Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Introduction

Ca ^{2 +} vücuttaki her hücre içinde bolca bulunan çok önemli bir iyon olduğunu. Bu büyüme, çoğalma, göç ve apoptosis ^1-4 dahil olmak üzere birçok farklı hücresel fonksiyonları, önemli rolleri vardır. İyi Ca ^{2 +} hem doğrudan hem de dolaylı eylemlerle bu süreçleri etkileyebilir olduğunun tespit edilmesi ve bu nedenle, bu iyonun normal hücre içi konsantrasyonları değişiklikleri kolayca etkilenen hücreler için olumsuz sonuçlara neden olabilir. SR hücresinin ⁵ içinde en büyük hücre içi Ca ^{2 +} mağaza olarak kabul edilir. SR ve sitoplazma hem de Ca ²⁺ kararlı durum düzeyleri normal içine ve bu organel Ca ²⁺ -transporting kanalları dışında sürekli bir akış yoluyla korunur. Nedeniyle yaralanma ya da hastalık herhangi bir biçimde hücrelere dayatılan stresli koşullar genellikle onun üzerinde uzun süreli etkilere sahip gitmek SR Ca önemli değişiklikler ²⁺ ile ilişkiliHücrenin alth. Olguların çoğunda şiddetli, stresli bir hücrenin yetersizlik kurtarmak için ve kararlı durum SR Ca korumak ²⁺ seviyeleri bile apoptozis ^6-8 ölümle sonuçlanacak olabilir.

Hücresel Ca ^{2 +} dinamikleri güncel araştırma az sayıda çalışma testi Ca ²⁺ mağaza içeriği doğrudan ^9-11 organel gerçeği ile sınırlıdır. En yaygın uygulama yerine SR Ca ^{2 +} içerik ^12-14 değişikliklerin dolaylı ölçümleri gibi sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri ölçümü içerir. Bu deneylerde, Ca ^{2 +} yaygın organel en azalmasına neden farmakolojik ajanların (örn thapsigargin) kullanılarak SR serbest bırakılmasını indüklenir. Sonuçlar daha sonra sitoplazmik Ca ^{2 +} konsantrasyonları dalgalanmalara göre SR Ca ²⁺ değişiklikler ile ilgili çizilir. dolambaçlı ma böyle sonuçlara varmak için araştırmacılar için kalan yeteneğine rağmennner, SR Ca ²⁺ ölçüm bu yöntem toplanan verilerin yorumlanması ile ilgili birçok sınırlamalar bu bilgileri, toplamak için dolaylı yoldan açıkça. Bu açık kısıtlama atlamak için, SR lümen ağ içinde doğrudan bulundu Ca ²⁺ miktarını ölçmek için gereklidir.

Doğrudan intraluminal SR Ca ^{2 +} rekor seviyelere edememek nihai sonucu açısından hayati hücre kültürü araçları ve kullanılan Ca ^{2 +} göstergesidir. Mevcut yazıda referans veriler için, kullanılan VSMC donmuş hücre hattından gelen dikkat etmek önemlidir. Hücreler,% 5 _CO2 kaynağı ile sabit bir 37 ° C 'de kuluçkaya yatırılır Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) + belirtilen deneyler için geçitlerin 22-26 fazla% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS), kültürlenmiştir. Mevcut yöntem kullanılarak, örneğin, hücreler, çok başarılı bir şekilde ekstrasel- simüle eden bir protein karışımı ile yetiştirilendokuda ^15, birçok farklı türde çevre. SR Ca ven boyunca başarısı için önemli ²⁺ araştırma kullanılan protein karışımı türüdür; Bu durumda, düşük büyüme faktörü çeşitli normal Ca2 ⁺ sinyali etkileyen hareketleri sürekli olarak test edilen hücreler içinde meydana gelen bu aracın bileşenlerini önlemek için gerekliydi. Test hücrelerinin başarılı büyümenin ardından, Ca ^{2 +} göstergesi de etkin bir şekilde bu kültür hücreleri devreye sokulmalıdır. Bu SR-yerleşik Ca ²⁺ göstergesi D1SR taşıyan adenoviral bir vektör ile mümkün hale gelmiştir. Yüksek bir transfeksiyon verimliliği elde etmek için, hücreler önce, görüntüleme için en az 36-48 saat boyunca viral vektörler ile inkübe edilmesi gerekir. Bu hazırlık ca yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik SR lümeninde ²⁺ geçişlerini ölçmek için güvenilir bir araç sağlar.

Bu protokolde kullanılan D1SR gösterge D1ER Ca değiştirilmiş çeşididir ²⁺ iBaşlangıçta California Üniversitesi'nden Dr. Roger Y. Tsien laboratuarında, San Diego, ABD ^9,16 tarafından oluşturulan ndicator. Orijinal D1ER önceki Ca ^{2 +} göstergelere ^9,16 oranla çok daha geniş aralık (0,5-160 uM) üzerinden Ca ²⁺ hassasiyetleri göstermek cameleons denilen genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri ikinci nesil aittir. Yeni varyant D1SR Dr. Wayne Chen (Alberta, Kanada Üniversitesi'nden) bir tür hediye, ancak, bir mutant calsequestrin dizisi (yerine orijinal D1ER gibi bir kalretikülinden dizisi) taşır. Mutant calsequestrin bir ¹¹ lümen SR içinde Ca ^{2 +} bağlayıcı endojen calsequestrin rekabet sorununu ortadan kaldıran Ca ²⁺ bağlanma azalttı. D1SR göstergesi kesik geliştirilmiş siyan floresan proteini (OBP) ve sarı floresan protein (YFP) modifiye kalmodulin (CaM) ve M13 içeren bir bağlayıcı protein tarafından bağlanan (t taşırCaM) dizilerine bağlanan miyozin hafif zincir kinaz o 26-kalıntı peptit. CaM-M13 sekansı, endojen kalmodulin bağlanmasını M13 önlemek için modifiye edilmiştir. Ayrıca, SR tutulmasını sağlamak için, calsequestrin sekansı CFP ¹¹ 5 'ucunda eklenmiştir. ^{Ca2 +} bağlandığında, Eksantrik M13 alan FRET sinyal yoğunluğunda bir artış olarak kaydedilir yan CFP ve YFP arasında enerji transferi bir artışa neden şekilsel değişiklik geçer. ^{2 +} SR lümen Ca konsantrasyonu düştüğünde Öte yandan, Eksantrik M13 alan komşu CFP ve YFP ve FRET sinyal yoğunluğunda belirgin bir düşüş arasındaki enerji transferinde bir azalma ile sonuçlanır ters şekilsel değişiklik geçer .

Protocol

Etik deyimi: Bütün deneyler ve prosedürler British Columbia, Vancouver, Kanada Üniversitesi Laboratuvar Biyogüvenlik kurallarına anlaşma yapılmıştır.

FRET tabanlı Konfokal Mikroskopi için 35 mm Cam-bottom Kültür Yemekleri hazırlanması 1.

1. Aşağıdaki yordam 36-48 saat önce deneyler kullanarak tabak hazırlayın.
2. C depolama ° -20 seçilen jelatinimsi protein karışımı ve% 0.25 tripsin-EDTA Al ve kullanıma kadar mobil buz banyosu içinde saklayın.
   NOT: Kaplama proteini karışımı, sadece kullanımdan önce katılaşmasını karışımı önlemek için kısa bir zaman süresi için oda sıcaklığına maruz olmalıdır. ihtiyaç kadar Tripsin çözümü de soğutulmuş tutmak gerekir; Seçenek olarak ise, tripsin 1.5 adım tamamlandıktan sonra -20 ° C depolama alınabilir.
3. DMEM (hiçbir eklenen serum, soğutulmuş): protein karışımı 1:25 seyreltme hazırlayın. Her plaka hazırlanan protein karışımı / DMEM uygun hacimde aktarın. 35 mm cam tabanlı plakalar için tam plakanın altındaki iç cam daire kapsayacak şekilde yaklaşık 200 ul ekleyin.
4. güvenlik kabini içinde ve oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle oturmaya plakaları bırakın. Bu süre içinde, su banyosu içinde 37 ° C,% 10 NCS ile sıcak DMEM.
5. hemen önce sonraki adımlara 37 ° C su banyosunda sıcak tripsin.
6. Bir cam pipet ve emme kullanarak kültür şişelerinde şu anda DMEM çıkarın. Sıcak steril PBS ile balonun yıkayın zemin kalan DMEM artıklarını çıkarın.
7. şişeyi alttan önceden kültüre düz kas hücreleri çıkarmak:
   NOT: Flask hücreleri plaka hazırlanmasından önce istenen confluency (yaklaşık% 80) ulaşmak için izin vermek için bu adımı gün kuruldu. Hücreler ilk olarak% 10 NCS DMEM, 20 ml bir şişe içinde süspansiyon haline getirilmiş ve DMEM kaynağı tazelendi ve hücreler inkübatöre geri konuldu, sonra, 24 saat için,% 5 _CO2 kaynağı ile 37 ° C'de inkübe edildi. DMEM eve tazelendiHücreler birleşmeye ulaşana kadar ry 48 saat bu ilk adımları izleyerek.
   1. Yıkama tripsin 1 ml hızlı şişe ve daha sonra emme ile 1 ml tripsin çıkarın.
   2. Tripsin bir 1 ml ekleme ve enzim, şişenin tüm alt ile temas sağlamak için balon swishing, daha uzun bir süre (yaklaşık 30-60 saniye) bekletin.
   3. şişeden ayrılma memnun kadar mikroskop altında müstakil ne kadar hücreler gözlemleyin. şişeden ayrılan hücrelerin oranı ile memnun kadar alternatif hışırtı tripsin solüsyonu ve kontrol hücre dekolmanı.
      NOT: şişesi 37 ° C'de bu süreci hızlandırmak için yaklaşık 30-60 saniye boyunca inkübatör iade edilebilir.
   4. Hücreler tripsin kullanılarak yerinden alındıktan sonra (tripsin şişede toplam hacminin 1/8 ^inci oluşturacak şekilde yeterli hacmi), tripsin reaksiyonu durdurmak için şişeye% 10 NCS ile taze DMEM ekleyin.
      Not: 250 ml'lik bir kültür şişesi ile, örneğin, bu olur7 mi DMEM hücre çözeltisine 8 ml ile sonuçlanması tripsin 1 ml üzere eklenir.
8. Temiz (etiketlenmiş), 50 ml konik tüp şişeye hücre çözeltisi elde transferi.
9. Her plaka 1 ml taze DMEM artı% 10 NCS ekle (yeterli ortam 24 saat sürecek) hazırlanmaktadır.
10. Yavaşça tüp oluşmuş olabilecek pelet kırmak için hücre çözümü birden çok kez içeren ters çevirin.
11. Pipet Her plaka içine yavaşça karma hücre çözeltisinin hacmi istenen.
    NOT: Bu protokol için kaplama önerilen SMC'lere numarası 35 mm kültür kaplarına başına 0.5-0.8 x 10 ^6. Bu numaralar hücre tipine bağlı olarak değişebilir ve her bir laboratuar tarafından test edilmiş ve modifiye edilmelidir.
12. Cam alt kısmında hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için iyice / saat yönünün tersine her plaka girdap.

D1SR Ca ²⁺ Göstergesi Taşıma adenoviral Vektör 2. Geçici Transfeksiyon

1. Benim ilavesinden sonradium ve her bir plakanın hücre çözeltisi hücre yemekler altındaki cam doğru bağlamak için izin vermek için en az 1 saat boyunca _CO2 kaynağı 5% ile 37 ° C'de inkübe plakaları bırakın. Hücreler açıkça bağlı olan kadar 15 dakika aralıklarla mikroskop altında plakaları kontrol edin.
2. -80 ° C depolama adenovirüs-D1SR kısım Al ve biyolojik güvenlik kabini için taşımak için mobil buz banyosu içinde tutmak.
3. Pipet Arzu edilen doz, her plakaya soğutulmuş D1SR arasında (100 enfeksiyon çokluğu).
   Not: plaka başına gerekli adenoviral çözelti hacmi hesaplama plak oluşturucu birim (pfu) olarak gösterilen orijinal stok solüsyonu, virüs titresi bağlıdır. Bizim deneyime dayalı, biz kültür plakasına bir düz kas hücresi (SMC) bulaştırmak için gerekli sayı veya virüs partikülleri olarak yorumlanır 100 enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı), çokluğu öneriyoruz.
4. % 5 _CO2 kaynağı O / N 37 ° C 'de enfekte hücreleri inkübe edin.
5. Ertesi gün, taze DMEM 1 ml artı% 10 NCS hücreleri doldurmak.
6. _CO2 göre O / N,% 5 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde inkübe edin.

FRET tabanlı Confocal Görüntüleme Kullanılması 3. Ölçüm SR Lüminal Ca ²⁺

1. O / N inkübe edildikten sonra, plaka kültür ortamı çıkarın.
2. Ihtiva eden 1 ml ılık fizyolojik Hepes-PSS tamponu ile kültürü plakası yıkayın (mmol·L bölgesindeki ^{- 1)} NaCl 140, glükoz 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1.5 ve _MgCI2 1 (pH 7.4) ile üç kez.
3. hemen önce kayıt başlamadan 1 ml taze sıcak HEPES-PSS tamponu ekleyin.
4. konfokal mikroskop ilişkili yazılım üzerinde FRET SE (Hassaslaþan Emisyon) uygulaması (veya benzer bir özellik) kullanarak başlangıç ​​görüntüleme gerçekleştirin.
   1. Uygulama açıldıktan sonra, istenilen deneysel koşullar elde etmek için ayarları yapmak için "Setup" sekmesine tıklayın.
   <hücreleri (donör için ve kanallar FRET) 440 nm'de sırayla heyecan duyuyoruz ve (alıcı kanalı için) 513 nm böylece li> Manuel kanal ayarlarını değiştirin. (Donör için) 488 nm ve 535 nm (FRET ve alıcı için) emisyon dalga boylarını toplayın.
   2. ve maruziyet arasında 10 sn aralıklarla (üç ardışık CFP donör, FRET ve YFP alıcı kanalları için kayıt süresi) hücrelerin 150 ms uyarma pozlama süresi ile,% 15 iletim ışığın yoğunluğunu ayarlayın.
5. mikroskop sahnede plaka stabilize.
6. görüntü çözünürlüğünü kontrol etmek için "Canlı" düğmesini kullanın. İstenilen çözünürlük ulaşılana kadar daha ince ayar.
7. Yine "Kur" sekmesi altında, "Yakalama görüntü" düğmesini kullanarak örnek bir görüntü alır.
8. "Değerlendirme" sekmesine taşıma, deneyler için FRET verimlilikleri yapılıyor hesaplamak için uygun yöntemi seçin. Yöntem 3, oranlı metrik hesaplama [E _A (i) = B / A kullanarak], Örneğin D1SR göstergesi olarak cameleons içeren deneyler için tavsiye edilir.
9. yoğunluk değerleri deney sırasında grafik şeklinde kaydediliyor gözlemlemek mümkün "Graph" sekmesine geçiş.
10. Deney ilerledikçe grafik üzerinde ilgi bu alanda karşılık gelen ortalama yoğunluğunu gözlemlemek için görüntü izleyicide bir ROI çizin.
    NOT: Araştırmacı aynı zamanda birden fazla ROI'ları çizmek ve şiddetleri kaydedildi ve grafik üzerinde eş zamanlı olarak gösterilebilir gelen var seçebilirsiniz. Alternatif olarak, araştırmacılar ilk kayıt için tek bir yatırım getirisi anahat ve yazılım veri analizi odaklı versiyonunda deneme dosyasını açarak bir sonraki seferde birden fazla ROI'leri anahat geçebilirsiniz.
    NOT: FRET-tabanlı deneyler kurmak için gerekli adımlar hakkında ilave detay FRET uygulama sihirbazı kılavuzları bulunabilir. mikroskop FRET Sihirbazı ile donatılmış değilse, aşağıdaki protokol parametrelerini ayarlamak için kullanılabilirManuel kayıt.
11. Kaydı başlatmak ve önceki faiz ajan tanıtmak için sinyalin sürekli bazal kaydedilmesini sağlamak için en az 3 dakika süreyle veri toplama izin verir.
12. -moving Maddesi Ca2 ⁺ tanıtılması (örneğin 2 uM thapsigargin 100 nm endotelin-1) elle İlgi varlığın bölgeye kadar yakın bir noktada plaka doğrudan önceden tespit edilmiş bir doz pipetleme SR Ca2 ⁺ tüketen için bir araç olarak mümkün olduğu kaydedilmiştir. istenen zaman sonrası tedavi için kayıt devam edin.
13. Yakalama oranlı metrik FRET SE uygulamasını kullanarak konfokal ters mikroskop 63X yağ daldırma amacı ile seri görüntüler (512 x 512 piksel) FRET.
14. biçimlendirmek ve istatistik tabanlı yazılım kullanarak analiz sonradan faiz (ROI) her bölgede 5-10 SMC'lerin bir kümesinden görüntüleme kaynaklanan verileri toplamak ve.
    1. daha sonra kullanmak için verileri kaydetmek için, kaydedilen iz üzerinde sağ tıklayın ve sav "Export" seçeneğiaraştırmacının seçtiği sürücüsünde kaydedilen ortalama sinyal şiddetleri ile e-tablo.
    2. zaman noktasında 0 sn gözlenen başlayan yoğunluk değerine göre her veri noktası bölerek her deneyden veri normalleştirmek.
    3. elle kopyalama ve özgün tablo / sn alakalı veri satırlarını yapıştırarak bir istatistik programı proje dosyasına elektronik tablolar İthalat normalize veri.
    4. Otomatik olarak programa yapıştırılan veri setine karşılık gelen grafikler oluşturmak.
       NOT: Programın varsayılan ayarları içe aktarılan verilerin satır grafikler oluşturmak. Görüntülenen grafiğin tipi ana araç içinde bulunan başlığinı "Değişim" başlığı altında "grafiğin farklı bir türü seçin" butonuna tıklayarak değiştirilebilir.
    5. Tek bir veri sayfası içine özdeş deneyler daha büyük bir grup içinde birden fazla bağımsız denemeler temsil Havuz verileri gerçekleştirilen özel test için ortalama bir iz üretmek.
Sitoplazmik Ca 4. hazırlanması ²⁺ Gösterge
1. Siyah bir mikrosantrifüj tüpü içinde, dimetil sülfoksit (DMSO), 1 ml 0.0125 g pluronik asit (PA) içinde çözündürülür (PA çözülür yardımcı mobil su banyosu içinde tüp sıcak gerekebilir).
2. -20 ° C depolama sitoplazmik Ca ^{2 +} gösterge boya (Fluo-4 AM) bir boru (50 ug) Al.
3. ışık ile temas mümkün olduğunca korunması için folyo boyanın boru sarın.
4. Pipet boya içeren bir tüp içine DMSO + PA çözeltisi 45 ul. Oda sıcaklığında folyo ve mağaza DMSO + PA çözüm sarın.
5. iyice çözüm yukarı ve aşağı birden çok kez pipetleme tüp içeriği karıştırın. Seçenek olarak ise, 10 dakika boyunca, boya tüp sonikasyon.
   NOT: iyice yeterli olacaktır DMSO + PA çözeltisi boyunca boya dağıtmanın iki yöntem; sadece araştırmacının bir tercih meselesidir. Araştırmacı çözümü ses dalgalarına maruz seçerse, onuDiğerleri gürültü etkilenmez edilecek bir izole alan / odada yapılmalıdır. Araştırmacı ayrıca kulaklarını korumak için ağır susturucular kullanmalıdır.
   1. Çözümü sonicating ise 2/3 tam (ile dH ₂ O) sonikatör banyosu içinde bir köpük tüp tutucu ve yerin içinde boya içeren folyo sarılı tüp yerleştirin.
   2. izole alan / odası ve güç makinesinde yer sonikatör banyosu (koruyucu Şapkalar sağlamak önceki sonikasyon işlemini başlatmadan yerinde olduğundan). odadan ve tüp (mümkün olduğunca uzun için ışıktan korumak için folyo ile sarılmış tutmak) o kapatılması ve almadan önce 10 dakika süreyle çalışan makineyi bırakın.
6. karanlık mikrosantrifüj tüpler içine şimdi iyice karışık bir çözüm alikotu (tüp başına 5 ul, 10 tüpler toplam yapmak mümkün olmalıdır).
7. folyo Her eş pay, tüp sarın. kullanılana kadar -20 ° C koşullarda kurutucu Etiket tüpler saklayın.

5. Sitoplazmik Ca ölçümü ^{2 +}

1. Sıçan aort SMC'lerin kültür plakaları hazırlamak için 1.1-1.12 adımları izleyin.
2. 48 saat sonrası kültüründe plakadan kültür ortamı çıkarın.
3. -20 ° C depolama sitoplazmik Ca ^{2 +} göstergesi (5 ul), daha önce hazırlanmış kısım çıkarın ve kullanılana kadar mobil buz banyosu içinde muhafaza.
4. Ihtiva eden 1 ml ılık fizyolojik Hepes-PSS tamponu ile kültürü plakası yıkayın (mmol·L bölgesindeki ^{- 1)} NaCl 140, glükoz 10, KCI 5, HEPES 5, _CaCl2 1.5 ve _MgCI2 1 (pH 7.4) ile üç kez.
5. Sıcak HEPES-PSS 1 ml göstergesi karıştırın ve kültür plaka üzerine yerleştirin.
6. Oda sıcaklığında 1 saat için bir gösterge (24 ° C) SMC'lerinin inkübe edin.
7. kültür plakasından göstergesini çıkarın ve 1 ml ılık fizyolojik HEPES-PSS tamponu üç kez yıkayın.
8. hemen önce kayıt başlamadan 1 ml taze sıcak HEPES-PSS tamponu ekleyin.
9. Bir 63X o seri görüntüler (512 x 512 piksel) Yakalamakonfokal ters mikroskop il-daldırma objektif.
   1. El ile hücreler 488 nm heyecanlı böylece ayarlarını değiştirmek ve emisyon dalga boyları 700 Hz tarama hızı ile 555 nm toplanır.
   2. Hücrelerin 150 msn uyarma maruz kalma süresi (hücre kayıt sırasında belirlenen zaman aralıklarında ışığa maruz kalan süreyi) ve maruziyet arasındaki 5 sn aralıklarla,% 15 iletim ışığın yoğunluğunu ayarlayın.
10. Mikroskop sahnede plaka Stabilize ve kaydetmeye başlayın.
11. en az 3 dakika süreyle kayıt önce ilgi maddenin eklenmesi, sinyal sabit bir taban kayıt sağlamak.
12. (Adım 3.16 tarif edildiği gibi) ^{2 +} SR Ca tüketen ve zaman tedavi sonrası istenen miktarda kayıt devam için bir araç olarak Ca2 ⁺ -moving madde (örneğin, 2uM thapsigargin) sunar.
13. Kayıt sinyal yoğunluğu floresan si ortalamasını alarak mikroskop özel yazılımını kullanarakFaiz (ROI) her bölgede 5-10 SMC'lerin bir kümeden gnals (F / F _0). Toplamak biçimi ve veri analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme kaynaklanan verileri analiz. Bu yazılımı kullanarak veri toplama tanımı ve analizi için Adımlar 3.18.1-3.18.5 bakın.

Representative Results

Bu bölüm, dolaylı sitoplazmik Ca dalgalanmaları gözlemleyerek Ca ^{2 +} deposu konsantrasyonları organele değişiklikleri ölçmek yaygın olarak kullanılan şekilde göre SR lümen Ca2 ⁺ konsantrasyonu verilerini yakalamak için tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini içerir ²⁺ .

Şekil 1A YFP kanal (514 nm uyarma / 535 nm emisyon) 'de D1SR adenovirüs ile transfekte SMC kültürünün ilgi (ROI) bir bölgenin görüntüsünü göstermektedir. Tüm SMC'lere D1SR ifadesi için pozitif olduğu halde, gösterildiği gibi, D1SR göstergesi için ekspresyon düzeyleri, aynı ROI içinde farklı hücreler arasında değişir olduğu görülmektedir. Şekil 1B D1SR ile transfekte edilmiş bir SMC bir floresan görüntü bir 2-boyutlu projeksiyon gösterir Ca ^{2 +} dağıtım net bir resmini sunar adenovirüs (YFP kanal),geniş SR luminal ağ içinde. Şekil 1C CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) ve YFP (514/535 nm) bant geçiren filtreler kullanılarak SMC de D1SR gösterge dağılımını göstermektedir.

Biz de (2 uM) (Şekil 2) thapsigargin bir SR boşaltma maddeye hücrelerin akut maruz kalma net testi kullanılarak, SR, bu hedef iyon hareketini izleme elde edilen Ca ^{2 +} sinyal izleri örneklerini göstermektedir. Şekil 2A ve 2B'de gösterildiği gibi, thapsigargin SR Ca2 ⁺ içeriğine ([Ca2 _{^+], SR)} 'de bir düşüş neden olur.

Şekil 3A'da olarak, SR boşaltma maddesi thapsigargin (2 uM) ile muamele sitoplazmik Ca ^{2 +} göstergesi ile yüklü kültürlenmiş SMC'lerinin Örnek görüntüleri gösterilmiştir. Kaydedilen Ca2 ⁺ sinyali görülen geçici zirve ( 2 + transientler kaynağı açıkça tespit edilemez olsa da, SMC sitoplazmaya Ca ^{2 +} sürümü bir göstergesidir.

Şekil 4A, SR kalsiyum göstergesi D1SR ifade ve endotelin-1, 100 nm ile muamele kültürlenmiş SMC'lerinin Örnek anlık gösterir. Şekil 4A ve 4B, hem de gösterildiği gibi, endotelin-1 D1SR FRET sinyali bir düşüş ile ölçülen SR kalsiyum içeriğine yavaş fakat sürekli bir düşüş neden olur. De anlaşılacağı gibi oranlı metrik FRET protokol önemlisi Ca çalışma sağlar ²⁺ doğrudan ajanın etki mekanizmasına ilişkin hareketler kullanılır. Doğrudan bu şekilde hücrede büyük Ca ²⁺ deposundan / 'içine bu iyon hareketini ölçen değişime SR eylemleri ile ilgili veya bağlı ²⁺ dinamikleri doğrudan Ca sonuçları temsilcisine sağlanmasında yardımcı olur SR lümen ortamında s.

Sıçan aort DKH'lerdeki SR Ca ^{2 +} gösterge D1SR Şekil 1. Dağılımı. (A) 48 saat sonrası enfeksiyon D1SR andenoviral vektörü ile transfekte Temsilcisi görüntü tasvir SMC kültürü. (B) YFP kanal (514 nm eksitasyon / 535 nm emisyon) kullanılarak kültürlenmiş SMC'de D1SR bir dağıtım floresan görüntü 2-D projeksiyon. (C) CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) ve YFP (514/535 nm) bant-geçişli filtreler kullanılarak D1SR göstergesi ile transfekte edilmiş bir SMC Örnek anlık. Ölçek çubukları 10 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
Şekil 2. thapsigargin belirgin bir düşüş olur [Ca2 ^+] _SR. (A) Gerçek zamanlı kültürlü sıçan aort DKH'lerdeki gösteren sinyal yoğunluğunda bir azalma göstererek thapsigargin D1SR ile transfekte ve 2 uM ile tedavi edilen Pseudocolor anlık (FRET kanalı) nedeniyle thapsigargin kaynaklı Ca ^{2 +} sürümü SR Ca ^{2 +} içeriğinde önemli bir düşüş. (B) [Ca2 ^+] _SR belirgin bir düşüş teyit thapsigargin 2 uM ile tedavi kültürlü DKH'lerdeki F / F ₀ değeri Temsilcisi iz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Fişekil 3. thapsigargin ^{2 +} sitoplazmik Ca önemli bir artışa neden olur ([Ca2 ^+] _i). (A) sitoplazmik Ca ^{2 +} göstergesi ile yüklenir ve thapsigargin 2 uM ile tedavi kültürlü sıçan aort SMC'lerin Temsilcisi anlık. Gösterildiği gibi, thapsigargin bağlı SR ile ilgili Ca serbest ²⁺ sitoplazması içinde sinyal yoğunluğunda önemli bir artışa neden olur. (B) thapsigargin 2 uM ile tedavi kültürlü DKH'lerdeki F / F ₀ değeri Temsilcisi iz. Ca ²⁺ sinyal tasvir artış SR serbest Ca ²⁺ miktarı ile orantılı olarak kabul edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Endotelin-1 önemli bir düşüşe neden olur [Ca2 ^+] _SR. (A) Gerçek zamanlı kültürlü sıçan aort DKH'lerdeki D1SR ile transfekte ve 100 nm ile tedavi edilen Pseudocolor anlık (FRET kanalı) endotelin-1 yavaş gösteren fakat nedeniyle SR için endotelin kaynaklı Ca ^{2 +} sürümü SR Ca ^{2 +} içeriğinde belirgin bir düşüş gösteren sinyal yoğunluğu istikrarlı düşüş. (B) endotelin-1 100 nm ile tedavi kültürlü DKH'lerdeki F / F ₀ değeri Temsilcisi iz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu protokol SR lümeninde Ca ^{2 +} kavkıdaki D1SR adenovirüs ile VSMC'Ierin aktarıldığı açıklanmaktadır. Bu yöntem, doğrudan bu organel olan ^{Ca2 +} ölçümü hem de değişik kalsiyum hareket eden maddelerin uygulanmasının bir sonucu olarak SR üzerinden içindeki hareketinin / sağlar. Bu yöntem SR ve sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri değişiklikleri genel hücresel sağlığını etkiler ve nasıl bu değişiklikler birbiriyle ilişkili nasıl kapsamlı bir anlayış doğrultusunda çalışan araştırmacılar için birçok avantajı vardır. Hücre içi Ca ^{2 +} hareketinin geleneksel gözlem sadece sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri değişiklikleri izleme içerir. D1SR veya benzeri yapılar kullanılarak elde edilen önemli bir avantajı, bu nedenle daha çok SR agonist etkisi ile belirsiz sonuçlar çıkarmak zorunda kalmadan, örneğin SR gibi belirli organel içeren bu iyon hareketini izleme yeteneğidolaylı olarak bu tür manipülasyon tarafından uyarılan sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri değişiklikleri gözlemleyerek. Aynı şekilde, birlikte etkilemeye hizmet ajanlar SR Ca özellikle daha verimli hem organel ve hücre çapında hücresel Ca ^{2 +} konsantrasyonları ve genel sağlık üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir ^2+. Bu D1SR ile kültürlenen hücrelerin transfeksiyonu lümen içi SR Ca2 ⁺ seviyelerinde değişiklik ölçüm daha doğrudan, hem de ücretsiz, yöntem sağlamasıdır Bu avantajlar kaynaklanmaktadır. Ayrıca önem bu model, hücresel stresi ya da belirli fonksiyonel tepkileri sebep olduğu bilinen farmakolojik veya fizyolojik ajanlara yanıt olarak SR ağı içinde Ca değişiklikleri ^{2 +} konsantrasyonunun ölçülmesi için bir araç sağlar olmasıdır. Bu herhangi bir ilgi hücrede yer D1SR göstergesi için bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak mümkün olacaktır. ER / SR içinde kalsiyum konsantrasyonu daha sonra (F / F ₀ normalize D1SR oranı kalibre hesaplanabilir) Daha önce ^{10, 11} tarif edilen standart kalibrasyon eğrisi karşı.

Burada belirtilen protokolün bir sınırlama diğer hücre tiplerinde D1SR yapısının kullanımı ile ilgili mevcut bilgiler olmamasıdır. Diğer hücre türleri ile kullanımı tarih sınırlı zorunda olsa bu yöntem şimdiye kadar yaptığımız çalışmalar birden çok kez ^13-15 sıçan SMC'lere için başarılı olmuştur. Bu yöntemin başarılı olabilmesi için, tüm önlemler hücre kültürü adımların sağlıklı ilerlemesini sağlamak için alınması hayati önem taşımaktadır. Tür cam dipli mikroskopi plakaları üzerinde sıçan aort SMC'lerin yeterli büyümeyi desteklemek için kanıtlanmış satın alınabilecek birçok protein bazlı jelatinimsi madde olarak plakalar, hücre büyümesini sağlayan uygun bir malzemenin kullanılması bu nedenle önemlidir. Hücreler uygun geçişleri sırasında yüksek birbirine karıştığında hazırlanmamış ise D1SR ve daha sonra görüntüleme ile transfeksiyon başarı değişkenlik gözlenmektedir. p değişiklikleroptimal transfeksiyon ve zayıf sinyal görüntüleme aşamasında elde edilen yol açabilir aynı hücre hattının uzun süreli kullanımı doğasında henotype. D1SR yapısı kullanılarak deneyler görüntüleme için hücrelerin confluency sağlamak için önce kendi yürütme en az 36-48 saat için hazırlanmış olmalı ve bu yöntemin kullanımı karıştığı sınırlamalar, bu nedenle çoğunlukla bu gerekli hücre kültürü çalışmaları kaçınılmaz yapılmış adenovirüs ile hücrelerin büyüyen inkübasyon için yeterli süre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.