Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ekstracellulære opptak av neuronal aktivitet kombinert med Microiontophoretic Bruk av neuroaktive stoffer i Awake Mus

Published: May 21, 2016 doi: 10.3791/53914
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,4
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León, University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research, University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine, University of Salamanca

Abstract

Forskjeller i aktiviteten til nevrotransmittere og nevromodulatorer, og dermed ulike nevrale responser, kan finnes mellom bedøvet og våken dyr. Derfor er fremgangsmåter som tillater manipulering av synaptiske systemer i våken dyr nødvendig for å bestemme bidraget av synaptiske innganger til neuronal behandling upåvirket av anestetika. Her presenterer vi metodikk for bygging av elektroder til å samtidig registrere ekstracellulære nevral aktivitet og slipper flere neuroaktive stoffer i nærheten av innspillingsplasser i våken mus. Ved å kombinere disse prosedyrene, utførte vi microiontophoretic injeksjoner av gabazine å selektivt blokkere GABA A-reseptorer i nevronene i dårligere colliculus hode-behersket mus. Gabazine hell modifisert neurale responsegenskaper, slik som frekvensrespons området og stimulus-spesifikk tilpasning. Derfor viser vi at våre metoder er egnet for recording single-enhet aktivitet og for dissekere rollen av spesifikke nevrotransmitterreseptorer i auditiv prosessering.

Den største begrensningen av den beskrevne fremgangsmåte er den forholdsvis korte opptakstiden (~ 3 timer), som bestemmes av nivået av tilvenning til dyret som innspillingen. På den annen side, kan flere innspillingen utføres i det samme dyr. Fordelen med denne teknikken fremfor andre eksperimentelle prosedyrer anvendt for å manipulere nivået av neurotransmisjon eller neuromodulation (slik som systemiske injeksjoner eller bruken av optogenetic modeller), er at medisineffekt er begrenset til de lokale synaptiske innganger til målet neuron. I tillegg er tilpasset fremstilling av elektroder tillater justering av spesifikke parametere i henhold til det neurale strukturen og typen av nervecelle av interesse (slik som tupp motstand for å forbedre signal-til-støy-forholdet av opptak).

Introduction

Samspillet mellom nevrale eksitasjon og hemming er grunnleggende for behandlingen av en sensorisk informasjon. Det er også kjent at anestesi har en sterk innvirkning på dynamikken i kortikale aktivering og tidsmessig mønster av synaptiske innganger 2,3. For eksempel har det blitt observert at bedøvelsesmidler endre varigheten av visuelt-fremkalte responser i kortikale neuroner 3,4. Videre er forholdet mellom stimulerende og hemmende synaptiske innganger annerledes i bedøvede og våken dyr 4,5, endre både fremkalt og spontane aktivitet prisene 6,7. Ved å måle synaptic conductances, Haider og kolleger fire funnet at hemming matchet eksitasjon i amplitude under narkose, mens under våkenhet, hemming var sterkere enn eksitasjon. Disse funnene be utvikling av eksperimentelle prosedyrer for å studere effekten av spesifikke synaptiske innganger på sensorisk prosessering i våken dyr.

<p class = "jove_content"> Den kontrollerte utstøting av ladede neuroaktive stoffer ved påføring av små strøm injeksjoner (i størrelsesorden nA) har blitt mye brukt for å undersøke bidraget av synaptiske innganger og rollen til antatte cellereseptorer i sensorisk prosessering 8-13 . Denne teknikken, kjent som microiontophoresis, tillater anvendelsen av narkotika i nærheten av den innspilte nervecellen, noe som bidrar til en rask og begrenset effekt. Denne fremgangsmåten er mer egnet for å studere virkningene av lokale neuroaktive stoffer, sammenlignet med den utbredte effekten fremkalt av andre eksperimentelle manipulasjoner slik som systemiske injeksjoner, mikrodialyse eller bruken av optogenetic teknikker. Vanligvis er en piggy-back elektrodekonfigurasjon 14,15 brukes til å samtidig spille inn målet nervecellen og levere neuroaktive stoffer av interesse. Den består av en innspilling elektrode festet til en multibarrel pipette som bærer de neuroaktive stoffer. Modifikasjoner av original prosedyre beskrevet av havey og Caspary 14 er gjennomført. For eksempel kan en wolframelektrode, i stedet for en glass en, brukes til å registrere den 16 nevral aktivitet. Tidligere publiserte metoder for produksjon av wolfram elektroder 17,18 involverer tre generelle trinn: elektrolytisk etsning av wolfram ledning tips, glass isolasjon og justering av spissen eksponering for å møte opptakskravene.

En interessant og emergent felt i auditiv nevrovitenskap er studiet av stimulus-spesifikk tilpasning (SSA 19). SSA er en spesifikk nedgang i det nevrale respons på repeterende lyder som ikke generalisere til andre, sjelden presentert lyder. Betydningen av SSA befinner seg i sitt potensielle rolle som en neural mekanisme underliggende avvik deteksjon i hørsels hjernen, samt en mulig neuronal korrelat for sent mismatch negativity del av auditive evoked potensial 20,21. SSA occurs fra IC opp til auditiv cortex 19,22-24. GABA A-formidlet inhibering har vist seg å fungere som en forsterkningsstyremekanisme på SSA 7,16,25, som også er blitt vist å være påvirket av anestesi 26. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer de tidligere beskrevne fremgangsmåter for registrering av én enhet aktivitet av IC-nevroner før og under påføringen av en selektiv antagonist av GABA-A-reseptorene i våken mus. Først beskriver vi produksjon av piggy-back elektroder og neste, de kirurgiske og innspillingsmetoder. For å teste effekten av medikamentfrigjøring, vi sammenlignet mottakelig feltet, så vel som nivået av SSA av IC-nevroner før og under microiontophoretic utstøting av gabazine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført ved universitetet i Salamanca med godkjenning av, og bruk av metoder i samsvar med kravene i, Universitetet i Salamanca Animal Care Komiteen samt kravene i den europeiske union (direktiv 2010/63 / EU) for bruk av dyr i nevrovitenskap forskning.

1. Tungsten elektroder

Merk: produksjon av wolfram elektroder er basert på den opprinnelige teknikken beskrevet i Merrill og Ainsworth 27 og Ainsworth et al 28 og utføres ved hjelp av oppsett av arbeidsstasjon beskrevet i Bullock et al 17...

  1. For å ta opp enkeltenhet ekstracellulære aktivitet av IC nevroner, bruke elektroder med et tips impedans på 1.5 til 2.5 Megohm. Her er de trinnene som er involvert i wolfram-elektrode fremstilling beskrives bare en kort stund, ettersom en detaljert beskrivelse er funnet i de ovenfor nevnte referanser.
  2. Plasser wolframtråder i en spesialbygd justeringverktøyet (figur 1A) for å hjelpe til å kutte dem til ønsket lengde. Justeringsverktøyet består av 30 nåler (25 g) limt i parallell ved 2 mm intervaller, med en stopp ved den ene ende for å begrense lengden av ledningene til ~ 40 mm. Nøye feste de løse endene av ledninger med teip, og kuttet resten av ledningen med sterke saks.
  3. Trekk forsiktig fra båndet for å fjerne tungsten ledninger fra justeringsverktøyet, og pass på at alle ledningene forbli festet til tape. Rull teip på en polert messing spindel (figur 1B, C), holder ledningene fast mot spindelen så det er en god elektrisk forbindelse.
  4. Koble spindelen til en 5 rpm motor i arbeidsstasjonen, og dypp de utstikkende tråd tips til en etsning løsning (KNO 2, 90 g per 80 ml). Vinkel spindelaksen 45 ° i forhold til overflaten av etseoppløsningen. Fordyp lednings tips slik at ~ 1/3 av ledningene kontakt løsningen.
  5. immErse en karbonelektrode stang inn i den etsende bad for å slutte kretsen. Bruke en fjær kobberfletting pensel til å påføre etsetilførselen til spindelakselen mens spindelen roterer. Juster den strøm som passerer gjennom elektrodene og den etsende oppløsning til 250 mA. Stopp spissen etsing når strømmen faller til 200 mA. Tråd tips vil bli etset inn veldig fine poeng.
  6. Pass en skjerpet ledning gjennom en flamme for å fjerne fett og limrester. Plasser ledningen (butte ende først) inn i et borsilikatglass kapillær (1,5 mm ytre diameter, 0,86 mm ID) med sin nedre ende blokkert med modelleringsleire. Klem pipetten vertikalt på toppen og bunnen. Trekk pipetten ved hjelp av en varmebatteri (diameter 5 mm, dybde 5 mm) og en suspendert stempelet. Etter hvert som tråden trekkes ned av vekten av stempelet, danner det smeltede glass en meget fin pels rundt den.
  7. Fjern det glass som dekker tuppen på den spisse enden av elektroden ved hjelp av en smeltet vulst av natriumtetraborate. For å danne vulsten, bland natrium- tetraborat (~ 0,25 g) med en liten mengde vann (~ 0,5 ml) og langsomt plassere den på et varmeelement, inntil den smelter til en vulst ~ 2 mm i diameter. Temperaturen på varmeelementet styres av et potensiometer. Plasser vulsten og varmeelementet på en manipulatorarm som er festet til bordet, og flytte den til vulsten er rettet under mikroskop ved lav forstørrelse.
  8. Fest glass-dekket ledning til et lysbilde og plassere den under mikroskopet. Flytt lysbilde med scenen knottene til spissen og tetra perle er i fokus. Varm perlen før det smelter litt, og sett ledningen tips ~ 10 - 15 mikrometer. Slå av varme potensiometeret av. Som vulsten kjøles ned, den trekker seg sammen og fjerner glasset fra spissen av elektroden, å eksponere det underliggende wolfram. Den wolframelektrode er klar til bruk.

2. Multibarrel Glass Pipette Manufacturing

  1. Beskytte endene av multifat glasskapillærer (fem fat i H-konfigurasjon) med varmekrymperør, for å gi et bedre grep til avtrekker klemmer og forhindre brudd, og plasser en i vertikal avtrekker.
  2. For å få tips lengder på ~ 15 mm, sett avtrekker til følgende parametre: Varme: 84, Sub magnet kraft: 49, Main magnet kraft: 38. Fine-tune disse parameterne i henhold til den spesielle oppsett, samt etter endring av varmeelement.
  3. Trekk kapillær til å få to pipetter med tips okkludert. Montere en pipette på et objektglass ved hjelp av modellering leire og bryte pipettespissen under mikroskop inntil den ytre diameter er ~ 20 - 30 For um, ved hjelp av fin saks eller tang, eller den flate siden av en skalpell. Hvis brutt kanten er for grovt, avgrense det ved hjelp av tetra perle teknikken beskrevet i trinn 1.7.
  4. Plasser en wolframelektrode (fra avsnitt 1) ​​i en holder laget med en 20 G nål i enden av et tre-akset miniatyr micropositioner montert på mikroskopet stage. Ved hjelp av tang, bøy enden av elektroden 5 - 10 °, ~ 30 mm fra spissen.
  5. Under mikroskopet, nøye justere Wolfram elektrode over multibarrel spissen. Når justert, lavere elektroden til den kommer i kontakt med multibarrel, passer i sporet mellom de to øverste fat. Skyv spissen av elektroden inntil den stikker frem ~ 15-20 um bort fra spissen av multibarrel. Gjøre vinkelen mellom elektroden og den multibarrel så liten som mulig for å oppnå en bedre binding og en tynnere ensemble.
  6. Påfør en liten dråpe lysherdende lim ~ 5 mm fra tuppen. Vær forsiktig limet ikke når tips for å unngå å blokkere multibarrel kanaler.
  7. Kurere limet ved hjelp av et blått lys LED lampe. Gjenta lim application / herding hvis nødvendig, for bedre binding.
  8. Bevege objektbordet forsiktig til enden av wolfram elektrode er frigjort fra holderen. Fjern piggy-back ensemble fra raset.
  9. Pakk the midtre delen av piggy-back elektrode i en kort lengde av varme-krympe rør og anvende hurtig herding epoxy egnet for glass for ytterligere å sikre den wolframelektrode til multibarrel.

3. Legemidler for Microiontophoresis

Merk: legemidler som brukes for microiontophoresis må ha en elektrisk ladning når oppløst i vann. Sjekk litteraturen for å se om stoffet av interesse er passende for denne prosedyren. Her, er prosedyren for gabazine, en antagonist av GABA A reseptoren, er beskrevet.

  1. Filtrer destillert vann ved bruk av en 0,2 um sprøytefilter for å sterilisere vannet og sikre som ikke inneholder noen oppløste stoffer. Forbered ~ 1000 mL 20 mM gabazine bruke denne destillert vann.
  2. Juster pH i fortynning til 4 med 0,2 um filtrert NaOH ved anvendelse av en fin spiss pH-elektrode.
  3. Lagre 100 - 200 ul porsjoner ved -20 ºC. Tine den dagen opptaket. Den dagen, før dyret er beherskeed, fyller tønnene (3 - 5 pl) av multibarrel elektrode med medikamenter, ved å bruke en 100 ul mikrosprøyte utstyrt med en fleksibel plast nål.

4. kirurgi og Headpost Implantasjon

  1. Utføre eksperimenter på to hann CBA / J-mus (Mus musculus) med vekter på 27 og 30 g. Følg kirurgiske og opptaksprosedyrer Bryant og kolleger 29, Portfors og samarbeidspartnere 30-32, og Duque og Malmierca 26.
  2. I dagene før operasjonen, håndtere dyrene og venne dem til innspillingen kammeret ved å tillate dem å utforske fritt. Utfør 3 økter per dag, hver og en som varer i minst 30 min. På denne måten dyrene blir roligere og komfortabel under opptakene.
  3. Bedøve mus ved anvendelse av en blanding av ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injisert intramuskulært. Med denne dosen dyret er dypt bedøvet for rundt en time. Gi supplerende doser av en third av den første dosen etter behov.
  4. Plasser dyret på et varmeteppe satt til å opprettholde en temperatur på 38 ± 1 ° C og stabilisere dyrets hode i en stereotaksisk ramme ved hjelp av to øret barer og en bit bar. Vær forsiktig med å stikke hull på trommehinnen med øret barer.
  5. Beskytt øynene ved å bruke en dråpe oftalmisk gel.
  6. Shave hodebunnen med saks og bruke povidon-jod til å desinfisere huden.
  7. Ved hjelp av en skalpell, gjør et snitt langs midtlinjen for å avsløre skallen og trekke periosteum dekker parietal og mer rostral del av occipital bein.
  8. Lim et lett duralumin headpost (vekt ~ 0,65 g, lengde 30 mm, figur 2A) med en rund og flat bunn (5 mm diameter) på skallen. Lim en sølvtråd til midten av headpost forlater endene gratis. Den sølvtråd blir brukt som referanseelektrode for den elektrofysiologisk opptaket.
  9. Påfør et tynt lag med lyht-herdbart klebemiddel på skallen og bunnen av headpost. Vent 10 sekunder og legg headpost over rostral området av parietalbena, langs midtlinjen.
  10. For en effektiv bindingsstyrke, lett herde limet ved hjelp av et blått lys kilde for 20 sek.
  11. Bore tre hull rundt og bak bunnen av headpost ved hjelp av en elektrisk drill og en liten borkronen.
  12. Plasser to watch skruer (~ 2 mm lengde) i hullene for å tjene som flere kontaktpunkter mellom skallen og heads. Skruene krever 1½ blir å oppnå en tettsittende passform. Test skruene med pinsett for å sørge for at de ikke er løse.
  13. Sett tuppen av sølv jordledningen inn i det tredje hullet gjør at den kommer i kontakt med dura. Påfør en liten dråpe vann motstandsdyktig cyanoakrylatlim å binde ledningen til skallen.
  14. Påfør lysherdende kompositt å forsterke bindingen av headpost med skallen. Dekke bunnen av headpost, den lave delen av sølvtråd,og skruene, være forsiktig med å utvide bak lambda, for å gi tilgang under opptak. Herde ved hjelp av en blå lyskilde.
  15. Trekke tilbake muskelen på baksiden av halsen nær dens innsetting på skallen. Ved hjelp av en liten trephine (2,35 mm diameter), bore et rundt vindu rett under lambda sutur og lateralt for midtlinjen, for å avsløre den underlegne colliculus (IC). Når grensene er løs, dra opp dekker bein med fine pinsett. Hvis blødningen oppstår, skyll med kaldt sterilt saltvann for å stoppe det.
  16. Lag en liten (~ 1 mm bred og ~ 1 mm høye) veggen rundt vinduet med kompositt og lys-kur det.
  17. Dekke utsatte skallen og muskel med antibiotisk salve. Deretter fukte den eksponerte overflate av IC med sterilt saltvann og dekke den med vaselin, fylling i brønnen som genereres etter at veggen rundt opptaket vinduet.
  18. Injisere buprenorfin subkutant (0,03 mg / kg, fortynnet 1:10 i sterilt saltvann) som et analgetikum.
  19. Holde dyret på tHan oppvarming teppe før det våkner og returnere den til sin bolig bur å gjenopprette fra kirurgi i tre dager før innspillingen. Hus dyr i enkelte rat's boliger buret for å hindre bur kamerater rense ut gelé og headpost berøre metallgitter dekselet. Plasser noen berikelse i buret når dyret er enkelt plassert. Også endre daglig sagmugg for å hindre smitte og nøye kontrollere at dyret kommer seg ordentlig og ikke viser noen tegn til ubehag. Sjekk også om vaselin er over opptaksvinduet beskytte utsatte hjernen.

5. Elektro Opptak og Microiontophoresis

  1. Etter utvinning, gi dyret tid til å akklimatisere seg til innspillingen miljø og ha hodet behersket. Akklimatisere dyret ved å feste headpost til innehaveren mens musen sitter på en skreddersydd polstret skum rainer skåret av sin kroppsstørrelse (figur 2B). Dette vil limdet bevegelser av musen, og vil bidra til sin ro.
  2. Start med 10 min økter og gradvis øke varigheten opp til 120 min. Under økten, belønne dyrene med søte væsker (kondensert melk, fortynnet 30:70 i vann) ved gitte intervaller 33. Senere, under innspillingen, gi den samme belønning ved starten og ved slutten av sesjonen eller mens ingen neuron blir isolert.
  3. Hvis dyret er veldig spent før innspillingen, injisere mildt beroligende acepromazine (2 mg / kg, intraperitoneal). Ifølge nervesystemet av interesse, kan den sedative påvirke resultatene.
  4. La dyret fritt utforske opptakskammeret i 5 - 10 min.
  5. Plasser dyrets kropp inn i skummet skreddersydde polstrede rainer (figur 2B).
  6. Sikre headpost til en holder festet til den stereotaktisk ramme (figur 2C). Dette er et godt tidspunkt å gi dyret en væske belønning.
  7. Cover dyrets kropp med en bomullsteppe og løst fest den med en plast hemicylinder og teip.
  8. Fjern vaselin fra innspillingen vinduet og skyll med varmt sterilt saltvann.
  9. Record nevral aktivitet og iontoforetiske anvendelse av gabazine.
    1. Plasser multibarrel elektrode på holderen, kontrollert av en Microdrive og festet til en micromanipulator.
    2. Koble ledningene for opptak, ved hjelp av små krokodilleklemmer. Koble den positive terminalen til enden av wolfram elektrode, og jordterminalen til sølvtråd som er i kontakt dura.
    3. Plasser en ubestrøket sølvtråd i hver tønne, så den ene enden i kontakt med løsnings og den andre enden er tilgjengelig. Koble disse endene til microiontophoresis enhet, å følge instruksjonene fra produsenten.
    4. Flytt multibarrel elektroden inntil spissen kommer i kontakt med overflaten av hjernen. Anvende varme sterilt saltvann for å forhindre uttørring av the hjernevev. På dette punkt gjelder en retensjon strøm (-10 nA for gabazine, sjekk litteraturen for det bestemte medikament) for å unngå lekkasje av legemiddelet fra sylinderen spiss mens du leter etter enkelt-enhet aktivitet.
    5. Bruk standard teknikker for å isolere enkelt Nevron ekstracellulære aktivitet. Oppnå frekvensresponsen område (FRA) av nervecellen, dvs. kombinasjonen av frekvenser og intensiteter i stand til å fremkalle en reaksjon, fordi neuron er følsom for disse lydene 34-36.
    6. Velg to frekvenser (F1 og F2) som fremkalle en lignende skuddtakt og mønster. Presentere hver av de frekvensene som sjelden og repeterende stimulus under underlig paradigme.
      Merk: Kort, i underlig paradigmet, er en frekvens (f1) presentert som den repeterende stimulus med en høy sannsynlighet for forekomst, mens den andre (f2) er det sjelden forekommer avvikende stimulans, ispedd tilfeldig blant de repetitive seg. I et andre underlig sekvens, den relativesannsynlighetene for de to stimuli er reversert. Detaljer om stimulering paradigmet har blitt beskrevet tidligere 22,37.
    7. Slipp gabazine ved å flytte strømmen til positive verdier (10-20 NA). Skaff igjen FRA og gjenta underlig paradigmet under gabazine søknaden. Opprett utstøting inntil en synlig effekt i avfyringshastigheten er observert; Det tar vanligvis på 5 - 20 min, avhengig av det spesielle medikament, dets konsentrasjon, og størrelsen av den aktuelle utskytings. Gjenta innspillingen protokollen for å oppnå verdier under virkningen av medikamentet.
    8. Stoppe injeksjonen ved å returnere strømmen til retensjonsverdier. Vent for virkningen av stoffet for å vaske bort ved å overvåke at FRA eller respons på underlig paradigmet tilbake til kontrollverdiene.
      Merk: Innspillingen kan vare 2-3 timer per dag, og skal være avsluttet tidligere hvis dyret viser tegn på ubehag eller sliter. Gi belønning væske og dekker innspillingen lmgult med vaselin.

6. Data Analysis

  1. Mål FRA før og under gabazine injeksjon, så vel som nivået av SSA.
  2. Kvantifisere styrken på SSA respons fra common-SSA indeks (CSI) og frekvensen spesifikke SSA indeks (SI) som beskrevet tidligere 19,22,23,38,39. CSI og SI reflektere den normaliserte forskjell mellom nerveaktivitet ved den sjeldne stimulus og responsen til den repeterende en. Positive CSI og SI verdier indikerer det nevrale respons (pigger per stimulus) var høyere for å sjelden enn til repeterende toner.
  3. Sammenligne data fra kontroll- og medikament utstøting tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi spilte inn én enhet aktivitet av 4 godt isolerte nerveceller i IC. Typiske signal-til-støy-forhold oppnås under ekstracellulære opptak i våkne mus er vist i figur 3B. Figur 4A viser frekvensresponsen område (FRA) for hver neuron før og under blokade av GABA A reseptorer med gabazine. En økning i responsen styrke (pigger / stimulus), samt en utvidelse av den spektrale tuning ble observert. Økningen i fremkalt respons var også tydelig i de akkumulerte peri-stimulans tid histogrammer hentet fra det nevrale svar på alle frekvensene og intensiteter presenteres (figur 4B).

Ett eller to par frekvenser innenfor nevronets FRA (kors i figur 4A) ble valgt til å bli presentert som gjentatte eller sjeldne lyder i en underlig paradigme, til sSTUDIUM nivået av SSA i sine svar. For to eksempel nevroner, lyd-fremkalt respons til hver frekvens (f1 og f2) før og under gabazine injeksjon er vist som punkt rastere i figur 5A, B. For de to eksempler neuroner, var det en klar endring i lyd-fremkalte respons som er observert i dot raster og PSTHs.

Likeledes, den lokale blokade av GABA A -reseptorer økte nerveaktivitet ved den store majoriteten av sjeldne og repeterende toner (figur 5C) i samråd med vår forrige undersøkelse 16. ble observert ulike nivåer av SSA i nevrale responser på f1 og f2, som ble reflektert i positiv CSI (CSI intervall: -0,26 til 0,43, 0,25 ± 0,23) og SI-verdier (SIS intervall: -0,41 til 0,83, 0,25 ± 0,23) . For de fleste tilfeller vil den økte responsen til den repeterende tone forårsaket et fall i disse indekser som er observert i figur 5D

Figur 1
Figur 1. Materiale for Produksjon av Tungsten elektroder. (A) elektrode justeringsverktøy, med noen tungsten ledninger på plass. Den lettere stykke til venstre er en stopper for ledningene. Den saksespissen indikerer side brukes som en guide for å kutte ledningene til ønsket lengde. (B) Empty spindelen. (C) Spindel med en gruppe med elektroder festet, og hviler på en holder. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 2
Figur 2. Tilbehør til Awake Mus Recordings. (A) Headpost. (B) Skreddersydd polstret skum rainer. Place tHan mus i mellom begge deler, med hodet utenfor. (C) Endringer i stereotaxic rammen. Den headpost holderen (øverst) bistår under headpost implantasjon og begrenser hodet under opptakene. Bittstykket (nedre bar) er kun brukt under headpost implantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Eksempel på opptak i Awake Mouse. (A) Frekvensrespons område av et neuron fra mus IC. (B) Kurver av piggene er tatt opp fra denne neuron. (C, D) Dot raster og peristumulus-tid histogram tatt opp fra denne nervecellen ved hjelp av en underlig paradigme for frekvensene indikert ved prikkene i (A). Tegnes opp på nytt fra datapublisert i Duque og Malmierca 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Effekt av blokaden av GABA A-reseptorer på Spectral og timelige responsegenskaper. (A) Frekvensrespons område av de fire IC registrert nevroner før og under microiontophoretic injeksjon av gabazine. De sorte kors i (A) viser frekvensene valgt å bli presentert som sjeldne og repeterende lyder. (B) Akkumulert peri-stimulans tid histogrammer av det nevrale svar på alle frekvensene og intensiteter presenteres å konstruere responsen området før og under injeksjon av gabazine. De svarte linjene viser lyden varighet.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Effekt av blokaden av GABA A-reseptorer på Response til Gjentatte og sjeldne Lyder. (A, B) Dot rastere av spiking reaksjon på et par av frekvenser som er presentert som sjelden (rød, 10%) og repeterende stimulus (blå, 90%) før og under påføringen av gabazine. Hver frekvens er spilt i to sekvenser slik at hver og en ble presentert som sjeldne- og repeterende. Den skraverte bakgrunn indikerer varigheten av stimulus. (C). Single-neuron svar på sju par frekvenser presentert som den sjeldne og som repeterende lyden før og under påføring av gabazine. (D) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den microiontophoresis av neuroaktive stoffer i våken dyr er en kraftfull teknikk for å undersøke og dissekere rollen av spesifikke synaptiske innganger på aktiviteten til enkeltnerveceller 40,41. Enda viktigere, gjør denne prosedyren fastsettelse av virkningen av nevrotransmittere og nevromodulatorer på nevrale kretser uten eventuelle forstyrrelser av bedøvelse. Her viser vi at anvendelsen av gabazine i IC av våken mus robust endret frekvens tuning (figur 4A), tidsmessige reaksjonsmønstrene (figur 4B) og SSA (figur 5).

Den største begrensningen av den beskrevne fremgangsmåte er den forholdsvis korte opptakstiden (~ 3 timer), som bestemmes av nivået av tilvenning til dyret som innspillingen. På den annen side, kan flere innspillingen utføres på det samme dyret. Bruke microiontophoresis det er uklart hvor langtde anvendte neuroaktive stoffer diffunderer inn i omkringliggende vev. Derfor kan en mulig effekt på neuronal nettverksaktivitet bli utløst ved å påvirke ikke bare registrert nervecellen, men også de omkringliggende gliaceller og nerveceller. For eksempel, Candy og kolleger 42 har vist at visse iontoforetisk levert molekyler, som ikke hurtig fjernes, kan diffundere opp til 600 um. I mus IC dette området ville dekke mesteparten av omfanget av de dendrittiske arbors men også påvirker nerveaktivitet fra tilstøtende celler. Oppsummert medikamentet frigjøres ved iontoforese er ikke så romlig begrenset som intracellulære medikament dialyse, noe som gjør det mulig for disseksjon i finere detaljer av de synaptiske innganger til mål-neuron og test av lokale nettverk prosesser 16,43, er det mer spesifikk enn andre eksperimentelle fremgangsmåter som brukes til å manipulere nivået av neurotransmisjon eller neuromodulation, slik som systemiske injeksjoner, bruk av optogenetic teknikker, eller trykk-pull dialyse.

Tuppen diameter av glass pipetter og størrelsen av de oppbevaring og injeksjons strømmene er viktige faktorer for å overvåke for å unngå ikke-spesifikk medikamentlekkasje inn i vevet. De lave injeksjonsstrømmer (av størrelsesorden flere titalls nA) begrense spredning av medikamentet slik at opptak av neuroner i nærheten av hverandre. For eksempel, tre av de fire nevroner som brukes som eksempler (nevroner 1 - 3) ble registrert langs samme spor med avstander på 16 og 800 mikrometer mellom dem. Til tross for den korte avstand på 16 mikrometer mellom neuron 1 og 2, ble en tydelig forskjellig respons på neuron to observert (figur 4).

Noen alternativer til den foreslåtte piggy-back konfigurasjon har blitt brukt tidligere. En av dem består av bruk av en av de multibarrel pipetter for opptak, i stedet for en separat elektrode. Selv om konstruksjonen av de ensemblene er mindre komplisert i dette tilfellet, er det ulemper. First, alle kanalene vil ha samme åpningsdiameter på spissen, som kanskje ikke være optimalt for både opptak og levering av legemidler. Også den utstikkende elektrodespissen i den piggy-back konfigurasjon hindrer ødeleggelse av målcellen sannsynligvis forårsaket av den bredere enden av multibarrel. Den andre vanlig alternativ er bruk av enkelt-fat glass pipetter for opptak 15,44 istedenfor wolframelektroder. Glass elektroder er enkle å produsere etter ønskede mål, men har en tendens til å tette under lange opptak eller på reise dypt inn i hjernen, så i vår erfaring wolfram elektroder gi mer pålitelige opptak. Videre, ved hjelp av wolfram-elektroder er det mulig å fremstille elektrolytisk lesjon for å lokalisere opptaks områder, uten at ytterligere utstrakte histologiske prosedyrer som kreves når en neural sporstoffinjeksjons brukes 45. Bruken av multibarrel glasspipetter tillater frigjøring av flere agonister og / eller antagonister meget nær opptaksområdet, som er en enorm fordel når samspillet mellom nervesystemer på sensorisk prosessering er under studien.

Prosedyrene er beskrevet i denne protokoll for produksjon av piggy-back elektroder gjør det mulig å produsere opptak elektroder i henhold til de spesifikke kravene til eksperimentet og av egenskapene til målområdet av interesse på en systematisk, men likevel tilpasset måte. I tillegg er materialet for det headpost fiksering som vanligvis anvendes i tannpleien, slik at de er lett tilgjengelige. Dermed blir kritiske trinn i protokollen er dyret tilvenning og etsning av wolfram elektroder, som er de viktigste faktorene som bidrar til godt isolerte nevroner og stabile elektrofysiologiske opptak. Totalt sett er denne teknikken relativt enkel, økonomisk og svært pålitelig som et middel for å studere rollen av flere neuroaktive stoffer på singel eller multi-unit neuronal aktivitet i våken, hodebehersket mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble finansiert av MINECO gir BFU201343608-P og PSI2013-49348-EXP, og JCYL tilskuddet SA343U14 til MSM og MRC grunnfinansiering ARP. YAA holdt en CONACyT (216 106) og en september fellesskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire Harvard Apparatus LTD 33-0099 0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary  Harvard Apparatus LTD 30-0053 Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries  World Precision Instruments 5B120F-4  5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus DiaDent 2001-2101 Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond GC Corporation 2277 Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma Heraeus Kulzer 66000087 Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal Ceys 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket Cibertec RTC1
Stereotactic frame Narishige SR-6N Modified for mice
Microiontophoretic device Harvard Apparatus LTD Neurophore BH-2 Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller Narishige Model PE-21
LED lamp Technoflux CV-215 5 W, 430-485 nm
MicroFil World Precision Instruments MF34G-5 Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene Merial Ketamine, 100 mg/mL
Rompun Bayer Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531 Sigma S106 Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
  2. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  3. Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
  4. Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
  5. Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
  6. Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
  7. Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
  8. Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
  9. Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
  10. Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
  11. Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
  12. Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
  13. Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
  14. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
  15. Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
  16. Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
  17. Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
  18. Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
  19. Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
  20. Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
  21. Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
  22. Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
  23. Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
  24. von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
  25. Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
  26. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
  27. Merrill, E. G., Ainsworth, A. Glass-coated platinum-plated tungsten microelectrodes. Med Biol Eng. 10 (5), 662-672 (1972).
  28. Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
  29. Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
  30. Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
  31. Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
  32. Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
  33. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
  34. Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
  35. Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
  36. Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
  37. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
  38. Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
  39. Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
  40. Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
  41. Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
  42. Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
  43. Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
  44. LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
  45. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).

Tags

Neuroscience auditiv stimulus-spesifikk tilpasning dårligere colliculus gabazine hemming frekvensrespons område multibarrels wolfram elektrode synaptiske innganger
Ekstracellulære opptak av neuronal aktivitet kombinert med Microiontophoretic Bruk av neuroaktive stoffer i Awake Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayala, Y. A.,… More

Ayala, Y. A., Pérez-González, D., Duque, D., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice. J. Vis. Exp. (111), e53914, doi:10.3791/53914 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter