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Medicine

Endovenosa Endotossina sfida in soggetti sani: una piattaforma sperimentale per Indagare e modulare infiammazione sistemica

doi: 10.3791/53913 Published: May 16, 2016

Abstract

L'attivazione di percorsi infiammatoria rappresenta un meccanismo centrale in diversi stati di malattia acuta e cronica. Innescato via sia patogeno o motivi molecolari dei tessuti danni associati, vie biochimiche comuni portano ad alterazioni fisiologiche e immunologiche ancora variabili conservati. Dissezione e delineazione dei determinanti e meccanismi alla base della varianza fenotipica in risposta si prevede di produrre nuovi progressi terapeutici.

Per via endovenosa (IV) la somministrazione di endotossina (gram-negativi lipopolisaccaride batterico), una specifica recettore Toll-like 4 agonisti, rappresenta un modello in vivo di infiammazione sistemica nell'uomo. Nazionale Institutes for Health Clinical Centro di Riferimento endotossina (CCRE, Escherichia coli O: 113: H10: K negativo) è impiegata per generare in modo affidabile e riproducibile vascolare, ematologiche, endocrino, effetti funzionali immunologici e organo-specifiche che, parallelamente, in varia misura,quelli osservati nelle prime fasi di stati patologici. Alterazione della dose (0,06-4 ng / kg) e il tempo-scala di esposizione (bolo vs infusione) consente la replica di una infiammazione acuta o cronica e una gamma di severità per essere raggiunta, con dosi più alte (2-4 ng / kg ) spesso utilizzato per creare uno stato di 'sepsi-like'. Fondata e composti medicinali nuovi possono inoltre essere somministrati prima o dopo l'esposizione endotossine ad apprezzare il loro effetto sulla cascata infiammatoria. Malgrado i limiti nella portata e generalizzabilità, sfida IV endotossine umano offre una piattaforma unica per acquisire conoscenze meccanicistici in risposte fisiologiche inducibili e vie infiammatorie. Razionalmente impiegato che può essere di aiuto traduzione di queste conoscenze in innovazioni terapeutiche.

Introduction

L'infiammazione delle diverse eziologia, gravità e la durata costituisce una componente centrale nella patologia di malattie multiple. Che vanno dalle criticità malattia, come sepsi o un trauma in cui gravi, l'infiammazione relativamente breve durata predomina, per malattie croniche, tra cui diabete mellito tipo 2, aterosclerosi e il morbo di Alzheimer, dove il tono infiammatorio persistente basso livello è considerata un fattore patologico, vie infiammatorie sregolati sono un fattore chiave di morbilità e mortalità globale 1,2.

L'infiammazione è iniziata dalla presenza di modelli di patogeni associati molecolari (PAMPs) o modelli di pericoli associati molecolari (smorza) - Componenti comunemente intracellulari rilasciati tramite danni ai tessuti 3-5. Questi recettori conservati molecolare motivi legano modello di riconoscimento (PRR) come recettori Toll-like (TLR) si trovano sulle cellule epiteliali, cellule endoteliali e quelle dei SYS immunitario innatoTEM, per innescare comune segnalazione intracellulare a valle Percorsi di 6. L'attivazione del fattore di trascrizione nucleare fattore nucleare kB, tra l'altro, porta alla trascrizione di geni codificanti citochine pro-infiammatorie che stabiliscono la cascata infiammatoria 7.

L'infiammazione induce sia effetti locali e sistemici progettato per isolare e rimuovere l'insulto primaria. alterazioni locali includono up-regolazione di marcatori di adesione, chemochine rilascio, vasodilatazione e aumento della permeabilità vascolare per facilitare innato trasmigrazione delle cellule immunitarie. I sistemi del complemento e della coagulazione sono anche attivati. Sistemica, sono stati osservati più cambiamenti fisiologici organo-specifiche, orchestrato attraverso la rete neuroendocrina. aumenti significativi mediatori umorali si verificano e il profilo delle cellule circolanti altera radicalmente. Fallimento di infiammazione cessare e l'omeostasi essere ristabilita possono essere dovuti alla persistenza degli stimoli avvio oun fallimento della risoluzione dedicata Percorsi di 8. Questi meccanismi potenti, spesso coordinati da mediatori lipidici possono a loro volta essere patogeni 9,10.

Indagine della risposta infiammatoria e questi passaggi normativi fondamentali nella popolazione clinica è impegnativo. Demografici (età, sesso, etnia), temporale (tempo di esordio, durata dell'esposizione) e varianza clinica (tipo di stimoli avvio, la gravità di insulto, onere co-morbidità, intervento terapeutico) impedire l'accesso ai percorsi biologici fondamentali. La soluzione tradizionale è stata quella di utilizzare modelli animali. Nonostante offrendo molteplici vantaggi, la loro somiglianza fondamentale per fisiopatologia umana 11,12 e la rilevanza della loro produzione, è venuto sempre più sotto controllo 13-15. Un'alternativa è quella di impiegare modelli umani riduzioniste.

Sviluppata alla fine del 1960, per via endovenosa (IV) somministrazione di endotossina per l'uomo offre una piattaforma vitale attraverso il qualeper scoprire, delineare e vie infiammatorie potenzialmente droga 16-19. Endotossina (lipopolisaccaride utilizzato come sinonimo di [LPS] in questo articolo) è un potente agonista TLR4 che innesca la cascata infiammatoria in modo dose-dipendente. Iniettato sia come bolo o per infusione, può quindi essere utilizzato per modellare sia di basso livello e moderata infiammazione sistemica di diversa durata. La risposta infiammatoria di breve durata risultante permette la valutazione di un singolo componente del altamente complessa interazione ospite-patogeno che si sviluppa durante l'infezione batterica. Pur non essendo un modello di shock, IV sfide endotossine suscita risposte che sembrano replicare le prime fasi dell'infezione. L'eliminazione inter-specie barriere traslazionale e imitando accuratamente il fenotipo clinico qualitativamente se non quantitativamente, essa offre l'interpretazione in tempo reale delle influenze infiammatori, le conseguenze e l'opportunità di testare interventi. Endotossine può anche essere somministrato endobronchially 20, intradermica 21 o in combinazione con IV LPS 22 per esplorare risposte infiammatorie locali in diversi comparti. Meno ampiamente impiegate metodologie alternative includono l'infusione di citochine pro-infiammatorie prossimali come il fattore di necrosi tumorale α (TNF) e l'interleuchina (IL) 6 19. Questi non saranno discussi ulteriormente qui.

Protocol

University College London REC (UK) ha approvato lo studio che ha generato i dati presentati nella sezione rappresentante risultati (Riferimento 5060/001).

Approvazione etica:

La maggior parte degli studi che utilizzano sfide IV endotossine sono stati condotti in soggetti sani. Come questa ricerca non ha beneficio per la salute, l'importanza degli obiettivi dello studio dovrebbe chiaramente superiori agli eventuali rischi. Questo è importante se si considerano le interazioni con i nuovi agenti utilizzati per modificare l'infiammazione e che hanno il potenziale di esagerare le risposte di accoglienza di endotossine (ad esempio, febbre, cambiamenti nella pressione sanguigna, sintomi).

Prima dell'inizio di ogni studio che impiegano IV endotossine, l'approvazione deve essere cercato e ottenuto da un apposito comitato per la ricerca etica (REC) / Institutional Review Board (IRB). somministrazione di endotossina IV è stato impiegato per più di quarant'anni per ottenere importanti mechaintuizioni nistic in biologia umana senza effetti avversi gravi o durevoli per la nostra, o di altro autore, conoscenze 19. Dato il potenziale del modello di fornire informazioni vitali relative a molteplici condizioni infiammatorie che sono le principali cause di mortalità e morbilità, riteniamo che sia eticamente accettabile esporre volontari sani e gruppi demografici o cliniche definite a endotossine, purché le strategie di minimizzazione dei rischi sono a posto. Questo può richiedere recensione esterno indipendente da esperti qualificati e o studi pilota per garantire salvacondotto delle indagini, in particolare quando si impiegano nuovi agenti e la loro interazione con endotoxin- infiammazione indotta.

Preparazione

1. Determinare le caratteristiche demografiche e cliniche dei partecipanti

NOTA: La maggior parte degli studi che impiegano IV endotossine sfida reclutare giovani sani volontari maschi <30 anni di età. Pernoi sono stati inoltre intrapresi su 23 donne sane, i volontari più anziani 24,25 e 26 sottogruppi di pazienti a seconda della domanda sperimentale. I partecipanti anziani (vale a dire, maggiore di 60 anni di età) possono avere una maggiore e più sostenuta risposta (febbre superiore, una maggiore diminuzione della pressione arteriosa), e le interazioni di infiammazione endotossine indotta alle eventuali condizioni e farmaci co-morbidità devono essere considerati in la progettazione di questi studi. Si prega di consultare la discussione per ulteriori considerazioni nella selezione dei partecipanti.

2. I partecipanti Recluta

  1. Disporre adatto pubblicità, come richiesto.
    NOTA: La compensazione finanziaria per il tempo e disagi del partecipante è comunemente offerto. Questo deve essere stabilito prima del reclutamento e approvato da un REC / IRB.
  2. Eseguire un REC / IRB approvato partecipante opuscolo informativo (PIL) che spiega la natura dello studio, una panoramica dellaprotocollo, gli effetti collaterali attesi e rischi associati alla IV endotossine di intervistati che soddisfano i criteri di inclusione.
    NOTA: Questo dovrebbe essere rilasciato in anticipo di acconsentire per consentire una decisione informata da effettuare a partecipare e per qualsiasi domanda o dubbio da affrontare dal ricercatore.

3. Ottenere formale consenso informato

  1. Ottenere il consenso scritto da parte di tutti i partecipanti prima di intraprendere qualsiasi procedura di studio correlati, tra cui screening sanitario.
  2. Cercate conferma verbale di ritenzione partecipante e la comprensione delle informazioni contenute nel foglietto illustrativo.
  3. Discutere gli effetti collaterali della somministrazione IV endotossine.
    NOTA: A dosi più elevate (2-4 ng / kg) questi includono rigori (brividi), mal di testa, fotofobia, mialgia, artralgia, nausea e raramente, vomito. l'intensità dei sintomi di picco si verifica intorno a 1 - post-iniezione 2 ore, diminuire in seguito al basale di 6 - 8 ore. Nessun grave o prolungata effe negativoCTS secondaria a endotossine a queste dosi sono stati segnalati. Raramente, un volontario può trovare il grado dei sintomi inaccettabili durante l'altezza della risposta. I sintomi possono essere migliorati con la somministrazione di paracetamolo / paracetamolo o agenti non steroidei per via orale o IV (ad esempio, l'aspirina, ibuprofene). Tali agenti possono alterare la risposta infiammatoria e il loro uso deve essere registrato.
  4. Riaffermare la capacità dei partecipanti di ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento senza dare una spiegazione.

4. Intraprendere un 'Screen Salute' sui potenziali partecipanti

NOTA: Questo è quello di garantire l'assenza di condizioni mediche riservate che li pongono a maggior rischio di danni da IV endotossine. Come obiettivo secondario le informazioni rilevanti per la domanda di sperimentazione possono essere identificati.

  1. Identificare un ambiente clinico idoneo e di un medico adeguatamente addestrato per condurre la schermata di salute. </ Li>
  2. Prendete una storia clinica completa tra cui storie mediche e sociali del passato, passato e in corso di farmaci / trattamenti, nuovi prodotti alimentari di salute o al banco farmaceutico, lo stato di allergia e un'inchiesta sulla presenza di sintomi attuali che possono suggerire una malattia nuova o recente.
  3. Eseguire un esame clinico formale, come il sistema cardiovascolare e respiratorio minima,.
  4. Disporre e le indagini recensione fondamentali tra cui le osservazioni di routine (peso, frequenza cardiaca, pressione arteriosa, frequenza respiratoria, saturazione di ossigeno, temperatura), analisi del sangue (emocromo completo, renali, epatiche e coagulazione test funzionali), e 12 derivazioni dell'elettrocardiogramma.
    NOTA: i test potrebbero essere necessarie ulteriori secondo il protocollo sperimentale.
  5. Chiedete ai partecipanti con la storia insignificante, l'esame e le indagini procedono alla sfida IV endotossine, dipende da criteri di inclusione / esclusione REC / IRB-approvati.
    NOTA: is migliori pratiche per i sintomi appena rilevati, segni o anomalie dei test di essere segnalato al indagato e dal medico di routine del partecipante. Questi individui dovrebbero essere escluse fino a qualsiasi preoccupazione è stata affrontata in modo appropriato.

5. informare i partecipanti di procedere alla IV Endotossina sfida a;

  1. Notifica l'investigatore di eventuali nuovi sintomi o malattia.
    NOTA: Questo sarà normalmente preclude il loro ingresso nello studio.
  2. Chiedete ai partecipanti arrivano in un momento pre-stabilito e la posizione. Informare i partecipanti di indossare abiti comodi e portare l'intrattenimento.
  3. Chiedi ai partecipanti di digiunare dalla mezzanotte (liquidi chiari consentiti).
  4. Chiedi ai partecipanti di astenersi da alcol e caffeina per 24 ore prima dell'iniezione e / o di un periodo di pre-definito in seguito (opzionale e il protocollo dipendente).

Procedura

6. Endotossina Sfida(Prima di endotossine Administration)

  1. Preparare un letto con la testa a 45 °.
    NOTA: Assicurarsi che questo si trova in un luogo appropriato per ottenere l'assistenza clinica e attrezzature per la rianimazione. Per esempio, un centro di ricerca clinica, sala anestetico o unità di terapia intensiva.
  2. Assicurarsi che l'apparecchiatura clinica e sperimentale richiesto è accessibile e funzionante.
    NOTA: Questo include un misuratore di pressione, termometro, pulsossimetro e, se essere impiegato, il monitoraggio cardiaco a 3 derivazioni. Verificare la completezza delle attrezzature per la rianimazione locale e l'accessibilità di ossigeno.
  3. Ricostituire Centro Clinico di riferimento Endotossina
    1. Aggiungere 5 ml di acqua sterile per iniezione, USP (SWI) per una fiala in precedenza non-ricostituita di CCRE con piena tecnica non-touch asettica (ANTT) in tutto. Fiale contengono 10.000 unità endotossine (UE) (circa 1 ug) sotto forma di una polvere bianca liofilizzata.
    2. Posizionare il flacone of CCRE con 5 ml SWI aggiunto su un agitatore vortex per 1 ora per garantire endotossine aderente alla superficie del vetro della fiala sia completamente dissolto.
      NOTA: CCRE non entra in soluzione facilmente, nonostante che sembra avere completamente dissolto.
    3. Disegnare il volume adattata al peso corretto di endotossine (ora 2.000 EU / ml o circa 200 ng / ml) in una siringa da 1 ml.
      NOTA: L'uso di vetro o siringhe in polipropilene per ridurre al minimo l'aderenza (economico) di endotossine alle apparecchiature.
  4. Partecipante
    1. Confermare il consenso per procedere con la somministrazione IV endotossine. Informatevi sui nuova malattia, i sintomi e la conformità alle istruzioni specifiche del protocollo.
      NOTA: Se non vi è preoccupazione medica o non conformità endotossine, ritardare l'amministrazione.
    2. Chiedere al partecipante a giacere nel letto preparato, confermando che sono confortevoli. Assicurarsi che hanno la vescica e l'intestino svuotato.
  5. Ottenere l'accesso vascolare. Inserire una cannula endovenosa sotto ANTT per l'amministrazione di endotossine, e se inclusi nel protocollo, liquidi per via endovenosa.
  6. Posizionare una seconda linea intravascolare per il corso di prelievo del sangue per evitare la pugnalata venosa ripetuta. Inserire questa via endovenosa e collegare ad un rubinetto a 3 vie (con o senza estensione) per facilitare prelievo del sangue e lavaggio.
    NOTA: In alternativa, per il monitoraggio continuo della pressione arteriosa e l'acquisizione del campione, sito una linea intra-arteriosa. Ciò richiede una maggiore esperienza per l'inserimento e vi è un maggior rischio di complicanze locali.
    1. Per in corso prelievo di sangue mediante cannula endovenosa, utilizzare un calibro 18 o maggiore foro cannula insieme ad una ubicazione nella fossa antecubitale per evitare emolisi e la coagulazione. somministrazione di liquidi IV contribuirà a mantenere la pervietà.
      NOTA: La selezione del tipo intravascolare inserimento della cannula e il sito dovrebbe avvenire in base al singolo professionista e partecipante priferimento. Linee intra-arteriose sono messi tradizionalmente nella arteria radiale o femorale previa instillazione di anestetico locale (ad esempio, 1% lidocaina).
  7. Disegnare sangue per test di base quando viene inserito il primo o seconda linea. Eliminare i primi 5 ml di sangue (che occupano spazio morto all'interno della cannula e connettori) prima di ottenere il sangue per il campionamento. Lavare il catetere con 10 ml di cloruro di sodio allo 0,9% dopo prelievo di sangue.
    NOTA: Il volume di sangue prelevato e la manipolazione dei campioni sarà determinata dal protocollo sperimentale e procedure del laboratorio.
  8. Fissare monitoraggio clinico a seconda dei casi (ad esempio, il monitoraggio cardiaco 3 derivazioni è di solito impiegato con dose più alta sfide 2-4 ng / kg).
  9. Record di base osservazioni cliniche di routine a quanto dichiarato nella 4.4 su un grafico segno vitale adeguato. Soggettiva sintomo di punteggio (per esempio, utilizzando i punteggi analogici visivi per il mal di testa, mialgia,ecc.) devono inoltre essere eseguita per monitorare l'esperienza dei partecipanti.
  • somministrazione di endotossina
    1. Lavare la cannula endovenosa con cloruro di sodio 0,9% per garantire la cannula è situata correttamente e brevetti.
    2. Somministrare la pre-preparato, dose adattata al peso del CCRE ricostituito attraverso la stessa cannula endovenosa. Iniettare il bolo (<2 min) la dose in un rubinetto a 3 vie al centro della linea IV.
    3. Lavare con cloruro di sodio 10 ml di 0,9% per garantire che tutti CCRE entra nella circolazione.
      NOTA: per somministrare una infusioni continue iniettano il endotossina in un volume noto di diluente, ad esempio, 100 ml di cloruro di sodio allo 0,9% per ottenere una concentrazione predeterminata, e infondere la soluzione risultante ad un tasso fisso (volume / tempo).
  • 7. Monitoraggio, Osservazione e Draw Campione

    1. partecipanti Monitor sottoposti IV endotossina per un minimo di 6 ore dopo il bolo farecantare o per la durata di un infuso. Avere un qualificato, medico esperto eseguire questo passaggio.
    2. Registrare e segni vitali e le eventuali osservazioni cliniche ad un minimo di una volta / hr. Il monitoraggio continuo come il monitoraggio cardiaco a 3 derivazioni può inoltre essere intrapresa.
      NOTA: Gli investigatori devono tenere presente che a dosi più elevate in bolo (2-4 ng / kg) reazioni vasovagali possono provocare pause cardiaci. Questi sono più frequenti 30 minuti a 2 ore dopo l'iniezione e non sono maligne (vedi la discussione per ulteriori dettagli).
    3. Intraprendere soggettivo punteggio sintomo a discrezione dello sperimentatore.
    4. Somministrare 2 - 3 L di cristalloide (per esempio cloruro di sodio allo 0,9% o soluzione di Hartmann) oltre 6 - 8 ore dopo la somministrazione in bolo di 2 - 4 ng / kg.
      NOTA: Non esiste un livello accettabile per la gestione dei fluidi di cui sopra. Sicurezza dei partecipanti è di primaria importanza. Questo fornisce routine di liquido di manutenzione e il volume replacement (per il periodo mantenuto Niente per bocca ed ha aumentato le perdite insensibili a causa di aumento della temperatura corporea e la frequenza respiratoria). Essi possono anche contrastare il rischio di aritmie cardiache (vedi la discussione).
    5. Ottenere campioni pre-determinati necessarie per rispondere alla domanda sperimentale.
      NOTA: Questi includono tradizionalmente, ma non sono limitati a, sangue e nelle urine. La tempistica, il numero e il volume di campioni dovrebbero essere il minimo indispensabile per ottenere dati esatti e sono stati approvati dal REC / IRB. Più di campionamento frequente può essere necessaria in determinati intervalli di tempo (ad esempio, ogni 30 min) per garantire picco (o depressione) i valori non sono mancati. I calcoli di volume di sangue prelevato devono tenere conto di sangue scartato durante il ritiro dello spazio morto.
    6. campioni di processo come richiesto.

    8. Fine della procedura

    1. Avere il clinico che frequentano in modo che i sintomi dei partecipanti si sono stabiliti e che le loro osservazioni sono in trend al(tutti i parametri modificati, ad esempio, elevato tasso cardiaco e la temperatura, dimostrando consistente riduzione verso valori basali) normale prima di sancire la fine di osservazione e successivo scarico.
      NOTA: Dopo l'iniezione in bolo di 2 - 4 ng / kg sintomi CCRE normalmente completamente abate per 6-8 ore. osservazioni individuali seguono sovrapposte ma discrete time-corsi. Questi sono normalmente tornata ai livelli iniziali per 10 - 12 ore. Infusione continua richiede un periodo di osservazione come sintomi e segni vitali non si abbasserà immediatamente dopo la cessazione della somministrazione endotossine più a lungo.
    2. Rimuovere tutte le apparecchiature di controllo e le linee intravascolari che garantiscono l'emostasi.
    3. Confermare il partecipante è felice di tornare a casa e ha i recapiti del ricercatore in caso di qualsiasi preoccupazione.
      NOTA: E 'considerato best practice per contattare il partecipante il giorno seguente per verificare il loro stato di salute e monitorare eventuali sequele.

    Representative Results

    Le diverse conseguenze, multi-sistema di somministrazione di endotossina IV sono stati recentemente ampiamente rivisto e non saranno discussi in completa (per i dettagli vedere 17-19,27). Invece sarà fornita una breve panoramica della gamma e l'applicabilità del modello insieme dati primari relativi al classico regime bolo-dosaggio (2 ng / kg). Un diagramma schematico che illustra la sequenza temporale di un tale esperimento è fornito in Figura 1.

    Figura 1
    Figura 1:. Schema Rappresentante del bolo IV Endotossina sfida protocollo Dopo l'arrivo, il consenso del partecipante di procedere deve essere confermata con il loro stato di salute e il rispetto del protocollo (il digiuno, l'alcool astensione, etc.). Dopo l'inserimento delle linee intravascolari, attachment di monitoraggio e raccolta di osservazioni cliniche di base e di campioni, una dose adattata al peso del ricostituito CCRE viene somministrato. Il monitoraggio clinico per un minimo di 6-8 ore è obbligatoria. I campioni, più comunemente nel sangue, possono essere prese in punti temporali pre-selezionati. Liquidi per via endovenosa cristalloidi sono comunemente dato, in questo caso 1 L oltre 2 ore seguita da 1 L oltre 6 ore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    L'effetto di IV endotossina dipende dalla dose selezionata e il metodo di somministrazione (bolo vs. infusione). Un bolo di 2-4 ng / kg suscita in modo affidabile le caratteristiche della sindrome da risposta infiammatoria sistemica con temperatura al cuore sollevato, la frequenza cardiaca e globuli bianchi (WBC) contano 16. Questo è accompagnato dalla presenza di mediatori umorali dell'infiammazione compresi pro e antcitochine i-infiammatorie, proteine ​​di fase acuta (come la proteina C-reattiva) (vedi figure 2 e 3) e l'attivazione dell'asse ipotalamo-ipofisi 28 e sia il pro-coagulatoria e fibrinolitico 29. Il metabolismo nei tessuti sia centrali e periferici viene alterata e molteplici alterazioni funzionali organo-specifiche suscitato 19,30. I partecipanti sperimentano una varietà di sintomi simil-influenzali '' che il picco di intensità intorno a 1 - 2 ore e in gran parte abate di 6 ore (vedi figura 4). Il protocollo bolo 'alte dosi' induce una risposta qualitativamente consistente ma quantitativamente variabile in volontari 31.

    figura 2
    Figura 2: Clinical osservazione Cambia profilo dei segni vitali di gestione post-bolo di Clinica Centro di Riferimento endotossine 2 n.g / kg (mediana con IQR, n = 10). La frequenza respiratoria (RR, respiri al minuto, A), impulsi (battiti per minuto, B), pressione arteriosa sistolica (SBP, mmHg, C) e la temperatura (° C, tramite il termometro timpanica, D) vengono visualizzati. SBP non è caduto a causa di somministrazione di fluidi IV, il piccolo aumento probabile che riflette una maggiore deflusso simpatico. Il tempo viene visualizzato sul asse x (amministrazione HR post-endotossine). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3:. Cellulare e umorale Risposta alterazioni consistenti della conta leucocitaria totale, tra cui neutrofilia transitoria, sono osservati (A) insieme a indicatori clinici comunemente usati di inflammation come proteina C-reattiva (B). alterazioni Quantitativamente varie, ma qualitativamente conservati nelle concentrazioni di citochine circolanti nel plasma si verificano dopo IV endotossine. TNF (C) e IL-6 (D) vengono visualizzati come esemplari. Tutta l'amministrazione dei dati post-bolo di Centro Clinico di riferimento Endotossina 2 ng / kg (mediana con IQR, n = 10. concentrazione di citochine rappresenta la media di 2 ripetizioni tecnici / singoli in ogni punto). Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.

    Figura 4
    Figura 4:. Sintomo Profilo sintomo cumulativo punteggio registrato a predeterminati punti temporali amministrazione post-bolo di Clinica Centro di Riferimento Endotossina 2 ng / kg (mediana con IQR, n = 10). I partecipanti sono stati invitati tØ valutazione della gravità del mal di testa, brividi, dolori muscolari, nausea su scale analogiche visive. (0 - 10, massimo punteggio 40) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Endotossine 'basso dosaggio' in contrasto ha un effetto molto più diversificata sugli individui e può essere utilizzato per esplorare le differenze interindividuali nella risposta infiammatoria 31. La somministrazione di 0,06 - 0,2 ng / kg via sia in bolo o infusione induce 2 - 10 volte aumento delle citochine plasma commisurati con quelli osservati in basso grado di condizioni infiammatorie croniche 32. Tali protocolli possono avere un ruolo chiave nel esplorare il contributo di infiammazione e le vie che lo regolano a molteplici condizioni cardiometabolic complesse 27.

    Discussion

    Come dimostrato qui e ampiamente descritto negli ultimi articoli di revisione, sfida IV endotossine umano è una piattaforma sperimentale unico permettono di approfondire le vie infiammatorie che sono alla base di una vasta gamma di malattie umane. Permettere il controllo, l'induzione riproducibile di infiammazione sistemica, il modello consente l'accesso alle fasi iniziali della cascata infiammatoria, eliminando i potenziali fattori di confondimento.

    le risposte del partecipante possono essere modulati rispetto alla gravità e la durata, e l'influenza genomica sulla loro presentazione fenotipica valutati. Inoltre, il modello può agire come un banco di prova per terapie, non solo quelli contro il ligando LPS in sé, ma LPS-indotta percorsi e mediatori di entrambe le fasi acute e risoluzione di infiammazione di segnalazione. Questo può includere agenti mirati al ripristino della tolleranza endotossine, uno stato iporensponsivo del sistema immunitario che porta somiglianze con malattia critica-induced immunoparalisi 33,34 in grado di replicare le caratteristiche principali di entrambi acuta e cronica 16 27 infiammazione non solo a livello fisiologico / funzionale, ma anche un trascrittomica un 35, IV sfida endotossine ha apparentemente un ruolo chiave da svolgere nella traduzione di scoperte scientifiche di base nella pratica clinica. Quando accoppiato ad indagine diretta in modelli animali adeguati in grado di replicare più da vicino le risposte fisiopatologiche di specifici stati di malattia (ad esempio, murino legatura del cieco e la puntura e sepsi) questo paradigma sperimentale può essere particolarmente potente.

    Sicurezza dei partecipanti in qualsiasi modello di volontariato umano sano è fondamentale. Sfida IV endotossine è stato somministrato nell'intervallo di dose più alta di 2 - 4 ng / kg a migliaia di individui con, al nostro ed altri autori della conoscenza, senza eventi avversi gravi o permanenti (comunicazione personale, il dottor Anthony Suffredini) 19. di none tuttavia isolati conti di reazioni vagali gravi sono state riportate 36,37. L'eziologia rappresenta presumibilmente tono alto di riposo vagale, ipovolemia dopo il digiuno durante la notte, e il rilascio di catecolamine con l'insorgenza di febbre, brividi e sintomi, che si conclude con un esagerato riflesso di Bezold-Jarisch. Questo rischio può essere migliorata, escludendo le persone con precedenti syncopy vasovagale o un tilt-test positivo, e il volume di carico con fluidi per via endovenosa prima e durante la sfida endotossine 37. I ricercatori che impiegano alte dosi di endotossine sfida (soprattutto 4 ng / kg) deve essere convincente del rischio di bradicardia e / o mettere in pausa cardiaci, avvertono i partecipanti della loro rara ma il potenziale verificarsi, impiegare un adeguato monitoraggio, e disporre di attrezzature di rianimazione prontamente disponibili. Altri criteri di esclusione, in aggiunta a quelli descritti nel protocollo, possono essere richiesti dipendono domanda sperimentale. Per esempio, mentre è prudente escludere quelli che hanno participated in altri studi clinici o sperimentato la chirurgia / traumi negli ultimi tre mesi, la restrizione di ingresso (o l'uso di un parallelo-gruppi non un disegno cross-over negli studi interventistici) per coloro che hanno già partecipato ad prove sfida IV endotossine possono anche essere necessario se la risposta immunologica deve essere valutata: tolleranza endotossina persistere per un periodo di tempo indeterminato in vivo 38,39.

    Diversi limiti sono evidenti con il modello. E 'tradizionalmente svolta in buona salute, i giovani volontari di sesso maschile non-rappresentativo della popolazione clinica. Non interventi sono necessari per le conseguenze fenotipiche della somministrazione di endotossina da risolvere. iniezione purificata LPS fornisce un'esposizione ad un singolo ligando TLR, e non diverse porzioni immunogeniche su un patogeno vivo. Per necessità etica solo una risposta infiammatoria relativamente modesto può essere suscitato. Mimicry di ogni caratteristica fisiopatologica di disease non è raggiunto 40. Così 'ogni aspettativa che il modello di replica completamente le condizioni cliniche di infezione grave, localizzata o sistemica gram-negativo è non-garantito' 18.

    Vorremmo obiettare, tuttavia, che la forza del modello non risiede nella estrapolazione inadeguato al contesto clinico, ma nel interrogando il fisiologico, ematologiche, immunologiche, neuroendocrino e la risposta metabolica delle cellule competenti e sistemi di organi a uno stimolo infiammatorio chiave. interpretazione Riflessivo delle alterazioni transitorie provocato dalla somministrazione endotossine e loro modulazione da sfida farmacologica è stata e continuerà ad essere, informativo nella progettazione di nuove terapie e prevedere la loro efficacia.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Clinical Center Reference Endotoxin (CCRE, Escherichia coli O:113:H10:K negative) National Institutes for Health n/a GMP Manufactured Endotoxin
    Syringes (1 ml, 5 ml)
    Water for injection
    0.9% sodium chloide (sterile, clinical grade)
    Intravenous cannulae Miminum 20 G French
    Sphygmomanometer If intraarterial line placed, transduction equipment for invasive blood pressure monitoring
    Pulse oximeter
    Thermometer Typmanic, oral or core (rectal, oropharyngeal)
    Electrocardiograph machine
    Sample collection tubes As utilized by local clinical laboratory

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    References

    1. Nathan, C., Ding, A. Nonresolving inflammation. Cell. 140, (6), 871-882 (2010).
    2. Adhikari, N. K., Fowler, R. A., Bhagwanjee, S., Rubenfeld, G. D. Critical care and the global burden of critical illness in adults. Lancet. 376, (9749), 1339-1346 (2010).
    3. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nature medicine. 15, (11), 1318-1321 (2009).
    4. Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464, (7285), 104-107 (2010).
    5. Lorne, E., Dupont, H., Abraham, E. Toll-like receptors 2 and 4: initiators of non-septic inflammation in critical care medicine? Intensive care medicine. 36, (11), 1826-1835 (2010).
    6. Brightbill, H. D., et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science. 285, (5428), 732-736 (1999).
    7. Zhang, G., Ghosh, S. Toll-like receptor-mediated NF-kappaB activation: a phylogenetically conserved paradigm in innate immunity. J Clin Invest. 107, (1), 13-19 (2001).
    8. Lawrence, T., Gilroy, D. W. Chronic inflammation: a failure of resolution? International journal of experimental pathology. 88, (2), 85-94 (2007).
    9. Fullerton, J. N., O'Brien, A. J., Gilroy, D. W. Pathways mediating resolution of inflammation: when enough is too much. The Journal of pathology. 231, 8-20 (2013).
    10. Fullerton, J. N., O'Brien, A. J., Gilroy, D. W. Lipid mediators in immune dysfunction after severe inflammation. Trends in Immunology. 35, (1), 12-21 (2014).
    11. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (9), 3507-3512 (2013).
    12. Zolfaghari, P. S., Pinto, B. B., Dyson, A., Singer, M. The metabolic phenotype of rodent sepsis: cause for concern. Intensive Care Medicine Experimental. 1, (6), (2013).
    13. Dyson, A., Singer, M. Animal models of sepsis: why does preclinical efficacy fail to translate to the clinical setting. Critical care medicine. 37, (1 Suppl), S30-S37 (2009).
    14. Rittirsch, D., Hoesel, L. M., Ward, P. A. The disconnect between animal models of sepsis and human sepsis. Journal of leukocyte biology. 81, (1), 137-143 (2007).
    15. van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7, (3), e1000245 (2010).
    16. Calvano, S. E., Coyle, S. M. Experimental human endotoxemia: a model of the systemic inflammatory response syndrome? Surgical infections. 13, (5), 293-299 (2012).
    17. Suffredini, A. F., Noveck, R. J. Human endotoxin administration as an experimental model in drug development. Clin Pharmacol Ther. 96, (4), 418-422 (2014).
    18. Lowry, S. F. Human endotoxemia: a model for mechanistic insight and therapeutic targeting. Shock. 24, Suppl 1. 94-100 (2005).
    19. Andreasen, A. S., et al. Human endotoxemia as a model of systemic inflammation. Current Medicinal Chemistry. 15, (17), 1697-1705 (2008).
    20. Thorn, J., et al. The inflammatory response in humans after inhalation of bacterial endotoxin: a review. Inflamm Res. 50, (5), 254-261 (2001).
    21. Basran, A., et al. Roles of neutrophils in the regulation of the extent of human inflammation through delivery of IL-1 and clearance of chemokines. Journal of leukocyte biology. 93, (1), 7-19 (2013).
    22. Plovsing, R. R., et al. Transcompartmental inflammatory responses in humans: IV versus endobronchial administration of endotoxin*. Crit Care Med. 42, (7), 1658-1665 (2014).
    23. van Eijk, L. T., et al. Gender differences in the innate immune response and vascular reactivity following the administration of endotoxin to human volunteers. Crit Care Med. 35, (6), 1464-1469 (2007).
    24. Krabbe, K. S., et al. Ageing is associated with a prolonged fever response in human endotoxemia. Clin Diagn Lab Immunol. 8, (2), 333-338 (2001).
    25. Krabbe, K. S., et al. Hypotension during endotoxemia in aged humans. Eur J Anaesthesiol. 18, (9), 572-575 (2001).
    26. Engelhardt, R., Mackensen, A., Galanos, C., Andreesen, R. Biological response to intravenously administered endotoxin in patients with advanced cancer. J Biol Response Mod. 9, (5), 480-491 (1990).
    27. Patel, P. N., Shah, R. Y., Ferguson, J. F., Reilly, M. P. Human experimental endotoxemia in modeling the pathophysiology, genomics, and therapeutics of innate immunity in complex cardiometabolic diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (3), 525-534 (2015).
    28. Michie, H. R., et al. Tumor necrosis factor and endotoxin induce similar metabolic responses in human beings. Surgery. 104, (2), 280-286 (1988).
    29. van Deventer, S. J., et al. Experimental endotoxemia in humans: analysis of cytokine release and coagulation, fibrinolytic, and complement pathways. Blood. 76, (12), 2520-2526 (1990).
    30. Fong, Y. M., et al. The acute splanchnic and peripheral tissue metabolic response to endotoxin in humans. The Journal of clinical investigation. 85, (6), 1896-1904 (1990).
    31. Stephens, R. C., O'Malley, C. M., Frumento, R. J., Mythen, M. G., Bennett-Guerrero, E. Low-dose endotoxin elicits variability in the inflammatory response in healthy volunteers. Journal of endotoxin research. 11, (4), 207-212 (2005).
    32. Taudorf, S., Krabbe, K. S., Berg, R. M., Pedersen, B. K., Moller, K. Human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin. Clin Vaccine Immunol. 14, (3), 250-255 (2007).
    33. Leentjens, J., et al. Reversal of immunoparalysis in humans in vivo: a double-blind, placebo-controlled, randomized pilot study. Am J Respir Crit Care Med. 186, (9), 838-845 (2012).
    34. Hamers, L., Kox, M., Pickkers, P. Sepsis-induced immunoparalysis: mechanisms, markers, and treatment options. Minerva Anestesiol. 81, (4), 426-439 (2015).
    35. Xiao, W., et al. A genomic storm in critically injured humans. The Journal of experimental medicine. 208, (13), 2581-2590 (2011).
    36. Williams, W. V., et al. Asystole following endotoxin administration. J Endotoxin Res. 6, (4), 303-306 (2000).
    37. van Eijk, L. T., Pickkers, P., Smits, P., Bouw, M. P., van der Hoeven, J. G. Severe vagal response after endotoxin administration in humans. Intensive Care Med. 30, (12), 2279-2281 (2004).
    38. Kox, M., et al. Differential ex vivo and in vivo endotoxin tolerance kinetics following human endotoxemia. Critical care medicine. 39, (8), 1866-1870 (2011).
    39. Draisma, A., Pickkers, P., Bouw, M. P., van der Hoeven, J. G. Development of endotoxin tolerance in humans in vivo. Critical care medicine. 37, (4), 1261-1267 (2009).
    40. Anel, R., Kumar, A. Human endotoxemia and human sepsis: limits to the model. Critical care. 9, (2), 151-152 (2005).
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    Fullerton, J. N., Segre, E., De Maeyer, R. P. H., Maini, A. A. N., Gilroy, D. W. Intravenous Endotoxin Challenge in Healthy Humans: An Experimental Platform to Investigate and Modulate Systemic Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e53913, doi:10.3791/53913 (2016).More

    Fullerton, J. N., Segre, E., De Maeyer, R. P. H., Maini, A. A. N., Gilroy, D. W. Intravenous Endotoxin Challenge in Healthy Humans: An Experimental Platform to Investigate and Modulate Systemic Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e53913, doi:10.3791/53913 (2016).

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