseudocolor (canal FRET) de rat en culture CML aortiques transfectées avec D1SR et traités avec 100 nm endothéline-1 montrant une lente mais diminution constante de l'intensité du signal indiquant une baisse significative de la SR teneur en Ca ²⁺ induite en raison de l' endothéline-Ca ²⁺ pour la libération SR. (B) de trace représentant pour F / F ₀ valeur dans CML cultivées traitées avec 100 nm de l' endothéline-1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit la transfection de CMLV avec l'adénovirus D1SR pour étudier les concentrations de ^{Ca2 +} dans la lumière du SR. Cette méthode permet la mesure directe de ^{Ca2 +} à l'intérieur de cet organite, ainsi que son mouvement vers / hors de la RS à la suite de l'application de différents agents de calcium en mouvement. Cette méthode présente de nombreux avantages pour les chercheurs qui travaillent à une compréhension globale de la façon dont les changements à SR et cytoplasmiques ^Ca2 niveaux affectent la santé cellulaire globale et comment ces changements sont liés entre eux . Observation traditionnelle de ^{Ca2 +} intracellulaire mouvement implique le suivi des modifications apportées à seulement cytoplasmiques niveaux de ^{Ca2 +.} Un avantage important résultant de l'utilisation des D1SR ou similaires constructions, par conséquent, est la capacité de surveiller le mouvement de cet ion impliquant un organite spécifique tel que le SR, plutôt que d'avoir à tirer des conclusions vagues sur l'effet des agonistes de la SR parobserver indirectement des changements à des niveaux cytoplasmiques ^{Ca2 +} induits par une telle manipulation. Dans la même veine, les agents qui servent à affecter SR Ca ²⁺ spécifiquement peuvent être utilisés plus efficacement pour évaluer leurs effets sur les deux organites cellulaires et concentrations de ^{Ca2 +} large de cellules et la santé globale. Elle est due à ces avantages que la transfection de cellules cultivées avec D1SR fournit un lien direct, ainsi que gratuit, méthode de mesure des changements à intraluminaux SR Ca ²⁺ des niveaux plus. Il est également important le fait que ce modèle fournit un outil pour mesurer les variations de concentration en ^{Ca2 +} dans le réseau SR en réponse à des agents pharmacologiques ou physiologiques qui sont connus pour induire un stress cellulaire ou des réponses fonctionnelles spécifiques. Cela sera possible en générant une courbe d'étalonnage pour l'indicateur D1SR dans toute cellule d'intérêt. La concentration en calcium au sein de l'ER / SR peut alors être calculée en calibrant rapport de D1SR normalisée (F / F ₀) Par rapport à la courbe d'étalonnage standard , comme décrit précédemment ^{10, 11.}

Une limitation du protocole décrit ici est le manque d'information disponible sur l'utilisation de la construction de D1SR dans d'autres types de cellules. Cette méthode a jusqu'ici été couronnée de succès pour CML de rat dans nos études multiples fois ^13-15, bien que son utilisation avec d' autres types de cellules a jusqu'à présent été limitée. Pour le succès de cette méthode, il est essentiel que toutes les précautions sont prises pour assurer la progression saine des étapes de culture cellulaire. Il est donc important d'utiliser un matériau approprié permettant la croissance des cellules sur des plaques, telles que les nombreuses substances gélatineuses à base de protéines disponibles à l'achat qui ont fait leurs preuves pour promouvoir une croissance suffisante des CML aortiques de rat sur des plaques de microscopie à fond de verre. Variabilité dans le succès de la transfection avec D1SR et imagerie ultérieure peut être observée si les cellules ne sont pas préparés au cours de leurs passages optimaux et à haute confluence. Les modifications apportées à phenotype inhérent à l'utilisation prolongée de la même lignée cellulaire peut conduire à une transfection optimale et un signal faible étant obtenues pendant la phase d'imagerie. Les limitations impliquées dans l'utilisation de ce procédé est donc principalement celles qui sont faites inévitable par les travaux de culture cellulaire requise, comme les expériences utilisant la construction d'D1SR doivent être préparés pour au moins 36 à 48 heures avant leur exécution afin d'assurer la confluence des cellules pour l'imagerie et suffisamment de temps pour l'incubation des cellules en croissance par l'adénovirus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.