Abstract
신경 전달 물질과 신경 조절, 결과적으로 다른 신경 반응의 활성의 차이는 마취 웨이크 동물 사이에서 발견 될 수있다. 따라서, 웨이크 동물의 시냅스 시스템의 조작을 허용하는 방법에 의해 영향을받지 마취제 신경 처리 시냅스 입력의 기여도를 결정하기 위해 요구된다. 여기서는 동시에 신경 세포 활성을 기록하고 깨어 마우스에서의 기록 위치의 근방에 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극의 구성에 대한 방법을 제시한다. 이 절차를 결합함으로써, 우리는 선택적으로 머리를 억제 마우스의 열등한 둔덕의 뉴런에서 GABA A를 수용체를 차단하는 gabazine의 microiontophoretic 주사를 시행 하였다. Gabazine는 성공적 주파수 응답 영역과 자극 특정 적응 같은 신경 응답 특성을 개질. 따라서, 우리는 우리의 방법이 recordin에 적합하다는 것을 입증g 단일 유닛 활동 및 청각 처리에서 특정한 신경 전달 물질 수용체의 역할에 대한 해부.
상술 한 절차의 주요 한계는 기록 세션 동물의 습관화의 레벨에 의해 결정되는 상대적으로 짧은 기록 시간 (~ 3 시간)이다. 한편, 복수의 기록 세션은 동일한 동물에서 수행 될 수있다. 신경 전달하거나 (예컨대 전신 주사 또는 optogenetic 모델의 사용 등) neuromodulation 레벨을 조작하는 데 사용되는 다른 실험 절차를 통해이 기술의 이점은 약물의 효과는 표적 뉴런 로컬 시냅스 입력에 한정된다는 점이다. 또한, 전극의 주문 제작은 신경 구조 (예 레코딩의 신호 대 잡음비를 향상시키는 팁 저항과 같은) 관심있는 신경 세포의 종류에 따라 특정의 파라미터 조정을 허용한다.
Introduction
신경 자극과 억제의 상호 작용은 감각 정보 (1)의 처리를 위해 필수적입니다. 또한 마취 피질 활성화 및 2,3- 시냅스 입력의 시간적 패턴의 역학에 강한 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 예를 들면, 마취제는 피질 뉴런 3,4-에서 시각 유발 반응의 지속 기간을 변경하는 것이 관찰되었다. 또한, 흥분 및 억제 성 시냅스 입력 사이의 비율이 모두 유발 변경 및 운동량 속도 -6,7- 마취 깨어 동물 4,5- 다르다. 각성시, 억제가 여기보다 더 강한 반면 시냅스 컨덕턴스를 측정함으로써, 하이더와 동료 4 마취 진폭이 억제 일치 여기를 발견했다. 이러한 결과는 웨이크 동물의 감각 처리 시냅스 특정 입력의 효과를 연구하기 위해 실험 절차의 개발 프롬프트.
<P 클래스 = "jove_content"> (NA 정도의) 작은 전류 주사를인가함으로써 대전 신경 활성 물질의 제어 방출 광범위 시냅스 입력 기여 감각 처리 8-13에서 추정되는 세포 수용체의 역할을 연구하기 위해 사용되어왔다 . microiontophoresis 알려진 이러한 기술은 신속하고 밀폐 효과에 기여하는 기록 된 뉴런의 근방에서 약물의 적용을 허용한다. 이 절차는 전신 주사, 미세 투석 또는 optogenetic 기술의 사용과 같은 다른 실험 조작에 의해 유도 광범위한 효과에 비해 신경 활성 물질의 국소 효과를 연구하는데 더욱 적합하다. 일반적으로 피기 백 전극 구성 14,15 동시에 표적 뉴런 기록 관심있는 신경 활성 물질을 전달하는 데 사용된다. 그것은 신경 활성 물질을 운반하는 multibarrel 피펫에 부착 된 기록 전극으로 구성되어 있습니다. 오의 수정Havey 및 CASPARY (14)에 의해 설명 riginal 절차를 구현하고있다. 예를 들어, 텅스텐 전극 대신에 유리 하나, 신경 활성 (16)을 기록하는데 사용될 수있다. 기록 요건을 충족하는 텅스텐 와이어 팁, 유리 절연 및 팁 노출 조정 전해 에칭 : 텅스텐 전극 (17, 18)의 제조 이전에 게시 된 방법은 일반적으로 세 가지 단계를 포함한다.청각 신경 과학에 흥미와 응급 필드 자극 특정 적응 (SSA 19)의 연구이다. SSA는 다른, 거의 제시하지 소리를 일반화하지 않는 반복적 인 소리에 신경 응답의 특정 감소이다. SSA의 중요성을 유발 전위 20,21 청각 뇌 신경 메커니즘 기본 일탈 검출뿐만 아니라 청각 늦은 불일치 부정적 요소에 대한 가능한 신경 상관 관계로서 잠재적 역할에있다. SSA 오청각 피질 19,22-24까지 IC에서 ccurs. GABA - 매개 억제는 마취 (26)에 의해 영향을받는 것으로 밝혀졌다 SSA 7,16,25에 이득 제어 메커니즘 역할을하는 것으로 입증되었다. 여기에서는 전에 웨이크 생쥐에서 GABA의 -receptors의 선택적 길항제의인가 중에 IC 뉴런의 단일 유닛 활동을 기록하기위한 전술 한 방법을 결합하는 프로토콜을 제시한다. 첫째, 우리는 피기 백 전극과 다음, 수술 및 기록 방법의 제조에 대해 설명합니다. 약물 방출의 효능을 테스트하기 위해, 우리는 수용 필드뿐만 아니라 전 gabazine의 microiontophoretic 배출시 IC 뉴런의 SSA의 수준을 비교했다.
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Protocol
모든 실험 절차의 승인 살라망카 대학에서 수행하고 있었다의 기준에 부합하는 방법을 사용하여, 살라망카 동물 관리위원회의 대학뿐만 아니라 유럽 연합 (EU)의 기준 (지침 63분의 2,010 / EU)에 대한 신경 연구에서 동물의 용도.
1. 텅스텐 전극
주 :. 텅스텐 전극의 제조 및 메릴 워스 27 워스 외 (28)에서 설명한 기존의 기술에 기초하여 수소 등 17에 기재된 작업 환경 설정을 이용하여 수행된다..
- 2.5 MΩ - IC 신경 세포의 단일 단위 세포 활동을 기록하기 위해, 1.5의 팁 임피던스 전극을 사용합니다. 상세한 설명은 전술 한 참고 문헌에서 발견되기 때문에, 여기서, 텅스텐 전극을 제조하는 단계는, 간략하게 설명된다.
- 맞춤 제작 정렬 텅스텐 와이어를 배치도구 (도 1a)는 원하는 길이로 절단 보조한다. 정렬 도구는 전선에 ~ 40mm의 길이를 제한하는 일단 정지하여, 2mm의 간격으로 평행하게 접착 (30)의 바늘 (25 G)로 구성된다. 조심스럽게 접착 테이프로 전선의 느슨한 끝을 부착, 강한 가위 와이어의 나머지 부분을 잘라.
- 모든 와이어 테이프에 부착 된 상태를 유지하는 것이 확인하면서 정렬 도구의 텅스텐 선을 제거하기 위해 테이프에서 부드럽게 당겨. 좋은 전기 연결이되도록 스핀들에 단단히 와이어를 잡고, 광택 황동 스핀들 (그림 1B, C)에 테이프 롤.
- 워크 스테이션에서 5 회전 수 모터 스핀들을 연결하고 에칭 용액 (KNO 2, 80 ml의 당 90g)에 돌출 와이어 팁을 담가. 각 에칭 용액의 표면에 대해 45 ° 축 스핀들. 전선의 ~ 1 / 3의이 솔루션을 문의하도록 와이어 팁을 담가.
- IMM회로를 닫 식욕에 탄소 막대 전극을 ERSE. 스핀들이 회전하는 동안 스핀들 축에 에칭 공급을 적용 스프링 구리 머리 브러쉬를 사용합니다. 전극 및 250mA의 에칭액을 통과하는 전류를 조정한다. 전류가 200mA로 떨어질 때 팁 에칭을 중지합니다. 와이어 팁은 매우 미세한 점으로 에칭 될 것입니다.
- 모든 그리스와 접착제 잔류 물을 제거하는 불꽃을 통해 하나 날카롭게 와이어를 전달합니다. 보로 실리케이트 유리 모세관에 와이어 (제 1 무딘 끝) 배치 (1.5 mm 외경, 0.86 mm의 ID) 하단부와 모델링 점토로 차단. 상단과 하단에 수직으로 피펫을 클램프. 가열 코일 (직경 5mm, 깊이 5mm) 및 일시 중단 된 플런저를 사용하여 피펫을 당깁니다. 와이어가 상기 플런저의 중량에 의해 아래로 당겨질 때, 용융 유리는 주위에 미세한 피막을 형성한다.
- 나트륨 용융 비드의 도움으로 전극의 날카로운 단부에 팁을 덮는 유리 제거테트라. 이 비드에 녹을 때까지 비드를 형성하기 위해, 가열 부에 배치 서서히 물 (~ 0.5 mL)에 소량의과 붕산 나트륨 (~ 0.25 g)를 혼합하고 ~ 2mm 직경. 발열체의 온도를 포텐셔미터에 의해 제어된다. 테이블에 고정 된 조작의 팔에 비드 및 가열 요소를 배치하고 비드가 낮은 배율의 현미경으로 집중 될 때까지 이동합니다.
- 슬라이드에 유리 코팅 와이어를 고정하고 현미경으로 배치합니다. 팁과 붕산 비드 초점이 될 때까지 단계 노브와 슬라이드를 이동합니다. 그것은 약간 녹아 때까지 구슬을 가열하고, 와이어 팁 ~ 10 삽입 - 15 μm의. 가열 전위차계를 끕니다. 비드가 식을 때, 그것은 계약 및 기본 텅스텐 노출, 전극의 끝에서 유리를 제거합니다. 텅스텐 전극을 사용할 수 있습니다.
2. Multibarrel 유리 피펫 제조
- 멀티의 끝을 보호배럴 유리 모세관 열수축 튜브와 (H 구성 다섯 배럴), 풀러 클램프 더 나은 그립을 허용 파손을 방지하고, 수직 풀러 하나를 배치한다.
- 이러한 매개 변수는 특정 설정에 따라뿐만 아니라 변경 후 (38) 미세 조정 : 열 : 84, 하위 자석 힘 : 49, 주 자석의 힘 15mm ~의 팁 길이를 구하려면 다음 매개 변수를 풀러 설정 가열 요소입니다.
- 폐색 팁 두 피펫을 얻기 위해 모세관을 당깁니다. 모델링 점토를 사용하여 슬라이드에 피펫을 마운트하고 외경 때까지 ~ 현미경 (20) 피펫 팁을 깰 - 30 μm의 미세 가위 또는 집게, 또는 메스의 평평한면을 사용. 깨진 에지 너무 거칠면, 단계 1.7에 기재된 테트라 비드 기법을 사용하여 정제.
- 3 축 소형 micropositioner 끝에 20 G 바늘로 이루어지는 홀더 (제 1) 텅스텐 전극 장소 현미경에 장착 사슴이자형. ~ 선단으로부터 30mm를 10 ° - 집게를 사용하여, 상기 전극 (5)의 단부를 구부리.
- 현미경으로 조심스럽게 multibarrel 팁을 통해 텅스텐 전극을 맞 춥니 다. 일단 정렬, 두 상부 배럴 사이의 홈에 끼워은 multibarrel 할 때까지 연락처를 전극을 낮 춥니 다. 멀리 multibarrel의 끝에서 20 μm의 -가 ~ (15)을 돌출 할 때까지 전극의 끝 부분을 밀어 넣습니다. 전극과 더 나은 결합을 얻기 위해 가능한 작게 multibarrel 및 얇은 앙상블 사이의 각도를 만든다.
- 끝에서 멀리 광 경화성 접착제 ~ 5mm의 작은 방울을 적용합니다. 접착제가 multibarrel 채널을 막지 않도록 끝을 도달하지 않도록주의하십시오.
- 푸른 빛 LED 램프를 사용하여 접착제를 치료. 필요한 경우 더 나은 접합을 위해, 접착제 응용 프로그램 / 경화를 반복합니다.
- 텅스텐 전극의 끝을 홀더에서 분리 될 때까지 조심스럽게 현미경 스테이지를 이동합니다. 슬라이드에서 피기 백 앙상블을 제거합니다.
- 제 랩짧은 길이의 피기 백 전극의 전자 중간 부분 튜브 열 수축과 더 multibarrel에 텅스텐 전극을 확보하기 유리에 대한 신속한 경화 에폭시 적절한를 적용합니다.
Microiontophoresis 3. 마약
참고 : 물에 용해 될 때 microiontophoresis에 사용되는 약물은 전하를 가지고 있어야합니다. 관심있는 약물이 절차에 적합한 있는지 확인하기 위해 문헌을 확인합니다. 여기서, gabazine 절차는 GABA 수용체의 길항제가 기재되어있다.
- 물을 살균 더 용질을 함유하지 않는 고정 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 증류수 필터. 이 증류수를 사용하여 gabazine 20 mm의 ~ 1,000 μl를 준비합니다.
- 미세 팁 pH 전극을 사용하여 0.2 μm의 여과 NaOH로 4 희석의 pH를 조정합니다.
- -20 ºC에서 200 μL 씩 - (100)를 저장합니다. 기록 당일 제상. 그 날, 동물이되기 전에 억제유연한 플라스틱 바늘 장착 된 100 μL의 마이크로 실린를 사용하여 약물로 multibarrel 전극 - (5 μL 3) 에드는 배럴을 입력합니다.
4. 수술 및 Headpost의 주입
- (27)와 30g의 무게와 두 남성 CBA / J 마우스 (뮤스의 musculus)에서 실험을 수행합니다. 브라이언트와 동료 (29)의 수술 기록 절차를 따르십시오, Portfors 및 공동 작업자 30-32, 그리고 듀크와 Malmierca 26.
- 일 전에 수술에서, 동물들을 처리하고 자유롭게 탐험 할 수 있도록하여 기록 챔버로 길들. 1 일 3 세션, 적어도 30 분을 지속 각 하나를 수행합니다. 이 방법은 동물 녹음 중에 고요하고 편안한 될 것입니다.
- 근육 내 주사 케타민 (50 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취. 이 투여 량으로 동물을 약 1 시간 동안 깊은 마취. 하나 THIR의 추가 용량을 제공초기 투여 량 (D)은 필요에 따라.
- 38 ± 1 ºC의 온도를 유지하고 두 귀 바와 물어 줄을 이용하여 고정대에 동물의 머리를 안정화되도록 설정하는 가열 담요에 동물을 놓는다. 귀 바 고막을 관통하지 않도록주의하십시오.
- 안과 용 겔 방울을 적용하여 눈을 보호.
- 가위를 사용하여 두피를 면도와 피부를 소독 포비돈 - 요오드를 적용합니다.
- 메스를 사용하여 두개골을 노출하고 정수리와 뒤통수 뼈의 더 주동이의 부분을 덮고있는 골막을 철회 중간 선을 따라 절개를합니다.
- 두개골의 원형과 평면베이스 (5 mm 직경)와 가벼운 두랄루민 headpost (중량 ~ 0.65 g, 길이 30mm, 그림 2A)를 접착제. headpost 무료의 끝을 떠나 중간에 실버 와이어 접착제. 실버 와이어는 전기 생리 학적 기록 용 기준 전극으로서 사용된다.
- LIG의 박층을 적용HT-경화 두개골에 접착제와 headpost의 기본. 10 초를 기다린 후 중간 선을 따라 정수리 뼈의 주동이의 영역에 걸쳐 headpost을 배치합니다.
- 효과적인 접착 강도의 경우, 광은 20 초 동안 청색 광원을 사용하여 접착제를 경화.
- 세 개의 구멍 주위와 전기 드릴과 작은 드릴 비트를 사용하여 headpost의 기본 뒤에 드릴.
- 두개골과 headstage과 같은 추가 접점을 제공하기 위해 드릴 구멍이 시계 나사 (~ 2mm 길이)를 놓습니다. 나사는 1.5이 아늑한 적합을 달성하기 위해 전환이 필요합니다. 그들은 느슨한하지 있는지 확인하기 위해 집게로 나사를 테스트합니다.
- 확실히 그것은 연락처 경질을 세 번째 구멍에 실버 접지 와이어의 끝 부분을 삽입합니다. 두개골에 와이어를 결합하는 방수 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 방울을 적용합니다.
- 두개골과 headpost의 결합을 강화하는 광중합 복합을 적용합니다. headpost의베이스 커버,은 배선의 낮은 부분및주의하면서 나사는 녹화 중에 액세스 할 수 있도록, 람다 뒤에 확장 할 수 없습니다. 푸른 광원을 사용하여 치료.
- 두개골에의 삽입 근처의 목 뒤쪽의 근육을 수축. 작은 트레 (2.35 mm 직경)를 사용하여, 하부 둔덕 (IC)을 노출, 그냥 중간 선에 람다 봉합 및 측면 아래에 둥근 창을 드릴. 경계가 느슨한 경우, 미세 핀셋 덮개 뼈를 잡아 당깁니다. 출혈이 발생하면, 그만 차가운 멸균 식염수로 씻어냅니다.
- 복합 광 경화 함께 창 주위에 작은 (~ 높은 폭 1mm와 ~ 1mm) 벽을 만듭니다.
- 항생제 연고와 노출 된 두개골과 근육을 커버. 이어서, 기록 창의 주위 벽을 한 후 잘 발생 충전 무균 식염수 IC의 노출 된 표면을 적시고 바셀린과 커버.
- 진통제로 (멸균 식염수 1:10 희석 0.03 ㎎ / ㎏) 부 프레 노르 핀의 피하 주사.
- t에 동물을 유지이 각성 및 녹음 세션에 앞서 사흘 동안 수술에서 회복하기 위해 주택 케이지로 돌아갈 때까지 그는 담요를 가열. 개별 rat's 주택 케이지 하우스 동물 젤리를 청소 케이지 동료를 방지하고 금속 격자 커버를 터치 headpost. 동물이 단일 보관시 장에 일부 농축을 놓습니다. 또한, 매일 감염을 방지하고 신중하게 동물이 제대로 회복과 불편의 흔적을 보여주지 않는 것을 확인하는 톱밥을 변경합니다. 석유 젤리가 노출 된 뇌를 보호하는 기록 창 위에있는 경우에도 확인합니다.
5. 전기 생리 녹화 및 Microiontophoresis
- 회복 후, 촬영 환경에 적응하는 동물 시간을 제공하고, 머리를 갖는 억제. 마우스가 몸 크기 (그림 2B)에 새겨진 주문 제작 쿠션 거품 제한 수단에 앉아있는 동안 홀더에 headpost를 고정하여 동물을 적응. 이 의지의 액세스 제한그것은 마우스의 움직임과 평온에 기여할 것입니다.
- 10 분 세션을 시작하고 점진적으로 120 분에 지속 시간을 증가시킨다. 세션 중에 지정된 간격으로 33 달콤한 액체와 동물 (농축 우유가 물에 30:70 희석) 보상. 이후, 기록 세션 동안, 개시시에 세션의 끝이거나 신경 격리되지 않은 상태에서 동일한 보상을 제공한다.
- 동물은 매우 기록 이전에 여기되는 경우, 온화한 진정제 아세 프로 마진 (2 밀리그램 / kg, 복강 내)을 주사. 관심의 신경 시스템에 따르면, 진정제는 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
- 10 분 - 동물이 자유롭게 5 기록 챔버를 살펴 보자.
- 거품 맞춤 쿠션 제한 수단 (그림 2B)에 동물의 몸을 놓습니다.
- 정위 프레임 (그림 2C)에 부착 된 홀더에 headpost를 고정합니다. 이 동물 액체 보상을 제공 할 수있는 좋은 시간입니다.
- 공동목화 담요 동물의 몸 VER 느슨하게은 플라스틱 hemicylinder와 접착 테이프를 이용하여 고정합니다.
- 기록 창에서 석유 젤리를 제거하고 따뜻한 멸균 식염수로 씻어냅니다.
- 녹음 신경 활동과 gabazine의 이온 영동 응용 프로그램입니다.
- 홀더에 multibarrel 전극, 마이크로 드라이브에 의해 제어 및 미세 조작기에 부착 놓습니다.
- 작은 악어 클립을 사용하여, 기록에 전선을 연결합니다. 텅스텐 전극의 단부에 양극 단자와 접촉하는 경질를 은선의 접지 단자를 연결한다.
- 각 총신 내부에 코팅 된 은선을 배치하므로 일단 콘택트 용액 타단에 액세스한다. 제조업체의 지침에 따라 microiontophoresis 장치로 그 끝을 연결합니다.
- 팁 접촉 뇌의 표면까지 multibarrel 전극을 이동합니다. 일의 탈수를 방지하기 위해 따뜻한 멸균 식염수 적용전자 뇌 조직. 이때 (gabazine -10 nA의 특정 약물 문헌 확인) 보유 전류를인가 단일 유닛 행위 보면서 배럴 선단으로부터 약물의 유출을 방지 할 수 있습니다.
- 하나의 신경 세포 활동을 분리하기위한 표준 기술을 사용합니다. 뉴런의 주파수 응답 영역 (FRA)을 구하는, 즉 주파수 및 신경 이러한 사운드 34-36에 민감하기 때문에 응답을 불러 일으키는 능력 강도의 조합.
- 비슷한 발사 속도 및 패턴을 보여주고 두 주파수 (F1 및 F2)을 선택합니다. 괴짜 패러다임에 따라 그 주파수 각각 같은 희귀하고 반복적 인 자극을 제시한다.
주 : 간략하게, 별난 패러다임에서 하나의 주파수 (F1)이 발생하는 높은 확률로 반복 자극으로 제시되고, 제 (F2)이 반복들 중에서 무작위로 산재 드물게 발생하지 일탈 자극된다. 제 별난 서열의 상대적인두 자극의 확률은 반전된다. 자극 패러다임의 상세는 이전 22,37 설명되었다. - (- 20 nA의 10) 양의 값으로 전류를 이동하여 gabazine를 놓습니다. 다시 FRA를 확보하고 gabazine 응용 프로그램 아래에있는 괴짜 패러다임을 반복합니다. 관찰 연소율에 보이는 효과까지 토출 유지; 특정 약물, 그것의 농도 및 토출 전류의 크기에 따라 20 분 - 보통 5 걸린다. 약물의 효과에 따라 값을 얻기 위해, 기록 프로토콜을 반복한다.
- 고정 값으로 전류를 반환하여 사출을 멈춘다. 괴짜 패러다임에 FRA 또는 응답 값을 제어 할 수 반환 모니터링하여 씻어 약물의 효과를 기다립니다.
주 : 기록 세션이 지속될 수 - 하루에 3 시간을, 그리고 동물이 불편하거나 고민의 흔적을 보여줍니다 경우 이전에 종료해야합니다. 보상 액을 지정하고 녹화 채널을 커버석유 젤리 호박색.
6. 데이터 분석
- 전과 gabazine 주입뿐만 아니라 SSA의 레벨 중 FRA를 측정한다.
- 공통 SSA 지수 (CSI) 이전 19,22,23,38,39 바와 같이 주파수 별 SSA 지수 (SI)로 SSA 응답의 강도를 정량화. CSI 및 SI는 드문 자극에 신경 반응과 반복적 인 일에 대한 응답 사이의 정규화 된 차이를 반영합니다. 긍정적 인 CSI 및 SI 값 (자극 당 스파이크가) 반복 톤보다 드문로 높았다 신경 반응을 나타냅니다.
- 제어 및 약물 방출 상태에서 데이터를 비교합니다.
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Representative Results
우리는 IC의 4 잘 격리 된 신경 세포의 단일 유닛 활동을 기록했다. 웨이크 마우스 세포 외 기록시 얻어진 전형적인 신호대 잡음비는도 3b에 도시된다.도 4a는 전 및 GABA (A)의 봉쇄 gabazine으로 -receptors 동안 각 뉴런의 주파수 응답 영역 (FRA)을 나타낸다. 반응 강도 (스파이크 / 자극)뿐만 아니라 스펙트럼 조정의 폭이 넓어의 증가가 관찰되었다. 유발 된 반응의 증가 (그림 4B) 제시되는 모든 주파수와 강도에 신경 응답에서 얻은 축적 된 요정 - 자극 시간 히스토그램도 분명했다.
신경 세포의 FRA (그림 4A에서 십자가) 내에서 주파수의 하나 또는 두 개의 쌍의에, 괴짜 패러다임에 반복 또는 희귀 한 소리로 표현 될 선택되었다그들의 반응에 SSA의 수준을 tudy. 이전과 gabazine 주입하는 동안 두 예 뉴런 (F1 및 F2) 각 주파수의 사운드 유발 응답을 그림 5A, B의 도트 래스터로 표시됩니다. 도트 래스터 및 PSTHs에서 관찰 두 예 뉴런를 들어, 사운드 유발 응답 분명한 변화가 있었다.
마찬가지로, GABA의 -receptors의 지역 봉쇄는 우리의 이전 연구 (16)와 계약 희귀하고 반복적 인 톤의 대다수 (그림 5C)에 대한 신경 반응을 증가했다. SSA의 다른 레벨이 긍정적 인 CSI에 반영 F1 및 F2에 신경 반응, 관찰되었다 (CSI 간격 : -0.26 0.25 ± 0.23, 0.43에) 및 SI 값 (SIS 간격 : -0.41, 0.83 ± 0.23, 0.25) . 도 5D에서 관찰 된 바와 같이 대부분의 경우를 들어, 반복적 톤 증가 된 응답은 그 지수의 저하의 원인
텅스텐 전극의 제조 그림 1. 재료. 대신에 약간의 텅스텐 와이어 (A) 전극 정렬 도구. 왼쪽의 밝은 부분은 전선 정지입니다. 가위 팁이 부착 된 전극의 배치와 함께. (B) 빈 스핀들. (C) 스핀들을 원하는 길이로 전선을 절단 가이드로 사용되는 측면을 나타내고, 홀더에 휴식. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
깨어 마우스의 녹음 2. 액세서리 그림. (A) Headpost. (B) 쿠션 거품 제한 수단을 사용자가-했다. 장소 t두 조각 사이에서 그는 마우스, 외부의 머리를 떠나. 정위 프레임 (C) 수정. headpost 홀더 (상단 바는) headpost 주입하는 동안 지원하고 녹음하는 동안 머리를 억제한다. 물린 부분이 (아래 줄) 만 headpost 주입시 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 깨어 마우스의 기록 3. 예. (A) 마우스 IC에서 뉴런의 주파수 응답 영역. (B)이 신경 세포로부터 기록 스파이크 파형. (C, D) 도트 래스터 및 주파수 괴짜 패러다임을 사용하여 신경 세포로부터 기록 peristumulus 시간 히스토그램 지시 에서 점으로 (A). 데이터에서 다시 그려듀크와 Malmierca (26)에 발표했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
GABA (A)의 봉쇄 그림 4. 효과 스펙트럼 및 시간 응답 특성에 -receptors. 네 개의 IC의 (A) 주파수 응답 영역 전과 gabazine의 microiontophoretic 주입시 신경을 기록했다. (A)의 검은 십자가 주파수 희귀 반복적 소리로 표현되도록 선택 나타낸다. (B) 전에 주사 중에 반응 영역을 구성하기 위해 제시되는 모든 주파수 및 강도에 신경 반응 조갑 자극 시간 히스토그램 누적 gabazine의. 검은 막대는 소리 지속 시간을 나타냅니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
GABA (A)의 봉쇄 그림 5. 효과 반복 및 희귀 소리에 응답에 수용체. (A, B) 및 전 gabazine의인가 중에 드문 (적색, 10 %) 및 반복 자극 (블루, 90 %)로 표현 주파수 쌍에 스파이크 응답 도트 래스터. 각 주파수는 각자가 rare- 반복적으로 제시했다 있도록 두 시퀀스에서 재생됩니다. 음영 배경 자극의 지속 시간을 나타냅니다. (C)를. 희귀 한 바와 같이 전 gabazine의 적용 동안 반복적 인 사운드로 표현 주파수 일곱 쌍 단일 신경 세포의 반응. (D) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
깨어있는 동물의 신경 활성 물질의 microiontophoresis는 프로브 및 단일 뉴런 40, 41의 활동에 특정 시냅스 입력의 역할을 해부 할 수있는 강력한 기술이다. 더 중요한 것은,이 절차는 마취제의 잠재적 인 간섭없이 신경 회로의 신경 전달 물질과 신경 조절의 영향의 결정을 할 수 있습니다. 여기서는 웨이크 마우스의 IC에 gabazine의인가 견고 주파수 튜닝 (도 4A)에서, 시간 응답 패턴 (도 4B)과 SSA (도 5)으로 변경 보여준다.
상술 한 절차의 주요 한계는 기록 세션 동물의 습관화의 레벨에 의해 결정되는 상대적으로 짧은 기록 시간 (~ 3 시간)이다. 한편, 복수의 기록 세션은 동일한 동물에서 수행 될 수있다. microiontophoresis을가 얼마나 불분명되어 사용인가 된 신경 활성 물질이 주변 조직으로 확산. 따라서, 신경 네트워크 작동 가능한 효과는 기록 뉴런뿐만 아니라 주변의 폐해 및 신경 세포뿐만 아니라 영향에 의해 유발 될 수있다. 예를 들어, 사탕과 동료 (42)는 신속하게 제거되지 않는 특정 이온 삼투 전달 분자, 600 μm의까지 확산 될 수 있음을 보여 주었다. 마우스 IC에서이 범위는 수지상 아버의 범위의 대부분을 커버뿐만 아니라 인접 셀의 신경 세포 반응에 영향을 미칠 것이다. 같은 공간 16,43을 처리, 그것은 다른 실험보다 더 특정 대상 신경 세포와 로컬 네트워크의 테스트에 시냅스 입력의 미세한 세부 사항에 절개를 허용 세포 내 약물 투석으로 제한되지 요약하면, 이온 토 포레 시스가 발표 한 약이된다 절차는 전신 주사 optogenetic 기술의 사용 또는 푸시 PUL 같은 신경 전달 또는 neuromodulation의 레벨을 조작 할리터 투석.
유리 피펫의 선단 직경과 유지 및 주사 전류의 크기는 조직 특이성 약물로의 누출을 방지하기 위해 모니터링하는 주요 요인이다. (NA 수십 정도의) 낮은 주입 전류는 서로 근접 뉴런의 기록을 허용하는 약물의 확산을 제한한다. 예를 들어, 예 (뉴런 1 - 2)로 사용되는 네 개의 뉴런 셋 (16)의 거리 및 그들 사이의 800 ㎛의과 같은 트랙을 따라 기록 하였다. 신경 1과 2 사이에 16 ㎛의 짧은 거리에도 불구하고, 신경 세포 (2)의 명확히 다른 응답은 (도 4)이 관찰되었다.
제안 피기 백 구성에 어떤 대안이 이전에 사용되었다. 그 중 하나가 아닌 별도의 전극, 기록 용 multibarrel 피펫 중 하나의 용도로 구성된다. 앙상블의 구성이 경우 덜 복잡하지만, 단점이있다. 전나무t는 모든 채널을 기록 및 약물 전달 모두 최적이 아닐 수 끝에 동일한 개구 직경을 가질 것이다. 또한, 피기 백 구성에서 돌출 전극 팁 가능성이 multibarrel의 넓은 팁에 의한 표적 세포에 대한 손상을 방지한다. 제 2 공통 대안 텅스텐 전극 대신 15,44를 기록하기위한 단일 배럴 유리 피펫을 사용하는 것이다. 유리 전극은 긴 녹음하는 동안 필요한 크기로 제조하지만, 방해하는 경향이 쉽게 또는 수 있도록, 뇌에 깊은 여행 할 때 우리의 경험 텅스텐 전극보다 안정적인 레코딩을 제공합니다. 또한, 텅스텐 전극을 사용하여 신경을 추적 분사 (45)를 사용할 때 요구되는 더 정교한 학적 절차없이, 기록 위치를 찾을 전해 병변을 생성 할 수있다. multibarrel 유리 피펫의 사용 기록에 매우 가깝게 다수 작용제 및 / 또는 길항제의 방출을 허용감각 처리에 신경 전달 물질 시스템 간의 상호 작용이 연구하에있을 때 상당한 이점 사이트.
피기 백 전극의 제조에 대한 본 프로토콜에 기재된 절차는 가능한 실험 및 체계적인 관심 아직 정의 방법의 대상 영역의 특성의 특정 요구 사항에 따라 기록 전극을 제조 할 수 있습니다. 그들은 쉽게 이용할 수 있도록 또한 headpost 고정 용 물질은 통상 치과에서 사용된다. 따라서, 프로토콜의 중요한 단계는 동물 습관화 잘 격리 신경 안정 전기 생리 학적 기록에 기여하는 주요 요소 인 텅스텐 전극의 에칭이다. 전반적으로,이 기술은 수단 깨어 단일 또는 다중 장치의 연결 활동에 대한 여러 신경 활성 물질의 역할을 연구하기 위해 상대적으로 간단하고 경제적이며 매우 안정, 헤드폰구속 마우스.
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Acknowledgments
MINECO에 의해 투자 된이 프로젝트는 BFU201343608-P 및 PSI2013-49348-EXP 및 ARP에 MSM 및 MRC 핵심 자금 조달에 JCYL 부여 SA343U14을 부여합니다. YAA은 CONACYT (216106)와 9월의 교제를 개최했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
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